石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科(石河子 832000)

王江平 丁國富 王勤章▲ 李令勛 倪 釗 李應(yīng)龍 王新敏 謝順明 錢 彪 王文曉

近年來研究提示膀胱中 Cajal樣細(xì)胞和逼尿肌的興奮性和收縮活動密切相關(guān),在膀胱動力紊亂性疾病中的作用也逐漸引起人們的關(guān)注。建立一種膀胱 Cajal樣細(xì)胞缺失的模型,能更好地探討 Cajal樣細(xì)胞在正常膀胱及膀胱動力紊亂性疾病中的作用,并將為下一步研究治療方法打下基礎(chǔ)。持續(xù)的 c-kit信號刺激對于胃腸道 Cajal細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)育及表型維持至關(guān)重要,通過體內(nèi)阻斷 c-kit信號途徑可以建立胃腸道 ICC細(xì)胞缺失動物模型,膀胱中 Cajal樣細(xì)胞表面也像胃腸道Cajal細(xì)胞一樣表達(dá)特異性標(biāo)記物-c-kit受體。所以,本實驗擬參照胃腸道實驗方法通過體內(nèi)阻斷 c-kit信號途徑來建立豚鼠 Cajal樣細(xì)胞缺失模型。

材料與方法

1 動物模型的建立 動物模型建立與分組:選取新生豚鼠 20只,隨機(jī)分成實驗組、對照組。實驗組將出生 24h內(nèi)的豚鼠腹腔內(nèi)隔天注射 c-kit抗體(ACK2)100 μ g,共 5次,對照組腹腔內(nèi)注射生理鹽水,于第 10天手術(shù)取膀胱進(jìn)行實驗。

2 冰凍切片的制作 手術(shù)取出膀胱,切取膀胱全層組織,OCT包埋,-80℃預(yù)冷 30 min,用恒冷冰凍切片機(jī)切 20 μ m厚度切片,粘于多聚賴氨酸處理的載玻片上,涼干后,丙酮固定 10min。

3 免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡觀察 每只豚鼠取一張切片,冰凍切片加 1%胎牛血清室溫孵育 30min,再加入一抗 (小鼠抗大鼠 CD117,1∶100,500 μ g/ml,Millipore公司 )室溫下濕盒內(nèi)孵育 1h,取出切片置于 4℃孵育過夜后再加入二抗(FITC標(biāo)記山羊抗大鼠 1∶25),置于 37℃濕盒內(nèi)避光孵育 60min。以上各步間均以 0.01mol/L PBS漂洗 5min× 2次。拭凈后甘油封片,每張切片在 LSCM(ZEISS LSM 510 MET A)下隨機(jī)取 5個視野,測定 Cajal樣細(xì)胞胞體和和突起所占面積的百分比,取其平均值進(jìn)行統(tǒng)計。

觀察 c-kit陽性細(xì)胞 LSCM技術(shù)參數(shù):針孔1000 μ m,X軸點掃描點數(shù) 250,Y軸掃描點數(shù) 250,掃描步徑 1 μ m,鏡掃描速度 1mm/s,2次平均,物鏡 40倍,長通 505激光透過,檢測器波長 488nm,靈敏度19.8%。

結(jié) 果

兩組可見雙極 Cajal樣細(xì)胞形態(tài)基本一致,呈梭形雙極細(xì)胞,表現(xiàn)為以胞體為中心的向相反方向延伸的兩個長突起和許多小突起,胞膜著色而胞漿和胞核不被染色,主要分布于逼尿肌肌束邊緣和逼尿肌肌束中。對照組:①Cajal樣細(xì)胞數(shù)量多(見圖 1);②許多相鄰兩個 Cajal樣細(xì)胞緊密連結(jié),形成 Cajal樣細(xì)胞二聚體。實驗組:①Cajal樣細(xì)胞數(shù)量明顯減少(見圖 2),3例未發(fā)現(xiàn) Cajal樣細(xì)胞;②視野下未見 Cajal樣細(xì)胞二聚體(見附表 )。

附表 腹腔注射 ACK210d后兩組豚鼠 c-kit陽性細(xì)胞率檢測結(jié)果

附表 腹腔注射 ACK210d后兩組豚鼠 c-kit陽性細(xì)胞率檢測結(jié)果

注:*與對照組比較,P＜0.01

項 目 對照組 實驗組c-kit陽性細(xì)胞 率 2.37± 0.42 0.47± 0.17*c-kit陽性細(xì)胞二聚體 0.62± 0.11 0.00±0.00*

圖1 對照組 Cajal樣細(xì)胞分布

圖2 實驗組 Cajal樣細(xì)胞分布

討 論

目前研究表明膀胱中 Cajal樣細(xì)胞在膀胱中可能扮演起搏細(xì)胞和傳導(dǎo)、調(diào)節(jié)神經(jīng)肌肉信號的功能,在膀胱動力紊亂性疾病中的作用也逐漸引起人們的關(guān)注。在巨膀胱-小結(jié)腸-腸蠕動遲緩綜合征患者的膀胱中Cajal樣細(xì)胞明顯減少,豚鼠糖尿病膀胱模型中 Cajal樣細(xì)胞明顯減少,提示膀胱 Cajal樣細(xì)胞的缺乏,可能影響了膀胱中平滑肌細(xì)胞間的信息傳遞、神經(jīng)傳遞及自發(fā)性電活動的產(chǎn)生。所以,有必要建立一種膀胱Cajal樣細(xì)胞缺失動物模型來進(jìn)一步探討膀胱 Cajal樣細(xì)胞的生理功能以及在膀胱動力紊亂性疾病中可能的作用,并將為下一步研究治療方法打下基礎(chǔ)。

在胃腸管 Cajal細(xì)胞能特異性表達(dá) c-kit受體,并且 c-kit信號途徑對于 Cajal細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)育具有重要作用,持續(xù)的 c-kit信號刺激是小鼠胃腸管 Cajal細(xì)胞形成和維持所必須的[1]。 ACK2為 c-kit的單克隆中和抗體,其具有特異地拮抗 c-kit的作用。 Torihashi等[2]給新出生的小鼠腹腔注射 ACK2,發(fā)現(xiàn)阻滯 c-kit信號后,Cajal細(xì)胞失去正常表型而呈現(xiàn)出部分類似平滑肌細(xì)胞樣表型,并導(dǎo)致小鼠腸管正常位相收縮紊亂、慢波活動消失。膀胱中 Cajal樣細(xì)胞表面也像胃腸管Cajal細(xì)胞一樣表達(dá)特異性標(biāo)記物---c-kit受體,本實驗參照 Torihashi等[2]的方法,通過腹腔內(nèi)注射 ACK2來阻滯 c-kit信號,以期像胃腸管實驗?zāi)菢咏㈦嗍蟀螂?Cajal樣細(xì)胞缺失模型。免疫熒光染色及激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)正常豚鼠 10d幼鼠膀胱中可見 Cajal樣細(xì)胞并呈網(wǎng)絡(luò)狀分布,許多相鄰兩個 Cajal樣細(xì)胞緊密連結(jié),形成 Cajal樣細(xì)胞二聚體。在經(jīng) ACK2處理的實驗組中發(fā)現(xiàn) Cajal樣細(xì)胞數(shù)量明顯減少甚至消失,視野中未見 Cajal樣細(xì)胞二聚體。以上證明像胃腸管一樣,在豚鼠逼尿肌中 Cajal樣細(xì)胞表達(dá)的 c-kit受體所介導(dǎo)的信號通路對于 Cajal樣細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)育具有重要作用,持續(xù)的 c-kit信號刺激是豚鼠逼尿肌 Cajal樣細(xì)胞形成和表型維持所必須的,通過阻斷 c-kit通路影響 Cajal樣細(xì)胞的發(fā)生、發(fā)育以及表型的維持可以成功建立豚鼠逼尿肌 Cajal樣細(xì)胞缺失模型。

[1] Ward SM,Sanders KM.Physiology and pathophysiology of the interstitial cell of Cajal:from bench to bedside I.Functional development and plasticity of interstitial cells of Cajal networks. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2001,281(3):602-611.

[2] Torihashi S,Nishi K,Tokutomi Y,et al.Blockade of kit signaling induces transdifferentiation of interstitial cells of cajal to a smooth muscle phenotype.Gastroenterology,1999,117(1):140-148.