鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所(十堰 442000)

劉春風(fēng) 陳亮華*# 楊 偉*# 唐俊明*▲ 楊建業(yè) 王家寧 孔 霞 郭凌鄖 鄭 飛 黃永章

研究已發(fā)現(xiàn),骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cell,BM-M SC)在一定條件下可以分化為心肌、成骨、軟骨、脂肪、胰島、肌腱、內(nèi)皮等多種類型的細(xì)胞,因此在組織損傷修復(fù)中起著非常重要作用[1]。近來(lái),研究發(fā)現(xiàn)將 VEGF注入損傷的部位,引起了內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)的遷移引起血管新生、恢復(fù)了血供,作者推測(cè)與 EPC表達(dá)VEGF受體有關(guān)[2]。而我們前期發(fā)現(xiàn),VEGF可以促進(jìn)MSC向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化[1]。最近研究證實(shí) VEGF可以引起 MSC的遷移[3]。不同的實(shí)驗(yàn)室報(bào)道 MSC表達(dá)VEGFR差異很大[4]。因此,有必要系統(tǒng)的觀察 M SC成血管因子受體表達(dá)特征。

材料與方法

1 動(dòng)物與材料 SPF級(jí) SD大鼠 5只,質(zhì)量 230±20g,由鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。動(dòng)物在屏障系統(tǒng)環(huán)境下,用專用的飼料(購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)和滅菌水分籠飼養(yǎng)。 DMEM培養(yǎng)基(Gibcol/BRL,美國(guó)),胎牛血清(杭州四季清),胰酶 (Trypsin,Sangon),CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Scientific),倒置熒光顯微鏡(Nikon),圖像分析系統(tǒng)(Image pro plus 5.02,Media Cybernetics);4,6-聯(lián) 脒-2-苯 基 吲 哚 (4,6-diamidino-2-phenyl-indoledi-acetate,DAPI,sigma);rhEPO(沈 陽(yáng) 三 生 );CD29、 CD90、 CD45和 CD34(Santacruz Biotech);地塞米松、β-磷酸甘油、維生素C、胰島素 (Sigma);VEGF(UPSTAT E);Tanswell(Millipore)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MSC的培養(yǎng)[1]采用全骨髓法。取 230±20g SD大鼠,腹腔注射肝素 5000IU,15 min后斷頸處死,收集雙側(cè)脛股骨中全骨髓。按細(xì)胞密度為 1×107/ml接種于 75cm2培養(yǎng)瓶,24h后半量換液。以后 2～ 3d半量換液 1次,12～ 14d后細(xì)胞密度達(dá) 80%～90%,用含0.25%Trypsin(含 1mM,EDTA)消化后 1∶3傳代,記為 P1代 M SCs(P1MSCs)。隨后按上述方法傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)的 P3代 MSC(P3MSCs)中加入終濃度為 50 μ g/ml的 DAPI溫育 1h,熒光顯微鏡下觀察其 DAPI標(biāo)記的效率為 100%[1]。消化收集 P3代的 MSC(P3-MSC),制成 1×106/ml細(xì)胞懸液,以備遷移實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)條件:含 15%的胎牛血清以及 100IU/ml青霉素、100 μ g/ml鏈霉素 DMEM培養(yǎng)基 ,37°C,5% 的 CO2飽和濕度。

2.2 MSCs的鑒定

2.2.1 成脂肪誘導(dǎo) P3MSCs培養(yǎng)至 90%融合后 6孔板加入成脂肪誘導(dǎo)液(10 μ g/ml胰島素),每72h換液。油紅 O染色鑒定脂肪細(xì)胞。

2.2.2 成骨誘導(dǎo) P3-MSC培養(yǎng)至 90%融合后6孔板加入成骨誘導(dǎo)液(15%FBS-DMEM,含地塞米松 4× 10-6mg/ml、β-磷酸甘油 1 mg/ml、維生素 C 0.5 mg/ml),每 72小時(shí)換液 ,誘導(dǎo)兩周。 Von Kossa’s染色鑒定礦化結(jié)節(jié)。

2.2.3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定 MSCs表面標(biāo)記特征用 1ml注射器將 MSC(密度為 107/ml)吹打混勻后,取600 μ l(至少含有 2× 106個(gè)細(xì)胞 ),等分為 4份 ,分別加入 4個(gè) Eppendorf管中,a管為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照,加入 8μ l山羊 IgG1-FITC;b管加入 4μ l CD34mAB(一抗);c管加入 4 μl CD45mAB(一抗);d管加入 4μ l CD90mAB(一抗);e管加入 4μ l CD29mAB(一抗 ),4℃下避光孵育40 min,洗滌液離心(1000r/min 5min),用 PBS洗 1～2次。在 b、c、d、e管中加入 8μ l山羊 IgG1-FITC(熒光二抗),4℃下避光孵育 20 min。洗滌液洗 2次。加入固定液 1ml,細(xì)胞儀(Beckman Coulter)檢測(cè)表面標(biāo)志,應(yīng)用 Cotfit軟件分析結(jié)果。

2.3 RT-PCR分析 取 P1-P17MSC,按抽提RNA試劑盒說(shuō)明書(shū)酚氯仿提取 RNA,測(cè)量并計(jì)算出RNA濃度與純度,-70℃保存。隨后按試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA第一鏈。最后擴(kuò)增目的基因片段:VEGFR1(568bp)正義鏈:5'-AAC AAC AGG ACC ATG CAC-3’;反義鏈:5'-GCT TCA GTT TTC GGA TGA-3’;VEGFR2(535bp)正 義 鏈:5'-CCA ATG AAG GGG AAC TG-3’,反義鏈:5'-TGA CTG CTG GTG ATG CT-3’;PDGFR-α(164bp)正義鏈:5'-TCTCGGCATGACGGATTCT T-3',反義鏈:5'-CCACACTGAAGGT TCCGTTGA-3'; PDGFR-β(149)正義鏈:5'-GATTCCAT GCCGAGTGACAGA-3',反義鏈:5'-TCCCCAATGGTGGT TT T GC-3';NRP-1 (383bp) 正 義 鏈: 5’-GGCTGCCGT TGCTGTGCGCCA-3’,反義鏈:5'-ATAGCGGATGGAAAACCC TGC-3’;GAPDH( 623bp ) 正 義 鏈: 5 ’CCAAAAGGGTCATCATCTCC’3,反 義 鏈:5’GT AGGCCATGAGGTCCACCAC’3。反應(yīng)條件如下:95℃ 4min 94℃ 45sec,58℃ 40sec,72℃ 40sec,30個(gè)循環(huán)。 2%瓊脂糖電泳,數(shù)碼成像。

2.4 體外遷移實(shí)驗(yàn) 利用 Tanswell體外遷移體系[5],濾膜為微孔聚碳酸酯膜(直徑為 13mm,孔徑為8 μ m),池內(nèi)體系為 200 μ l 15%FBS的 DMEM培養(yǎng)基 ,其中含 P3-MSC 1× 105/ml。 池外體系為 400 μl 15%FBS的 DMEM培養(yǎng)基,其中分別含有 0.1ng/ml,1 ng/ml,5 ng/ml,10 ng/ml,20 ng/ml等不同濃度的VEGF,置于培養(yǎng)箱中 8h。取出 Tanswell,PBS洗 3次,4%多聚甲醛固定 15min,擦去上膜貼壁細(xì)胞,PBS洗 3次,加入終濃度為 50 μ g/ml的 DAPI溫育 10min,PBS洗 3次,熒光顯微鏡下觀察下膜細(xì)胞數(shù)。最后每孔顯微鏡鏡下隨機(jī) 5個(gè)視野,數(shù)碼成像,轉(zhuǎn)入 Image pro plus 5.02分析系統(tǒng)計(jì)算濾膜表面 MSC細(xì)胞數(shù)。遷移指數(shù)(migration index)=處理組遷移細(xì)胞數(shù) /對(duì)照組遷移細(xì)胞數(shù)。

2.5 MT T增殖實(shí)驗(yàn) 消化收集 P3代的 M SC(P3MSC),制成 1×105/ml細(xì)胞懸液,接種于 96孔培養(yǎng)板中,24h換液使用 2%FBS-DMEM培養(yǎng)基同步化24h,隨后加入 20 ng/ml的 VEGF,培養(yǎng) 12h、36h、72h;棄上清,加入終濃度為 5mg/ml的 M TT,繼續(xù)培養(yǎng) 4h,終止培養(yǎng)、棄上清加入 200 μl的 DMSO,震蕩混勻后,492nm波長(zhǎng)檢測(cè)每孔 OD值。細(xì)胞培養(yǎng)條件:含150 ml/l的胎牛血清以及 1×105/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和 0.25 mg/L兩性霉素 B的 DM EM培養(yǎng)基,37°C,5%的 CO2飽和濕度。

結(jié) 果

1 MSC的培養(yǎng) 由于造血干細(xì)胞不貼壁生長(zhǎng),經(jīng)過(guò)數(shù)次換液,懸浮的造血干細(xì)胞逐漸被清除。貼壁細(xì)胞經(jīng) 3次傳代后,P3M SCs形態(tài)均一、成纖維細(xì)胞樣生長(zhǎng)。

2 MSCs的鑒定

2.1 成脂、成骨誘導(dǎo) P3M SCs兩周后,油紅 O染色、Von-Kossa’s染色均呈陽(yáng)性反應(yīng),本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的P3MSCs具有成骨成脂肪等多向分化潛能(見(jiàn)圖 1)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)分析培養(yǎng)的 P3MSCs免疫表型,結(jié)果表明 MSCs表達(dá) CD34、CD45;高表達(dá) CD90(96%)、CD29(95%),符合公認(rèn)的 MSCs的免疫表型。

3 PDGFR的表達(dá)情況 免疫組化和 RT-PCR顯示:P1-P17MSCs不表達(dá) VEGFR,但是高表達(dá)PDGFR-β和 NRP1,弱表達(dá) PDGFR-α(見(jiàn)圖 2)。

4 VEGF對(duì) MSCs遷移的影響 0.1ng/ml,1 ng/ml,10 ng/ml,20 ng/ml,50 ng/ml等不同濃度的 VEGF刺激后下膜的細(xì)胞數(shù)明顯較對(duì)照組增多,對(duì)MSCs遷移的影響呈現(xiàn)濃度依賴性,其中 VEGF在 20 ng/ml時(shí) MSC遷移到濾膜上的細(xì)胞數(shù)接近于峰值(見(jiàn)圖3)。

5 VEGF對(duì) MSC增殖的影響 在 20 ng/ml VEGF刺激下、不同時(shí)間點(diǎn),VEGF對(duì) MSC的促增殖效應(yīng)逐漸增強(qiáng),其中含 72h時(shí),VEGF的促增殖效應(yīng)處于峰值(見(jiàn)圖 4)。

圖1 MSCs的鑒定 A:成骨誘導(dǎo) P3M SCs,Von-Kossa’s染色呈陽(yáng)性反應(yīng)(×200);B:成脂誘導(dǎo) P3M SCs,油紅 O染色呈陽(yáng)性反應(yīng)(×200)

圖2 MSCs的 PDGFR等受體的表達(dá)

圖3 V EGF促進(jìn)了 M SC的遷移

圖4 V EGF促進(jìn)了 M SC的增殖

討 論

MSC因其多項(xiàng)分化潛能,免疫原性低,取材方便,不存在倫理道德問(wèn)題而備受關(guān)注。在再生醫(yī)學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),MSC主要通過(guò)兩種機(jī)制修復(fù)受損的組織和器官,一方面 MSC通過(guò)分泌大量的生物活性因子如VEGF、HGF、SDF-1等在組織損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[6];另一方面 MSC通過(guò)分化為目的組織細(xì)胞而修復(fù)損傷的組織器官。前者提示移植到損傷組織部位的 MSC通過(guò)其保護(hù)營(yíng)養(yǎng)作用而修復(fù)受損的組織器官;后者提示 MSC可能受到損傷組織環(huán)境的影響而發(fā)生命運(yùn)的轉(zhuǎn)變[7]。譬如組織損傷后釋放出來(lái)的細(xì)胞因子在其中發(fā)揮了重要的作用。大多數(shù)細(xì)胞因子主要通過(guò)受體 /配體系統(tǒng)而發(fā)揮其生物學(xué)作用[8]。由于MSC在損傷組織的血管新生過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。因此本研究主要關(guān)注 MSC成血管因子受體表達(dá)特征。

近來(lái),許多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn) VEGF不僅促進(jìn)了MSC的增值,而還促進(jìn)了 MSC的遷移[3]。更為重要的是 VEGF促進(jìn)了 MSC向血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化[1,9,10]。但是關(guān)于 MSC是否表達(dá) VEGFR,不同的實(shí)驗(yàn)室報(bào)道不一致,譬如有研究報(bào)道 M APCs(骨髓多能成體干細(xì)胞)表達(dá) VEGFR[9,10],也有研究研究報(bào)道 M SC表達(dá)VEGFR[11～13],但是有研究報(bào)道不表達(dá) VEGFR[3,4]。我們推測(cè)這些差異的主要原因?yàn)?①是培養(yǎng) MSC的方法不一樣;②MSC種屬的差異;③MSC來(lái)源的差異,如是來(lái)自骨髓還是脂肪或其他來(lái)源;④檢測(cè)方法的不同。

本研究采用最經(jīng)典的也是大多數(shù)學(xué)者所采用的方法培養(yǎng) MSC,通過(guò)成骨成脂肪誘導(dǎo)分化及其表面標(biāo)志物流式分析確認(rèn)我們所培養(yǎng)的細(xì)胞是 MSC。更重要的是我們系統(tǒng)觀察了 P1-P17MSC成血管因子受體表達(dá)的變化,我們發(fā)現(xiàn) MSC不表達(dá) VEGF受體,但是表達(dá)PDGFR-α,PDGFR-β和 NRP1。值得注意的是 ,VEGF能夠促進(jìn) M SC的增殖和遷移,那么 VEGF是如何發(fā)揮其作用的呢?有研究表明 VEGF可通過(guò)V EGFR共軛的 PDGFR發(fā)揮其作用,而且也可以通過(guò) NRP1增強(qiáng)其效應(yīng)?？梢?jiàn) VEGF在 MSC的生物學(xué)效應(yīng)很有可能是通過(guò) PDGFR/NRP1途徑而發(fā)揮的。

綜上所述,MSC成血管因子受體的表達(dá)特征提示MSC在組織損傷修復(fù)中的作用可能與其受體表達(dá)特征存在密切關(guān)系,具體的作用特征還需進(jìn)一步的研究。

[1] Tang J,Xie Q,Pan G,et al.Mesenchymal stem cells participate in angiogenesis and improve heart function in rat model of myocardial ischemia with reperfusion[J].Eur J Cardio Thoracic Surg,2006,3(2):353-361.

[2] Asahara T,Takahashi T,Masuda H,et al.V EGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells[J].EM BO J,1999,18:3964-3972.

[3] Ball SG,Shuttleworth CA,KieltyCM.Vascular endothelial growth factor can signal through plateletderived growth factor receptors[J].J Cell Biol,2007,177(3):489-500.

[4] Ball SG,Shuttleworth CA,Kielty CM.Mesenchymal stem cells and neovascularization: roleofplateletderived growth factor receptors[J].J Cell Mol Med,2007,11(5):1012-1030.

[5] 王新均,唐俊明,孔 霞,等.不同檢測(cè)體系對(duì) SDF-1/CXCR4介導(dǎo)的骨髓源間充質(zhì)干細(xì)胞遷移的影響 [J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2009,38(3):262-265.

[6] Tang J,Wang J,Guo L,et al.Mesenchymal stem cells modified with stromal cell-derived factor1alpha improve cardiac remodeling via paracrine activation of hepatocyte growth factor in a rat model of myocardial infarction[J].Mol Cells,2010,29(1):9-19.

[7] Li Z,GuoJ,ChangQ,et al.Paracrine role for mesenchymal stem cells in acute myocardial infarction[J].Biol Pharm Bull,2009,32(8):1343-1346.

[8] Tang J,Wang J,Kong X,et al.Vascular endothelial growth factor promotes cardiac stem cell migration via the PI3K/Akt pathway[J].Exp Cell Res,2009,315(20):3521-3531.

[9] Liu Z,Jiang Y,Hao H,et al.Endothelial nitric oxide synthase is dynamically expressed during bone marrow stem cell differentiation into endothelial cells[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,293(3):1760-1765.

[10] Xu J,Liu X,Jiang Y,et al.M APK/ERK signalling mediates VEGF-induced bone marrow stem cell differentiation into endothelial cell[J].J Cell M ol Med,2008,12(6A):2395-2406.

[11] Liu Y,Yan X,Sun Z,et al.Flk-1+ adipose-derived mesenchymal stem cells differentiate into skeletal muscle satellite cells and ameliorate muscular dystrophy in mdx mice[J].Stem Cells Dev,2007,16(5):695-706.

[12] ShiMX, Fang BJ, Liao LM,et al.Flk1+mesenchymal stem cells ameliorate carbon tetrachlorideinduced liver fibrosis in mice[J].Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao,2005,21(3):396-401.

[13] 張秀英,李一雷,任淑萍,等.V EGF受體 flt-1和 KDR在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)及意義[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào) (醫(yī)學(xué)版),2005,31(4):487-490.