姜艷彬，王 海，侯東軍，楊紅菊，李 穎，于 雷

（中國動物疫病預防控制中心，北京 100125）

1 引 言

長期以來，對細菌的分類鑒定主要有分離培養(yǎng)、形態(tài)特征、生化反應和免疫學等傳統(tǒng)方法，這些方法存在耗時長、特異性差、敏感度低等問題，難以滿足現(xiàn)代細菌學研究的發(fā)展要求[1-5]。大量菌種的分類鑒定是一項繁瑣、費時的工作，因此迫切需要建立一種簡單、方便、易于操作的分類鑒定方法，使人們在一定程度上更加科學、精確、快速地找到微生物的分類地位，為微生物資源的開發(fā)利用奠定基礎。

隨著分子生物學技術的發(fā)展，逐漸發(fā)展了質粒圖譜、限制性片段長度多態(tài)性分析、PCR指紋圖、rRNA基因指紋圖、16S rRNA序列分析等技術[6]，這些技術主要是對細菌染色體或染色體外的DNA片段進行分析，從遺傳進化的角度和分子水平進行細菌分類鑒定，從而使細菌分類更科學、更精確[7]。

RiboPrinter系統(tǒng)是杜邦公司研發(fā)的一種全自動細菌鑒別系統(tǒng)，該系統(tǒng)建立在對核糖體DNA序列多態(tài)性分析之上[8]，可以全自動完成細菌鑒定的一系列實驗，包括細菌染色體DNA的提取、酶切、電泳、轉膜、雜交、曝光、照相、比對分析，通過檢測16S-23S-5S rDNA雜交信號而得出基因指紋特征，與數(shù)據(jù)庫比對得出鑒定結果。Riboprinter系統(tǒng)最大化避免了其他因素對實驗的影響，且短時、高效，適用于常見細菌的快速鑒定。16S rDNA序列比對分析是較為常用的細菌鑒定方法，當序列同源性大于97%時，可以認定兩株細菌屬于同一個屬，通過后續(xù)的生理生化分析可以進一步鑒定至種。

通過Riboprinter全自動核糖體RNA指紋分析系統(tǒng)，進行兩株未知細菌菌株CADC-A001和CADC-A003的鑒定，同時與16S rDNA序列分析及生理生化反應實驗進行比較。結果表明，兩種方法對未知菌種的鑒定結果一致，CADC-A001和CADCA003分別為大腸桿菌和銅綠假單胞菌。相比而言，Riboprinter系統(tǒng)在操作的簡便性、結果平行性以及檢測速度方面有著更大的便利及優(yōu)勢。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

CADC-A001和CADC-A003為瑪氏食品（中國）有限公司提供的待測菌株，其可以在LB培養(yǎng)基中37℃生長培養(yǎng)；細菌染色體DNA提取試劑盒、2×Taq PCR Mastermix、DL2000核酸分子量Marker購自天根生化科技（北京）有限公司；LB培養(yǎng)基購自北京陸橋技術有限責任公司；通用引物AD007、AD008由上海英駿生物技術有限公司合成；DNA測序由北京華大基因研究中心完成；API 20NE、API 20E細菌鑒定系統(tǒng)購自生物梅里埃中國有限公司；Riboprinter系列耗材購自杜邦Qualicon公司。

2.2 16S rDNA的克隆及序列測定

挑取CADC-A001和CADC-A003單菌落，在LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，各取5mL菌液提取染色體DNA，電泳定量后，用引物AD007和AD008進行PCR 擴增，擴增體系50μL：上游引物 2μL（10mmol），下游引物 2 μL（10 mmol），模版 1 μL（約 50 ng），2×Taq PCR Mastermix 25μL，超純水 20μL。擴增條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；54 ℃，30 s；72℃，90 s；重復 2～4步驟，進行 29個循環(huán)；72℃，10min。

將擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳鑒定，以引物AD007和AD008進行測序。重復PCR及測序3次，以保證測序的準確性，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對。

2.3 生理生化測定

取CADC-A001單菌落，懸浮于5 mL的0.85%NaCl溶液中，加入API 20E測試板中，37℃培養(yǎng)24h后觀察；取CADC-A003單菌落，懸浮于2mL的0.85%NaCl溶液中，取200μL加入AUX培養(yǎng)基，按說明書要求依次加入API 20NE測試板中，30℃培養(yǎng)48 h后觀察，與判讀表比對獲取生理生化信息。

用一次性塑料接菌環(huán)挑取單菌落，涂布在濕潤的濾紙中央，滴加氧化酶試劑，觀察其顏色變化情況，判斷待測菌株產(chǎn)氧化酶情況。

2.4 Riboprinter菌種鑒定

用取樣棒挑取CADC-A001和CADC-A003單菌落，懸浮于200μL樣品緩沖液中，95℃處理25min，加入5 μL裂解液A和裂解液B，放置于Riboprinter樣品孔中并運行程序，選用EcoRI酶切系統(tǒng)。雜交圖譜選擇與Dupont ID數(shù)據(jù)庫進行比對，得出待測菌株信息。

3 實驗結果

3.1 CADC-A001和CADC-A003的16S rDNA序列測定

分別挑取平板中的CADC-A001和CADC-A003單菌落，以引物AD007、AD008進行菌落PCR擴增，在1%的瓊脂糖凝膠中電泳鑒定，如圖1所示。從圖中可以看出，擴增產(chǎn)物均為單帶，約為1500bp，分別取3管不同擴增產(chǎn)物，以AD007、AD008為測序引物，進行核酸序列測定。測序結果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對，CADC-A001的16S rDNA序列與大腸桿菌SE11（NCBI Accession NC001415）、BW2965（NCBI Accession NC012759）、UMN026（NCBI Accession NC011751）和 55989（NCBI Accession NC011748）的16S rDNA序列同源性均達到了99%以上，可以推斷其屬于埃希氏菌屬；CADC-A003的16S rDNA序列與銅綠假單胞菌 LESB58（NCBI Accession NC011770）、PA7（NCBI Accession NC009656）、UCBPP-PA14（NCBI Accession NC008463）、PAO1 （NCBI Accession NC002516）的16S rDNA序列同源性也達到了99%以上，推斷其屬于假單胞菌屬。

圖1 CADC-A001、CADC-A003 的 16S rDNA PCR擴增電泳圖

3.2 生理生化測定

根據(jù)CADC-A001和CADC-A003 16S rDNA測序結果的推斷，CADC-A001選用適用腸桿菌的API 20E試劑盒進行各項生理生化指標的測定，在37℃溫箱中培養(yǎng)24 h，其結果如表1所示。通過APIWEB軟件比對，CADC-A001為一株大腸桿菌，結果可信度為99.5%。CADC-A003選用適用假單胞菌屬的API 20NE試劑盒進行各項生理生化指標的測定，在30℃溫箱中培養(yǎng)48h后觀察，其結果如表2所示。通過APIWEB軟件比對，CADC-A003為一株銅綠假單胞菌，結果可信度為99.9%。

表1 菌株CADC-A001的API 20E生化試驗結果

表2 菌株CADC-A003的API 20NE生化試驗結果

3.3 Riboprinter系統(tǒng)的菌種鑒定

取CADC-A001和CADC-A003平板單菌落，懸浮于200μL緩沖液中，預熱后加入裂解液，在Riboprinter系統(tǒng)中自動運行，自動酶切后得出雜交結果如圖2所示。

該研究中，兩個待測菌株CADC-A001和CADCA003各運行了兩個樣品，CADC-A001的兩個樣品一致率達到0.98，CADC-A003的一致率達到0.95（根據(jù)測量標準，一致率達到0.90以上，則可以認為是同一個樣品），系統(tǒng)有著很好的重復性。

圖3（a）為待測菌株CADC-A001和CADC-A003的Riboprinter測定結果。CADC-A001和CADC-A003的雜交圖譜顯示在RiboprintTMPattern欄中，與Dupont自有數(shù)據(jù)庫比對得出，CADC-A001的兩個平行樣品與數(shù)據(jù)庫中DUP-14009最為接近，其相似度（Dupont ID Similarity） 分別為 0.94和 0.96，DUP-14009為大腸桿菌（Dupont ID Label中），進一步查閱數(shù)據(jù)庫，DUP-14009為大腸桿菌ATCC-13762。CADC-A003的兩個平行樣品與Dupont數(shù)據(jù)庫中DUP-11068最為接近，相似度分別為0.95和0.97，DUP-11068為銅綠假單胞菌ATCC-15442?？梢酝茢噙@兩株菌分別為大腸桿菌和銅綠假單胞菌，而且極可能為大腸桿菌ATCC-13762和銅綠假單胞菌ATCC-15442（相似度大于 0.90）。

圖2 CADC-A001和CADC-003的Riboprinter雜交圖譜

圖3

圖3（b）是Dupont數(shù)據(jù)庫中與CADC-A001相似度較高的幾個菌株，均為大腸桿菌，該研究僅使用Dupont數(shù)據(jù)庫進行了比對，也可以根據(jù)自有的數(shù)據(jù)庫進行比對，隨著數(shù)據(jù)庫的不斷豐富，將有利于菌種的進一步分型、溯源。

4 討 論

該研究通過Riboprinter全自動菌種鑒定系統(tǒng)分別對兩株送測樣品CADC-A001、CADC-A003進行了鑒定，并采用16S rDNA序列測定結合生理生化實驗進行了對照實驗，兩種檢測方法得出相同結論，CADC-A001為一株大腸桿菌，CADC-A003為一株銅綠假單胞菌。Riboprinter進一步分類表明，CADCA001可能為大腸桿菌ATCC13762，CADC-A003可能為銅綠假單胞菌ATCC15442。

Riboprinter是以DNA指紋為基礎的全自動菌種鑒定系統(tǒng)，其通過16S-23S-5S rDNA探針與待測菌株酶切后染色體DNA的雜交圖譜，與數(shù)據(jù)庫比對進行菌種鑒定，使大量細菌鑒定步驟獲得同步化、標準化，排除了人工操作差異的干擾。相比其他鑒定方法，其優(yōu)勢在于：（1）在整個菌種鑒定過程中，除了取平皿單菌落等最初環(huán)節(jié)，其他鑒定過程真正達到完全自動化。Riboprinter系統(tǒng)不僅自動提取待測菌株的染色體DNA、完成酶切，還自動進行核酸電泳上樣，并轉到膜上，自動分子雜交、顯色、拍照、運算處理，通過自動比對直接得出待測菌株的種名。（2）鑒定速度快。經(jīng)過8h即可以完成待測樣品的檢測，一臺機器每天可以完成32個樣品的檢測。（3）有效地將菌種信息量化，而且可以在鑒定到種的基礎上進一步分類，非常適合于菌株的分型及溯源分析[9-10]。

Riboprinter系統(tǒng)也存在一些弊端，主要表現(xiàn)在：（1）只適合于細菌的分類鑒定，且數(shù)據(jù)庫還有待完善。Riboprinter數(shù)據(jù)庫目前涵蓋6900余種菌種的雜交圖譜，數(shù)據(jù)庫較為全面，其對常見細菌（尤其是食源性致病菌）的檢測非常準確，但數(shù)據(jù)庫還有待進一步的豐富。（2）檢測的成本相對較高，且每次檢測必須同時運行8個樣品。

5 結束語

該文通過兩種快速檢測方法進行了兩株未知細菌菌株的鑒定，16S rDNA序列測定結合生理生化實驗和Riboprinter全自動菌種鑒定系統(tǒng)均得出了正確的鑒定結果。前者可以在3 d內得到檢測結果，而Riboprinter系統(tǒng)則更為快捷，可以在8h內進行未知菌株的鑒定，且操作簡單，重復性好，最大限度減少了操作方面的誤差，有很大的應用價值。

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