謝艷華 賀中民 楊 倩 王四旺 第四軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系藥物研究所(西安 710032)

α-亞麻酸作為人體必需的不飽和脂肪酸,具有重要生理活性。國際醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)界的大量基礎(chǔ)研究、流行病學(xué)調(diào)查、動物試驗及臨床觀察表明,α-亞麻酸具有以下多方面的生理功效,即預(yù)防心腦血管病、抑制癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移、抑制過敏反應(yīng)和抗炎作用、抑制衰老、增強智力和保護視力等功能[1]。所以,α-亞麻酸是重要的生物營養(yǎng)原料。本實驗擬研究椒目中提取的高純度α-亞麻酸的一般藥理作用,在神經(jīng)系統(tǒng),呼吸系統(tǒng),心血管系統(tǒng)實驗方面加以探討,為進(jìn)一步開發(fā)利用α-亞麻酸資源及開發(fā)新藥提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 實驗材料 1.1 藥品 α-亞麻酸,由第四軍醫(yī)大學(xué)藥物研究所從椒目中提取,含量≥90%,批號20081206;臨用前用食用調(diào)和油配成不同濃度備用。

1.2 陽性對照藥 安定片,批號:20080401,規(guī)格:2.5mg/片,山東平原制藥廠生產(chǎn),批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字 H37023039;鹽酸氯丙嗪注射液,批號:20080301,規(guī)格:2mL:50mg,上海禾豐制藥有限公司,批準(zhǔn)文號:國藥準(zhǔn)字 H31021061。

1.3 試劑 戊巴比妥鈉,國藥集團化學(xué)試劑有限公司,批號 WS20060401;肝素鈉,批號:20070429,北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司;鈉石灰,批號:20071229,上海五四化學(xué)試劑有限公司。

1.4 儀器 IVC(獨立換氣籠盒 )飼養(yǎng)系統(tǒng)(上海紹豐實驗動物設(shè)備有限公司);RM-6280型智能八道生理記錄及分析處理系統(tǒng)(成都儀器廠);JZ100型肌張力換能器(量程 30g);YP100型壓力換能器(量程40kpa);曠野箱為自制,55cm×40cm×30cm(長寬高 )無蓋木箱,底部劃分 20等格;DT-2000型電子天平(常熟市衡器廠)。

1.5 動物 BALB/c小鼠,雌雄各半,18～22g,6周齡;SD大鼠,雌雄各半,180～220g,6周齡,均由中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供,生產(chǎn)合格證號:scxk(軍)字 第 2002-005號。

2 實驗方法和結(jié)果 2.1 自主活動

2.1.1 抖籠法[2]:小鼠 60只,體重 18～ 22g,隨機分為 5組:正常組(給予等量食用調(diào)和油 20mL/kg)、戊巴比妥鈉組(皮下注射 20mg/kg)、α-亞麻酸大劑量組(4g/kg)、中劑量組(2g/kg)、小劑量組(1g/kg)。每組 12只,雌雄各半。實驗前各組分別給食用調(diào)和油、戊巴比妥鈉、α-亞麻酸。將吊籠與張力換能器相連結(jié),再與 RM-6280型八道生理記錄分析儀聯(lián)結(jié),形成記錄分析系統(tǒng)。灌胃給藥后立即觀察小鼠的精神、行為活動,在給藥后 30min和 60min分別將小鼠置于吊籠,觀察記錄小鼠放入吊籠中 15s內(nèi)活動振動波的個數(shù),所得數(shù)據(jù)用 t檢驗做統(tǒng)計學(xué)處理[3]。結(jié)果顯示α-亞麻酸大、中、小不同劑量與正常組比較無明顯差異(見表 1)。

表1 α-亞麻酸對小鼠自發(fā)活動的影響(抖籠法)(±s)

表1 α-亞麻酸對小鼠自發(fā)活動的影響(抖籠法)(±s)

注:△P＜0.05,與正常組比較。

組 別 n 30min波數(shù) 60min波數(shù)正常組 12 24.41± 4.63 23.80± 3.74大劑量組 12 23.86± 4.30 27.10±4.09中劑量組 12 26.36± 3.75 25.49±2.89小劑量組 12 25.50± 5.60 24.72±5.39戊巴比妥鈉組 12 18.03± 4.08△ 20.10±4.90

2.1.2 曠野法[2]:小鼠 60只,體重 18～ 22g,隨機分為 5組:正常組(給予等量食用調(diào)和油 20mL/kg)、戊巴比妥鈉組(皮下注射 20mg/kg)、α-亞麻酸大劑量組、中劑量組、小劑量組。每組 12只,雌雄各半。灌胃給藥 30 min后,觀察、記錄小鼠放入曠野箱后 2 min內(nèi)在箱里活動的格數(shù)。一只小鼠四肢走到同一格內(nèi)才算走動了一格,比較對照組和給藥組組間平均活動格數(shù)。所得數(shù)據(jù)用 t檢驗做統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果顯示用α-亞麻酸大、中、小不同劑量給藥 30min后小鼠與正常組比較無明顯差異 (見表 2)。

表2 α-亞麻酸對小鼠自發(fā)活動的影響 (曠野法)(±s)

表2 α-亞麻酸對小鼠自發(fā)活動的影響 (曠野法)(±s)

注:△P＜0.05,與正常組比較。

組 別 n 30min內(nèi)格數(shù)正常組 12 50.17±20.02大劑量組 12 55.33±15.84中劑量組 12 40.25±22.36小劑量組 12 44.92±17.45戊巴比妥鈉組 12 29.25± 18.43△

2.1.3 機能協(xié)調(diào)實驗:斜板法[2]:將禁食不禁水 4h的小鼠置于與水平面呈 70°角的光滑板上,每次 0.5min,共放三次,對小鼠進(jìn)行篩選,取三次均不跌落小鼠 60只,體重 18～22g,隨機分成 5組分別為:正常組 (給予等量食用調(diào)和油 20mL/kg)、α-亞麻酸大劑量組、中劑量組、小劑量組、陽性對照組(鹽酸氯丙嗪注射液,2.5mg/kg)。每組 12只,雌雄各半。各組按體重每天灌胃給藥一次。記錄給藥一周后不同時間點連續(xù)放三次跌落兩次者為陽性,與對照組進(jìn)行比較。結(jié)果顯示給藥一周后對小鼠機能協(xié)調(diào)功能無顯著影響,而陽性對照組氯丙嗪則有顯著影響(見表 3)。

表3 α-亞麻酸對小鼠機能協(xié)調(diào)的影響(n=12)

2.1.4 鎮(zhèn)靜催眠實驗 2.1.4.1入睡率:對閾下劑量戊巴比妥鈉小鼠的催眠作用選取小鼠 60只,體重 18～ 22g,隨機分為 5組,正常組 (給予等量食用調(diào)和油 20mL/kg)、陽性對照組 (安定 ,2.5mg/kg)、α-亞麻酸大劑量組、中劑量組、小劑量組,每組 12只,雌雄各半。各組按體重灌胃給藥一次,給藥 1h后,每組小鼠注射戊巴比妥鈉 12.5mg/kg(催眠閾下劑量),觀察30min小鼠翻正反射消失達(dá) 1min以上者計為睡眠發(fā)生,計算各組睡眠發(fā)生百分率。結(jié)果(見表 4)。

表4 α-亞麻酸對閾下劑量戊巴比妥鈉小鼠的催眠作用 (%;n=12)

2.1.4.2 睡眠時間:選取小鼠 60只,體重 18～ 22g,隨機分為 5組,正常組(給予等量食用調(diào)和油 20mL/kg)、陽性對照組 (安定 ,2.5mg/kg)、α-亞麻酸大劑量組、中劑量組、小劑量組,每組 12只,雌雄各半。各組按體重灌胃給藥一次,給藥 1h后,每組小鼠給予催眠劑量戊巴比妥鈉 25mg/kg,觀察和記錄睡眠持續(xù)時間[4](翻正反射消失至恢復(fù)的時間)。結(jié)果顯示分別用α-亞麻酸大、中、小劑量給藥后小鼠與正常組比較無明顯差異 ,見表 5。

表5 α-亞麻酸對戊巴比妥鈉催眠劑量小鼠睡眠時間的影響(±s)

表5 α-亞麻酸對戊巴比妥鈉催眠劑量小鼠睡眠時間的影響(±s)

注:▲P＜0.01,與正常組比較。

組 別 n 睡眠時間(min)正常組 12 61.75±11.89大劑量組 12 69.33±12.90中劑量組 12 68.92±11.87小劑量組 12 68.25±10.68安定組 12 128.17± 13.89▲

2.2 呼吸系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)的實驗 取大鼠 32只,體重 200-250g,隨機分為 4組正常組(給予等量食用調(diào)和油 20mL/kg)、α-亞麻酸大劑量組、中劑量組、小劑量組,每組 8只,雌雄各半。給藥后用戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉,10min后仰臥位固定于鼠臺上,手術(shù)分離氣管及一側(cè)頸總動脈,插氣管插管、動脈插管及標(biāo)準(zhǔn)二導(dǎo)聯(lián)心電電極,將張力傳感器連接于劍突處用于記錄呼吸,聯(lián)接調(diào)試好 RM-6280型智能八道生理記錄及分析處理系統(tǒng),準(zhǔn)備記錄呼吸、血壓、心電圖。記錄用藥后 30、60、90、120min呼吸、血壓、心電等變化。 所測數(shù)據(jù)均以±s表示,用 SPLM軟件以 t檢驗法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。結(jié)果顯示分別用α-亞麻酸大、中、小不同劑量給小鼠后 30、 60、90、120min對心率、血壓 (SP、DP)、呼吸頻率(RR)、與對照組比較無明顯影響見表 6。

表6 α-亞麻酸對大鼠的呼吸、血壓等影響(±s;n=8)

表6 α-亞麻酸對大鼠的呼吸、血壓等影響(±s;n=8)

用藥后不同時間各指標(biāo)值(±s)組 別 指 標(biāo)30min 60min 90min 120min正常組α-亞麻酸(大)α-亞麻酸(中)α-亞麻酸(小)HR(t/min)SP(kPa)DP(kPa)RR(t/min)HR(t/min)SP(kPa)DP(kPa)RR(t/min)HR(t/min)SP(kPa)DP(kPa)RR(t/min)HR(t/min)SP(kPa)DP(kPa)RR(t/min)380.97±51.38 15.07±1.34 11.81±2.17 64.23±12.16 383.78±34.28 15.20±1.45 12.79±1.78 60.04±11.36 390.20±50.87 15.76±1.85 11.70±1.67 65.61±11.28 405.91±66.65 15.52±3.04 12.15±2.38 76.55±23.19 367.27±42.73 15.20±1.25 11.77±2.10 64.06±10.78 395.54±45.29 15.76±1.32 12.67±1.70 59.66±9.93 390.80±38.19 15.76±1.32 12.37±1.70 65.57±11.67 392.56±61.64 15.56±3.13 11.95±2.55 72.66±11.70 389.85±17.32 14.97±1.48 11.84±1.63 66.37±9.15 451.79±92.51 15.41±1.61 11.99±1.72 58.93±9.52 394.61±48.75 15.76±1.72 11.76±2.25 62.77±10.95 416.73±67.92 15.98±2.70 12.95±2.39 71.26±14.95 401.10±43.98 15.15±1.43 12.29±1.46 63.99±8.77 372.27±35.91 15.68±1.31 12.38±1.41 58.82±9.16 378.49±33.14 15.93±1.26 12.14±1.71 62.34±8.15 407.50±68.67 16.06±2.33 12.69±2.25 71.10±13.98

3 討 論 椒目作為一種新的木本油脂資源,其油脂中約含有 30%的α-亞麻酸,我們采用綜合方法可對其中的α-亞麻酸進(jìn)行有效分離和純化[5],為椒目的綜合開發(fā)和利用奠定了研究基礎(chǔ)。

一般藥理研究是新藥安全性研究的一項重要內(nèi)容,本實驗結(jié)果表明,試驗劑量的α-亞麻酸對試驗動物神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)無明顯影響,說明其臨床應(yīng)用安全性良好。

[1] 程國慶,李進(jìn)才,蔣禮成.花椒及其混偽品的鑒別[J].陜西中醫(yī),2005,26(11):1234.

[2] 徐叔云,卞如濂,陳 修.藥理實驗方法學(xué) [M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1991:652-657,642-643,644.

[3] 陳 奇.中藥藥理研究方法學(xué) [M].北京:人民衛(wèi)生出版出版,1996:1862-1868.

[4] 郭德玉,敖 平,孫淑玲,等.芪茸保元湯對小鼠抗疲勞及免疫功能的影響[J].山西中醫(yī),1999,15(4):41-42.

[5] 楊 倩,王慶偉,劉雪英 ,等.椒目中高純度 a-亞麻酸的提取分離[J].天然藥物研究與開發(fā),2006,5(18):846-847.