荊 陽 楊仁旭 賈曉鑫 成都中醫(yī)藥大學(xué) (成都 610075)

支氣管哮喘是一種嚴(yán)重威脅人類健康的慢性呼吸道疾病,近年來其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢。最近研究提示在哮喘發(fā)病機(jī)制中,免疫細(xì)胞與神經(jīng)元之間存在著廣泛的聯(lián)系,而神經(jīng)生長因子(NGF)不僅可調(diào)控神經(jīng)發(fā)育、存活及維護(hù)其功能,也參與免疫炎癥調(diào)控,以及復(fù)雜的神經(jīng)-免疫相互作用,被認(rèn)為是參與這一免疫神經(jīng)機(jī)制的重要介質(zhì)。中醫(yī)藥對哮喘的防治具有豐富的經(jīng)驗和良好的效果,三拗芎葶合劑是楊仁旭教授治療哮喘有效的經(jīng)驗方,本實驗通過觀察哮喘大鼠肺 NGF表達(dá)和三拗芎葶合劑對 NGF表達(dá)的影響,旨在探討 NGF在哮喘發(fā)病機(jī)制中的作用及三拗芎葶合劑防治哮喘的作用機(jī)制,為中醫(yī)藥治療哮喘提供可靠的新的依據(jù)。

1 材料和方法 1.1 實驗動物與分組 SD大鼠 60只,體重 160-180g(由成都中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供)。隨機(jī)分為空白對照組、哮喘模型組、三拗芎葶合劑低、中、高劑量組、地塞米松組 6組。

1.2 藥物及試劑 三拗芎葶合劑:(麻黃 10g、杏仁 15g、川芎 15g、葶藶子 30g)由四川省中藥材公司提供合格藥材,經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑加工廠煎煮、回收揮發(fā)性成分、濃縮制備(每 1mL藥液含生藥 2g)。地塞米松注射液由西南藥業(yè)提供,給藥劑量 1mg/kg。大鼠 NGF原位雜交和免疫組化試劑盒由武漢博士德生物工程公司提供。

1.3 實驗方法 取健康 SD大鼠 60只,隨機(jī)分為空白組、哮喘模型組、三拗芎葶合劑低、中、高劑量組、地塞米松組 6組,每組 10只。除空白組以外的五組大鼠于第 4d和第 11d腹腔內(nèi)注射 10%卵白蛋白 (OV A)混合抗原液 1mL(含OV A100mg和氫氧化鋁干粉 100mg)致敏,第 3周起將大鼠置于密閉玻璃盒內(nèi),空白組大鼠用生理鹽水,其余組用超聲霧化器噴入 1% OV A溶液 30min激發(fā)哮喘,同時采用三拗芎葶合劑高劑量組 2mL(中藥 20g/kg)、中劑量組 1mL(中藥 10g/kg)稀釋為 2mL、低劑量組 0.5mL(中藥 5g/kg)稀釋為 2mL灌胃,1d1次;地塞米松組采用地塞米松注射液 5mg(規(guī)格 5mg/mL)稀釋為 50mL,每只鼠腹腔注射 2mL(1mg/kg),1d1次。 2周后處死大鼠,取右肺組織,固定石蠟包埋。

1.4 觀察指標(biāo) 1.4.1 病理形態(tài)學(xué):HE染色光鏡觀察并在高倍鏡下,測定單位面積支氣管粘膜和粘膜下嗜酸粒細(xì)胞(EO S)數(shù)和淋巴細(xì)胞(L)數(shù)。

1.4.2 支氣管肺組織 NGF的測定:石蠟切片經(jīng)常規(guī)處理后 ,滴加正常山羊血清室溫封閉 20min,然后按酶標(biāo)親和素-生物素技術(shù)(SP)法進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng),按照說明書操作。用圖像分析系統(tǒng)對實驗結(jié)果進(jìn)行圖像分析,計算出光密度值

1.4.3 支氣管肺組織 NGFmRN A的測定:石蠟切片經(jīng)常規(guī)處理后 ,測定支氣管肺組織 NGFmRN A,按照說明書操作。圖像分析系統(tǒng)對實驗結(jié)果進(jìn)行圖像分析,計算出光密度值。

2 結(jié) 果 2.1 肺 HE染色 空白組大鼠細(xì)支氣管纖毛排列整齊,管腔圓整,血管腔、肺泡腔、肺間質(zhì)偶見炎性細(xì)胞的浸潤,基底膜較薄,哮喘組大鼠氣道壁和肺組織中可見以嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主大量炎癥細(xì)胞浸潤,支氣管黏膜皺襞增多延長 ,支氣管管壁增厚、管腔狹窄,支氣管管壁及平滑肌較對照組明顯增厚,中藥小劑量組大鼠支氣管管壁增厚、管腔狹窄,支氣管管壁及平滑肌增厚有所減輕,炎性細(xì)胞侵潤減少,地塞米松組和中藥中、大劑量組大鼠細(xì)支氣管纖毛排列較整齊,管腔較圓整,血管腔、肺泡腔、肺間質(zhì)偶見到 EOS的浸潤,并可見少量淋巴細(xì)胞浸潤,基底膜增厚減輕。

2.2 EOS和淋巴細(xì)胞計數(shù) 表 1結(jié)果顯示:模型組EOS數(shù)和淋巴細(xì)胞數(shù)明顯高于空白組 (P＜0.01),中藥低、中、高劑量組及激素組均低于模型組 (P＜0.01),中藥中、高劑量組與地塞米松組相近,無顯著差異(P＞0.05)。

2.3 N GFmRNA和 NGF蛋白的表達(dá) 表 2結(jié)果顯示:模型組 N GF蛋白及其 mRAN表達(dá)明顯高于空白組 (P＜0.01),中藥低、中、高劑量組及激素組 NGF蛋白含量低于模型組(P＜0.01),其 mRAN表達(dá)明顯弱于模型組(P＜0.01),中藥中、高劑量組 N GF蛋白及其 mRNA表達(dá)與地塞米松組相近,無顯著差異(P＞ 0.05)。

表1 各組單位面積支氣管粘膜和粘膜下EOS數(shù)和淋巴細(xì)胞(L)數(shù) (±s)

表1 各組單位面積支氣管粘膜和粘膜下EOS數(shù)和淋巴細(xì)胞(L)數(shù) (±s)

注:與空白組比較△P＜0.01,▲P＜0.05;與模型組比較◇P＜0.01,◆P ＜0.05;與激素組比較□P ＜0.01。

組 別 n EOS L空白組 10 2.07± 1.05 8.53± 2.12模型組 10 25.43±5.07△ 36.17± 6.02△中藥低劑量組 10 14.97± 3.29△◇□ 26.90± 5.23△◇□中藥中劑量組 10 8.54± 3.30△◇ 16.44±3.52△◇中藥高劑量組 10 7.39± 2.48△◇ 14.82±2.26△◇地塞米松組 10 5.95±2.37△◇ 12.99±2.96▲◇

表2 各組大鼠肺組織 NGF及 NGFmRN A陽性反應(yīng)產(chǎn)物平均光密度值比較(±s)

表2 各組大鼠肺組織 NGF及 NGFmRN A陽性反應(yīng)產(chǎn)物平均光密度值比較(±s)

注:與空白組比較△P＜0.01,▲P＜0.05;與模型組比較◇P＜0.01,◆P ＜0.05;與激素組比較□P ＜0.01。

組 別 n NGFmRN A NGF空白組 10 0.140± 0.031 0.124± 0.022模型組 10 0.406±0.061△ 0.386±0.049△中藥低劑量組 10 0.342±0.053△◇□ 0.323± 0.056△◇□中藥中劑量組 10 0.225± 0.029△◇ 0.218± 0.027△◇中藥高劑量組 10 0.213± 0.030△◇ 0.209± 0.036△◇地塞米松組 10 0.190± 0.042△◇ 0.202± 0.031△◇

討 論 哮喘的基本病理改變?yōu)闅獾姥装Y,氣道炎癥是引起氣道高反應(yīng)性。氣道炎癥的神經(jīng)源性因素日益受到重視。神經(jīng)生長因子是神經(jīng)元細(xì)胞生長和分化的營養(yǎng)因子,近來發(fā)現(xiàn)NGF能影響機(jī)體的免疫系統(tǒng),與變態(tài)反應(yīng)性和炎癥性疾病的發(fā)病有關(guān)[1]。N GF的產(chǎn)生一般由神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生,但在炎癥條件下,大量非神經(jīng)細(xì)胞也可產(chǎn)生 NGF,包括肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞、T細(xì)胞和 B細(xì)胞。同時發(fā)現(xiàn) N GF能作用于免疫炎性細(xì)胞,促進(jìn)其增殖、分化、存活及介導(dǎo)、促進(jìn)炎癥介質(zhì)釋放 ,參與炎癥反應(yīng),加重氣道炎癥反應(yīng)[2-4]。目前研究表明,哮喘患者血清或 BALF中神經(jīng)營養(yǎng)因子水平增高的同時伴有 AHR存在[5]。最近又發(fā)現(xiàn)抑制 NGF能夠抑制支氣管的收縮,阻斷氣道高反應(yīng)性的發(fā)生[6]。因此,可認(rèn)為 NGF是聯(lián)系氣道免疫與神經(jīng)機(jī)制、導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性的重要物質(zhì)。一方面,NGF可通過對氣道神經(jīng)系統(tǒng)的影響,介導(dǎo)氣道高反應(yīng)性;另一方面,NGF也可通過神經(jīng)源性炎癥和“放大”免疫細(xì)胞效應(yīng)參與氣道炎癥的形成[7]。因此,NGF是連接氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的一座橋梁。

三拗芎葶合劑由麻黃、川芎、杏仁、葶藶子組成。麻黃苦辛性溫,宣肺平喘、利水之功;川芎辛溫 ,活血化瘀行氣 ,為血中之氣藥 ,通過治氣活血而使痰消飲祛 ,肺脈自寧;杏仁苦微溫,降肺氣之中兼宣肺止咳平喘之用;麻杏相伍 ,一宣一降 ,以恢復(fù)肺氣之宣降,順肺之生理特性,加強(qiáng)宣肺平喘之功;葶藶子苦辛大寒,瀉肺平喘、利水消腫。提示三拗芎葶合劑可能通過抑制 N GF表達(dá),減少炎性細(xì)胞分泌,來干預(yù)氣道炎癥,從而到達(dá)治療哮喘的目的。

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