杭柏林,秦治國(guó),付登峰,胡建和

（1.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003；2.輝縣市畜牧局,河南輝縣 453600）

大腸桿菌?。╟olibacillosis）是人和多種動(dòng)物共患的細(xì)菌性傳染病,對(duì)畜牧業(yè)造成的損害日益顯著[1].豬大腸桿菌病是較為常見(jiàn)的一種大腸桿菌病.豬大腸桿菌病是由某些具有致病性的大腸桿菌（E.coli）所引起的仔豬傳染病,主要包括仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病,在規(guī)?；i場(chǎng)的發(fā)病率和死亡率都較高,給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2].目前,在防治豬大腸桿菌病時(shí)多廣泛使用抗生素.但由于抗生素的不合理使用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散比較嚴(yán)重,使得豬大腸桿菌病的防控更加困難[3].為此,本研究采集了患黃痢、白痢仔豬的病料,進(jìn)行了致病性大腸桿菌的分離鑒定,并進(jìn)行了耐藥性檢測(cè)和分析,旨在為臨床上有針對(duì)性地防治豬大腸桿菌病提供幫助.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病料來(lái)源 采集原陽(yáng)縣某養(yǎng)豬場(chǎng)患黃痢、白痢仔豬的新鮮糞便、肝臟、脾臟和心血等病料共10份,用保溫杯冰袋冷藏保存,于3 h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室待檢.

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用6只小白鼠（16～20 g）購(gòu)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.

1.1.3 培養(yǎng)基與試劑 普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基和藥敏紙片均為本實(shí)驗(yàn)室自行制備并保存.微量生化反應(yīng)管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司.各種抗生素購(gòu)自河南科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)院.其他均為常規(guī)試劑.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離 將糞便和血液用滅菌生理鹽水進(jìn)行稀釋,取不同稀釋度的稀釋液0.5mL用涂布法接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基.肝臟和脾臟用剪刀以燙灼法進(jìn)行表面消毒,以無(wú)菌鑷子取一小塊組織用涂布法接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基.37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h后觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況和菌落特征.挑取單個(gè)菌落接種于麥康凱瓊脂平板,37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h,挑取紅色、中等大小、光滑的可疑菌落進(jìn)行涂片、革蘭染色和鏡檢.革蘭染色、形態(tài)、大小等均符合大腸桿菌特征的菌株初步確定為大腸桿菌,并用普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂純化,以供作細(xì)菌生理生化鑒定.

1.2.2 細(xì)菌生化鑒定 按照文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行.對(duì)疑似大腸桿菌的菌株進(jìn)行吲哚試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、維倍（VP）試驗(yàn)、硫化氫（H2S）試驗(yàn)、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)和5種糖類發(fā)酵試驗(yàn).

1.2.3 致病性試驗(yàn) 為了鑒定所分離的大腸桿菌是否具有致病性,使用小白鼠進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn).按照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行.將生化鑒定為大腸桿菌陽(yáng)性的菌株純培養(yǎng)物接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)18～24 h,用滅菌生理鹽水洗下,調(diào)節(jié)菌懸液的細(xì)菌濃度約為2.0×108CFU/mL,通過(guò)腹腔途徑注射5只健康小白鼠0.5mL/只.對(duì)照組小白鼠注射等量的滅菌生理鹽水.小白鼠死亡后進(jìn)行剖檢觀察,將病變明顯組織按方法1.2.1中心血、肝臟和脾臟的方法進(jìn)行接種,若培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色反應(yīng)和生理生化鑒定等均符合大腸桿的菌株則判定為致病性大腸桿菌.

1.2.4 藥敏試驗(yàn) 采用圓紙片法進(jìn)行.取37℃培養(yǎng)18 h的致病性大腸桿菌,置于1mL滅菌生理鹽水中,充分混合后用移液槍吸取150μL,均勻涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面.待瓊脂表面干燥后,用滅菌鑷子小心取已備好的各種藥敏紙片,包括青霉素、鏈霉素、慶大霉素、利福平、阿米卡星、阿莫西林、沙拉沙星、洛美沙星、頭孢噻呋,每個(gè)藥敏紙片設(shè)3個(gè)重復(fù).37℃恒溫培養(yǎng)24 h,測(cè)定抑菌圈直徑.判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑大于20mm為極度敏感,15.1～20mm為高度敏感,10.1～15mm為中度敏感,0～10mm為耐藥[6].

1.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)測(cè)得的抑菌數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離與培養(yǎng)結(jié)果

采集的10份病料中,5份病料中的細(xì)菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長(zhǎng)出灰白色、圓形、稍隆起、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊的中等大小菌落（直徑約1～2mm）,在麥康凱培養(yǎng)基上長(zhǎng)出磚紅色、圓形隆起、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊的菌落.將以上培養(yǎng)物進(jìn)行常規(guī)涂片,革蘭染色后鏡檢,見(jiàn)到革蘭陰性、中等大小的桿菌.將培養(yǎng)特征和鏡檢特征比對(duì)文獻(xiàn)[1]中大腸桿菌的特征描述,認(rèn)為分離到疑似大腸桿菌菌株5株.

2.2 細(xì)菌生理生化鑒定結(jié)果

5株疑似大腸桿菌菌株的生理生化鑒定結(jié)果如表1所示.將5株疑似菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果與參考文獻(xiàn)[1]中大腸桿菌生理生化特性的描述進(jìn)行比對(duì),確定分離到的5株疑似大腸桿菌菌株均為大腸桿菌.

表1 細(xì)菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果

2.3 致病性試驗(yàn)結(jié)果

分離菌株接種小白鼠后,均致試驗(yàn)組小白鼠出現(xiàn)癥狀：精神沉郁,體溫升高,采食量大幅減少；而對(duì)照組均健康存活.剖檢死亡鼠和病鼠,可見(jiàn)肝嚴(yán)重出血,或呈現(xiàn)暗紅色,脾和腎表面有出血點(diǎn),腸黏膜有出血、水腫現(xiàn)象,腸內(nèi)容物稀薄,有氣泡.從死亡或發(fā)病小白鼠的心血、肝、脾都能分離細(xì)菌,經(jīng)培養(yǎng)、鏡檢和生理生化鑒定為大腸桿菌.這表明,所分離到的5株大腸桿菌均具有致病性.

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

5株致病性大腸桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表2所示.從表2中可以看出,就受試抗生素而言,第2株豬致病性大腸桿菌為耐藥菌株,對(duì)所試抗生素均耐藥；第1株對(duì)沙拉沙星和洛美沙星極度敏感,對(duì)利福平、阿莫西林和頭孢噻呋耐藥；第3株對(duì)阿米卡星和洛美沙星極度敏感,未出現(xiàn)耐藥性；第4株對(duì)對(duì)青霉素、鏈霉素、沙拉沙星和洛美沙星極度敏感,未出現(xiàn)耐藥性；第5株對(duì)鏈霉素和阿米卡星極度敏感,未出現(xiàn)耐藥性.

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 （抑菌圈直徑,單位：mm）

3 小結(jié)與討論

3.1 大腸桿菌的分離與鑒定

大腸桿菌為革蘭陰性無(wú)芽胞的短小桿菌,在普通光學(xué)顯微鏡下很難與沙門(mén)菌等腸桿菌科的細(xì)菌相區(qū)別.因此,要鑒定所分離的細(xì)菌是否是大腸桿菌還必須進(jìn)行細(xì)菌生理生化鑒定.大腸桿菌有致病性和非致病性菌株之分,因此分離鑒定出大腸桿菌后必須通過(guò)動(dòng)物致病性試驗(yàn)鑒定所分離的大腸桿菌是否有致病性[7].本次送檢了10份病料,卻只分離到5株大腸桿菌.這可能與采集的病料標(biāo)本有關(guān),特別是抗生素的使用導(dǎo)致了標(biāo)本中細(xì)菌分離率的降低[2].

3.2 大腸桿菌的耐藥性

為控制細(xì)菌感染,于飼料中盲目添加一些抗菌藥物,會(huì)導(dǎo)致耐藥菌株越來(lái)越多并日趨嚴(yán)重.大腸桿菌可通過(guò)菌毛將其抗藥性質(zhì)粒傳遞給其他大腸桿菌,所以大腸桿菌的抗藥性形成較快,環(huán)境中大腸桿菌的耐藥性菌株越來(lái)越多[8].細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散不僅給控制和治療疫病帶來(lái)困難,而且嚴(yán)重危害動(dòng)物性食品安全,且給人類生命健康造成威脅[9].因此,要合理使用抗菌藥物.應(yīng)嚴(yán)格掌握抗菌藥物的適應(yīng)癥、劑量和療程,杜絕或盡量少用抗菌藥物作為飼料添加劑.細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生與擴(kuò)散使得研發(fā)新型抗菌物質(zhì)變得更為迫切.

目前,動(dòng)物源性大腸桿菌耐藥性呈現(xiàn)出以多重耐藥為主的趨勢(shì)[2-3].這種多重耐藥性產(chǎn)生的原因可能與豬飼料中長(zhǎng)期使用某些抗生素或?yàn)E用抗生素有關(guān)[10].本次試驗(yàn)分離的2株豬源耐藥性大腸桿菌菌株也表現(xiàn)為多重耐藥（第1株對(duì)3種抗生素耐藥,第2株對(duì)9種抗生素耐藥）.但是,像第2株對(duì)9種抗生素耐藥的現(xiàn)象還不多見(jiàn).

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