任玥，蘇秋香，張勇，張庭深*

(1.沈陽醫(yī)學(xué)院教務(wù)處，遼寧 沈陽 110034;2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織與胚胎學(xué)教研室)

1977 年，Banker and Cowan［1－3］首次在體外成功的分離并培養(yǎng)了大鼠胚胎海馬神經(jīng)元。此后隨著研究的深入，胎鼠海馬神經(jīng)元的體外分離培養(yǎng)技術(shù)被不斷的改進(jìn)和提高。但在原代培養(yǎng)中神經(jīng)元的純度和產(chǎn)量方面還存在一些急待解決的問題。本研究采用了木瓜酶和胰酶消化的方法來比較神經(jīng)元產(chǎn)量上的差異，并采用血清培養(yǎng)基加入阿糖胞苷和無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法比較其對(duì)胎鼠海馬神經(jīng)元純度的影響。旨在探討一種高效、穩(wěn)定的胎鼠神經(jīng)元的原代培養(yǎng)方法，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的研究提供理想的細(xì)胞模型。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 孕18 d的SPF級(jí)Wista大鼠，由沈陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要化學(xué)試劑 DMEM/F12(Invitrogen)，Neurobasalmedium、B27 supplement(Gibco)，多聚賴氨酸 (Sigma)，阿糖胞苷 (Ara-C，Invitrogen)，L-谷氨酰胺 (L-Gin，Sigma)、慶大霉素(Gibco)，胎牛血清 FBS(Gibco)，馬血清 HOS(Gibco)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要試劑配制

1.3.1 D'hanks液 1 000ml DDW中含NaCl 8 g，KCl0.4 g，Na2HPO4·12H2O 0.134 g，KH2PO40.06 g，NaHCO30.35 g，調(diào)pH值7.2～7.4，高壓除菌待用。

1.3.2 1.25%胰酶 取胰酶粉末0.125 g加入10 ml D'hanks液，濾器過濾備用。

1.3.3 種植液 DMEM/F12 85%+FBS 10%+HOS 5%。

1.3.4 神經(jīng)元培養(yǎng)基配制 neurobasal:B27為50∶1，加入L-Gin和慶大霉素 (L-Gin相當(dāng)于2 mM)。

1.3.5 HBS液 1 000 ml miniQ中含NaCl 8.4825 g，KCl1.639 g，HEPES2.3831 g，Glucose 0.9 g，調(diào)pH值7.3，高壓除菌待用。

1.3.6 0.2%木瓜酶 取木瓜酶粉末25 mg加入HBS液12.5 ml中，濾器過濾除菌備用。

1.4 方法

1.4.1 海馬神經(jīng)元分離培養(yǎng)的方法 用乙醚麻醉孕18 d的大鼠，無菌條件下取胚胎，斷頭、分離海馬;將海馬置于預(yù)冷的D'hanks液中，將其剪成碎片;分別加入胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，37℃消化10～20 min，不斷震搖，加入胎牛血清(終濃度為10%)終止消化，離心棄上清，再加適量含胎牛血清的D'hanks洗滌2次后，用吸管輕輕吹打，200目不銹鋼網(wǎng)過篩，收集濾液離心棄上清;分別用種植液配制成3×105/L細(xì)胞懸液加入預(yù)先用10 mg/L多聚賴氨酸包被的6孔培養(yǎng)板中，置CO2培養(yǎng)箱(5%CO2，37℃)培養(yǎng)，每周半量換液2次。并在培養(yǎng)3 d后分別加入終濃度為10μmol/L阿糖胞苷，24 h后全量換液，以抑制非神經(jīng)細(xì)胞的生長。在培養(yǎng)6 d時(shí)于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況并照像分析。

1.4.2 無血清培養(yǎng)的方法 按照以上方法收集到細(xì)胞后用種植液重懸種植培養(yǎng)后4 h換成神經(jīng)元培養(yǎng)基，置CO2培養(yǎng)箱 (5%CO2，37℃)培養(yǎng)，每周半量換液2次，不同時(shí)間段于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況并照像分析。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)元細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 在采取了相同的培養(yǎng)方法 (即種植液培養(yǎng)3 d后加入阿糖胞苷)后，通過倒置顯微鏡觀察。胰蛋白酶和木瓜蛋白酶消化后接種的兩組神經(jīng)元細(xì)胞均于第4h左右貼壁，圓而透明，折光性好，分布較均勻。培養(yǎng)18～24 h后，少數(shù)胞體較大的細(xì)胞有突起生成;培養(yǎng)第72 h，神經(jīng)元胞體增大，飽滿;培養(yǎng)第6 d，神經(jīng)細(xì)胞胞體不再繼續(xù)增大，突起長度穩(wěn)定，光暈明顯，形成完整神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。在觀察過程中，兩組神經(jīng)元均無較明顯的差別，在兩組中分別選取10個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)并做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(P＞0.05)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (圖1)。在采用相同的無血清培養(yǎng)方法中也得到相同結(jié)論，圖略。

圖1 不同消化酶處理后海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)6 d倒置顯微鏡結(jié)果 (×40)A.胰蛋白酶消化后接種培養(yǎng) B.木瓜蛋白酶消化后接種培養(yǎng)

2.2 神經(jīng)元的純度鑒定 基于結(jié)果2.1中兩種酶的消化對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)量無顯著影響的結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)在相同胰蛋白酶消化的條件下，比較血清培養(yǎng)3 d后加阿糖胞苷和無血清培養(yǎng)方法對(duì)改進(jìn)神經(jīng)元培養(yǎng)純度的影響。在兩種培養(yǎng)基培養(yǎng)后5 d后，倒置顯微鏡下選取10個(gè)高倍視野，無血清培養(yǎng)組神經(jīng)元胞體飽滿，突起較長數(shù)量明顯多于血清培養(yǎng)組，且神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量少于血清培養(yǎng)組。分別計(jì)數(shù)兩組神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，計(jì)算神經(jīng)元純度，結(jié)果見圖2。

圖2 不同培養(yǎng)方法神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖 (*P＜0.05)

2.3 木瓜酶消化和無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的胎鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)觀察 選用了溫和的木瓜酶消化和無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法接種后第4 h，細(xì)胞已貼壁，圓而透明，折光性好，分布較均勻。培養(yǎng)第2 d，少數(shù)胞體較大的細(xì)胞有突起生成;培養(yǎng)第6 d，神經(jīng)細(xì)胞胞體增大，突起粗而長，有單極、雙極、多極突起，細(xì)胞胞體飽滿，光暈明顯，形成完整神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，如圖3。

圖3 木瓜酶消化后無血清培養(yǎng)不同時(shí)間的海馬神經(jīng)細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡結(jié)果 (×40)A.培養(yǎng)第2 d;B.培養(yǎng)第6d;

3 討論

海馬神經(jīng)細(xì)胞原代培養(yǎng)是研究神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及功能的重要途徑和手段之一。大鼠胎鼠腦海馬是神經(jīng)元培養(yǎng)比較理想的取材部位，如何提高培養(yǎng)大腦海馬神經(jīng)元的活性和產(chǎn)率是培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵［4］。傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法是在取材中應(yīng)用胰蛋白酶消化并將神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng)一段時(shí)間后，通過加入阿糖胞苷抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長，達(dá)到神經(jīng)元的純化。這種培養(yǎng)方法由于酶消化的時(shí)間不易控制，而且應(yīng)用了有絲分裂抑制劑，其加入阿糖胞苷的時(shí)間劑量的把握均對(duì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)的產(chǎn)量和成活率造成很大影響［5，6］。

本實(shí)驗(yàn)在傳統(tǒng)培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上加以改良。通過對(duì)消化酶和培養(yǎng)基的篩選，結(jié)果表明:(1)木瓜酶相對(duì)胰蛋白酶比較，其消化效力溫和，時(shí)間容易控制且消化的結(jié)果與胰蛋白酶無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所以木瓜酶可以作為胎鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)的優(yōu)選酶，極大的改進(jìn)了原代培養(yǎng)中酶消化環(huán)節(jié)所造成的困擾。(2)本研究對(duì)比了傳統(tǒng)去除神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的方法和無血清培養(yǎng)方法中神經(jīng)元的純度，優(yōu)化了培養(yǎng)過程中的操作步驟并提高了神經(jīng)元的純度。無血清培養(yǎng)能顯著抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等干擾細(xì)胞的生長，因?yàn)锽27添加劑的配方中加入了選擇性抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長的成分因而倒置顯微鏡下細(xì)胞背景非常干凈。與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相比，B27添加劑中含30多種促進(jìn)神經(jīng)元生長和存活的微量元素，其種類和數(shù)量都比血清中豐富。

由于本實(shí)驗(yàn)方法優(yōu)化了胎鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)中取材步驟和酶消化的條件，能夠獲得產(chǎn)量、純度均較高，且神經(jīng)元形態(tài)好，可以作為神經(jīng)系統(tǒng)研究的理想模型的胎鼠海馬神經(jīng)元。因此，海馬神經(jīng)元無血清原代培養(yǎng)技術(shù)是一項(xiàng)值得推廣的技術(shù)。

［1］ Banker GA，Cowan WM.Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture［J］.Brain Res，1977，126:397 －425.

［2］ Banker GA，Cowan WM.Further observations on hippocampal neurons in dispersed cell culture ［J］.J Comp Neurol，1979，187:469－493.

［3］ Banker GA.Trophic interactions between astroglial cells andhippocampal neurons in culture［J］.Science，1980，209:809 －810.

［4］宋岳濤，洪慶濤，唐一鵬.阿糖胞苷對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的影響［J］.解剖學(xué)雜志，2004，27(6):696－699.

［5］ Müller HW，Seifert W.Aneurotrophic factor(NTF)released from primary glial cultures supports survival and fiber outgrowth of cultured hippocampal neurons ［J］.J Neurosci Res，1982，8:195－204.

［6］Muller HW，Beckh S，Seifer TW.Neurotrophic factor for central neurons［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1984，81:1244 －1252.