徐 晶 ，張 蓓 ，張青川 ，辛隨成

（1.河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050091； 2.北京市針灸醫(yī)院，北京 100700；3.北京王府中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，北京 102209； 4.北京中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，北京 100029）

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康成年SD大鼠120只，雄性，體重280 g～320 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。許可證號(hào)：SCXK（京）2002-0003。

1.1.2 試劑與儀器 SOD試劑盒、MDA試劑盒、NO試劑盒（尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司）；華佗牌SDZ－Ⅱ型電針儀（蘇州醫(yī)療用品廠(chǎng)有限公司）；華佗牌28號(hào)×1.0寸無(wú)菌毫針 （蘇州醫(yī)療器械廠(chǎng)有限公司）；MDF-U50V超低溫冰箱 （日本）；ZH－DSQ型大鼠灌胃器（河南原陽(yáng)振華教學(xué)儀器廠(chǎng)）；ZK-380低溫冷凍離心機(jī)（德國(guó)）；ER-182A上皿電子天平（日本）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 由黃芪、赤芍、川芎、當(dāng)歸、地龍、桃仁、紅花按照補(bǔ)陽(yáng)還五湯原方的配伍比例配制，煎煮3次，藥液混合濃縮至1 mL，相當(dāng)于2 g生藥。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組 常規(guī)飼養(yǎng)5 d，禁食12 h后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)［1-2］。120只SD大鼠，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方法，分為兩大組，作為兩不同時(shí)間點(diǎn)的研究對(duì)象，再分別將兩組隨機(jī)分為4小組，即假手術(shù)對(duì)照組（手術(shù)過(guò)程同模型組，不做線(xiàn)栓阻斷大腦中動(dòng)脈和抓?。?、模型組（線(xiàn)栓阻斷大腦中動(dòng)脈后再灌+抓?。㈩^針組（線(xiàn)栓阻斷大腦中動(dòng)脈后再灌+電針“百會(huì)”透“曲鬢”）和針?biāo)幗M（線(xiàn)栓阻斷大腦中動(dòng)脈后再灌+補(bǔ)陽(yáng)還五湯灌胃+電針“百會(huì)”透“曲鬢”），每組 15 只。

1.2.2 模型制備 參照Z(yǔ)ea Longa E L等［3］建立的方法并改進(jìn)，由頸外動(dòng)脈插入栓子。應(yīng)用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，仰臥位固定，碘伏消毒局部。頸部正中切口，逐層分離皮層、肌層、氣管，以暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈（CCA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）、頸外動(dòng)脈（ECA）和翼腭動(dòng)脈（PPA），向離心端分離出 ICA、ECA，在ECA發(fā)出1 cm處結(jié)扎并剪斷，然后分離ICA、ECA間的細(xì)小交通支，結(jié)扎游離。用動(dòng)脈夾夾閉CCA、ICA和PPA后，在ECA殘端剪一約0.2 mm的切口，將ECA殘端拉直到與ICA成直線(xiàn)的角度，從切口處插預(yù)先制備的倒錐形頭端栓線(xiàn)進(jìn)入到ICA中，避開(kāi)PPA，繼續(xù)直至顱底入顱，遇微阻力時(shí)停止，即到達(dá)大腦前動(dòng)脈（ACA）近端，從而阻斷了MCA的起始部，栓線(xiàn)的插入深度約18 mm～25 mm，ECA切口外保留2 cm長(zhǎng)的線(xiàn)端。松開(kāi)動(dòng)脈夾，逐層縫合切口，并用碘伏消毒縫合處。于缺血2 h后拔出線(xiàn)栓2 cm，建立腦缺血-再灌注模型［4～6］。

1.2.3 神經(jīng)癥狀行為學(xué)評(píng)估 大鼠在造模手術(shù)清醒后（2 h 內(nèi)）即依據(jù) Zea Longa E L 等［3］確定的 5 級(jí)評(píng)分方法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：0分：正常活動(dòng)；1分：不能充分伸展右前肢；2分：向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向右側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識(shí)障礙。將模型成功（2～3分）的大鼠用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 處理方法 造模成功后，于缺血2 h再灌注后1 h（動(dòng)物均已清醒）及缺血2 h再灌注后13 h給予治療。針?biāo)幗M先灌胃后針刺。針刺方法：將大鼠固定在實(shí)驗(yàn)架上，先取大鼠頭頂部相當(dāng)于人體百會(huì)穴區(qū)（位于頂骨正中［7］），常規(guī)消毒后，以 28號(hào) 1.0寸毫針快速刺入皮下。然后沿皮向左前下方（相當(dāng)于人體曲鬢穴處）平刺，進(jìn)針深度約1 cm，將針柄連接至電針儀的一電極上，另一電極接上生理鹽水浸濕的紗布夾于大鼠的左耳上，強(qiáng)度2 mA、頻率為2/10 Hz的疏密波，留針20 min。使用灌胃器按1.2 mL/kg劑量進(jìn)行藥物灌胃治療。假手術(shù)組、模型組不予治療，只做抓取1次。

1.2.5 取材與指標(biāo)檢測(cè) 兩大組動(dòng)物分別于缺血2 h再灌注后12 h（I2 h/R12 h組）、缺血2 h再灌注后1 d（I2 h/R1 d組）時(shí)迅速斷頭開(kāi)顱取腦，在大腦中動(dòng)脈梗死區(qū)腦組織取材［8］，并在冰盤(pán)上用4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸去水分。將所取腦組織勻漿，以pH 8.0的PBS緩沖液制成10%的勻漿液，以10000 r/min離心20 min后，取上清液。腦組織SOD活力測(cè)定用黃嘌呤氧化酶法，腦組織MDA含量測(cè)定用硫代巴比妥酸（TBA）法，腦組織NO含量測(cè)定用硝酸還原酶法。采用SAS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以單因素方差分析判定各組組間差異（P＜0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 局灶性腦缺血再灌注模型（MCAO）大鼠行為學(xué)改變

在MCAO術(shù)清醒（約1 h）后，2 h內(nèi)觀(guān)察模型動(dòng)物神經(jīng)功能缺失癥狀，所有納入實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物均出現(xiàn)：①靜止時(shí)不能充分伸展右前爪，行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈或傾倒；②動(dòng)物爬板實(shí)驗(yàn)時(shí)，總是落向右側(cè)；③提尾實(shí)驗(yàn)時(shí)，右前肢內(nèi)收，頭彎向右上；④出現(xiàn)霍納氏征（瞳孔縮?。Ｉ窠?jīng)功能評(píng)分均在2～3分。

2.2 SOD活性測(cè)定

I2 h/R12 h模型組、頭針組和針?biāo)幗M大鼠的腦組織SOD活性與假手術(shù)對(duì)照組比較，均明顯減低 （P<0.05，P<0.01），且頭針組和針?biāo)幗M數(shù)值明顯高于模型組（P<0.05），但頭針組與針?biāo)幗M差異不明顯。I2 h/R1 d模型組、頭針組和針?biāo)幗M數(shù)值仍明顯低于假手術(shù)對(duì)照組（P<0.05，P<0.01），同時(shí)前兩者之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），但頭針組與針?biāo)幗M比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠缺血腦組織SOD活性值 （±sd）

表1 各組大鼠缺血腦組織SOD活性值 （±sd）

注 ： 與 同時(shí) 間 點(diǎn) 取 材 的 假 手 術(shù) 對(duì) 照 組 比 較 ，1）P<0.05，2）P<0.01；與同時(shí)間點(diǎn)取材的模型組比較，3）P<0.05，4）P<0.01

組別 n S O D（U/m g）I 2 h/R 12 h假手術(shù)對(duì)照組 8 169.75±33.23 I 2 h/R 12 h 模型組 10 91.20±25.99 2）I 2 h/R 12 h 頭針組 9 133.05±32.20 1）3）I 2 h/R 12 h 針?biāo)幗M 9 135.69±36.98 1）3）I 2 h/R 1 d假手術(shù)對(duì)照組 8 152.83±30.54 I 2 h/R 1 d 模型組 8 90.32±12.34 2）I 2 h/R 1 d 頭針組 10 129.14±12.58 1）4）I 2 h/R 1 d 針?biāo)幗M 8 127.75±19.09 1）4）

2.3 MDA含量測(cè)定

I2 h/R12 h模型組較假手術(shù)對(duì)照組腦組織MDA含量明顯升高（P<0.05），但頭針組、針?biāo)幗M與模型組和假手術(shù)對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。I2 h/R1 d假手術(shù)對(duì)照組與模型組、頭針組數(shù)值均存在顯著差異（P<0.01），頭針組較針?biāo)幗MMDA含量高（P<0.05）。同時(shí)，針?biāo)幗M與假手術(shù)對(duì)照組大鼠的腦組織MDA含量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠缺血腦組織MDA含量 （±sd）

表2 各組大鼠缺血腦組織MDA含量 （±sd）

注 ： 與 同時(shí) 間 點(diǎn) 取 材 的 假 手 術(shù) 對(duì) 照 組 比 較 ，1）P<0.05，2）P<0.01；與同時(shí)間點(diǎn)取材的模型組比較，3）P<0.01

組別 n M D A（n m o l/m g）I 2 h/R 12 h假手術(shù)對(duì)照組 8 3.88±1.75 I 2 h/R 12 h 模型組 10 6.15±1.96 1）I 2 h/R 12 h頭針組 9 5.18±1.70 I 2 h/R 12 h針?biāo)幗M 9 4.32±1.28 I 2 h/R 1 d假手術(shù)對(duì)照組 8 3.56±0.72 I 2 h/R 1 d 模型組 8 6.20±0.59 2）I 2 h/R 1 d 頭針組 10 5.17±0.98 2）3）I 2 h/R 1 d 針?biāo)幗M 8 4.29±0.56 3）

2.4 NO含量測(cè)定

I2 h/R12 h模型組較假手術(shù)對(duì)照組NO含量明顯升高（P<0.05），但頭針組、針?biāo)幗M與模型組與假手術(shù)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。I2 h/R1 d模型組較假手術(shù)對(duì)照組數(shù)值明顯升高（P<0.01）。頭針組、針?biāo)幗M與模型組大鼠腦組織NO含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)果見(jiàn)表 3。

表3 各組大鼠缺血腦組織NO含量 （±sd）

表3 各組大鼠缺血腦組織NO含量 （±sd）

注 ： 與 同 時(shí) 間 點(diǎn) 取 材 的 假 手 術(shù) 對(duì) 照 組 比 較 ，1）P<0.05，2）P<0.01；與同時(shí)間點(diǎn)取材的模型組比較，3）P<0.01

組別 n N O（μ m o l/g）I 2 h/R 12 h假手術(shù)對(duì)照組 8 21.66±5.20 I 2 h/R 12 h 模型組 10 30.04±4.48 1）I 2 h/R 12 h頭針組 9 24.68±7.95 I 2 h/R 12 h針?biāo)幗M 9 27.09±7.22 I 2 h/R 1 d假手術(shù)對(duì)照組 8 20.94±4.43 I 2 h/R 1 d 模型組 8 30.12±5.54 2）I 2 h/R 1 d 頭針組 10 22.82±3.91 3）I 2 h/R 1 d 針?biāo)幗M 8 21.40±4.43 3）

3 討 論

祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)于中風(fēng)的記載，源于《內(nèi)經(jīng)》，相關(guān)病名如大厥、薄厥、煎厥、偏枯、仆擊、痱風(fēng)等。隨著后代醫(yī)家對(duì)中風(fēng)認(rèn)識(shí)的不斷加深，尤其在病因病機(jī)方面闡釋頗多，歸結(jié)起來(lái)不外乎虛（陰虛、氣虛）、火（心火、肝火）、風(fēng)（肝風(fēng)、外風(fēng)）、痰（風(fēng)痰、濕痰）、氣（氣逆）、血（血瘀），病因病機(jī)概括為病因積累、正衰積損，外加諸邪叢生、氣血逆亂，腦脈痹阻或血溢腦脈之外?！秲?nèi)經(jīng)》首先提出中風(fēng)病變部位在頭，“百會(huì)”居頭之巔，是督脈之要穴，為手足三陽(yáng)、督脈及足厥陰之會(huì)，統(tǒng)領(lǐng)一身之陽(yáng)，內(nèi)系于腦；“曲鬢”為足太陽(yáng)、少陽(yáng)之會(huì)，三條陽(yáng)經(jīng)從頭至足，縱貫全身，具有統(tǒng)領(lǐng)一身陽(yáng)氣的功能。以上兩穴位合用，貫穿多條經(jīng)脈，起到了一經(jīng)帶多經(jīng)，一穴帶多穴的整合作用，起通調(diào)督脈、醒腦開(kāi)竅、寧神定志之功。而王清任在《醫(yī)林改錯(cuò)·論小兒抽風(fēng)不是風(fēng)》中說(shuō)：“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于血管，血管無(wú)氣，必停留而瘀”，因此氣虛血瘀是最基本的病理機(jī)制。故本實(shí)驗(yàn)以補(bǔ)陽(yáng)還五湯益氣活血，益氣則氣行以消脈中之瘀，氣旺以資新血化源，故可治本；化瘀則瘀除腦通，為治標(biāo)之法，標(biāo)本同治可化瘀不傷正。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，人體的各組織器官在代謝過(guò)程中都會(huì)產(chǎn)生自由基，毒性很強(qiáng)，可以攻擊細(xì)胞的脂類(lèi)、蛋白質(zhì)、核酸等。在抗氧化系統(tǒng)正常的生理情況下，自由基的產(chǎn)生與清除之間處于動(dòng)態(tài)平衡。急性腦血管病發(fā)生后，無(wú)論是缺血性或是出血性損傷均可引起自由基生成增加，通過(guò)一系列復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。同時(shí)，自由基引發(fā)的線(xiàn)粒體膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)或細(xì)胞內(nèi)形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物作用于線(xiàn)粒體膜，使膜的流動(dòng)性及液態(tài)改變，從而導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能障礙，加重自由基對(duì)機(jī)體的損傷。再灌注期腦組織內(nèi)自由基的升高，使細(xì)胞膜磷脂中多聚不飽和脂肪酸和脂肪酸的不飽和雙鍵更易受到攻擊，引發(fā)腦血管通透性的增加、破壞血腦屏障，加重神經(jīng)元損害和腦水腫［9］。有實(shí)驗(yàn)顯示，自由基的脂質(zhì)過(guò)氧化作用增強(qiáng)主要發(fā)生在再灌注期［10］。腦缺血后Ca2+通道過(guò)度激活［11］，NO合成過(guò)量，也從多方面影響腦血管的通透性，形成腦水腫，加重腦組織的損傷［12-14］。

通過(guò)對(duì)比研究顯示，在腦缺血-再灌注急性期，模型動(dòng)物缺血局部腦組織中SOD活性明顯升高，MDA含量顯著降低，二者呈負(fù)相關(guān)，提示局部自由基代謝水平升高，脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)顯著增強(qiáng)。腦缺血-再灌注急性期腦組織中NO含量明顯升高，可能系Ca2+通道過(guò)度開(kāi)放，受到Ca2+-CaM直接調(diào)節(jié)的NOS被大量激活，合成過(guò)量NO。單一頭針或針?biāo)幗Y(jié)合治療均可通過(guò)提高SOD活性并下調(diào)腦組織MDA含量，減輕氧自由基介導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，并以針?biāo)幗Y(jié)合療效更為顯著。兩治療方案均通過(guò)抗氧自由基作用，并改善線(xiàn)粒體功能而改善腦組織的能量代謝，使蛋白激酶活性升高，從而使NOS磷酸化，活性降低，減少了NO的合成。頭針和針?biāo)幗Y(jié)合通過(guò)抑制自由基代謝來(lái)減輕腦缺血-再灌注損傷，是兩種方案治療缺血性腦血管病的重要途徑之一，并以針?biāo)幘C合療法效果更優(yōu)，早期干預(yù)治療對(duì)本病的恢復(fù)有著積極的意義，為臨床治療缺血性腦損傷提供了實(shí)驗(yàn)室佐證。

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