顏承農 (長江大學化學與環(huán)境工程學院,湖北荊州434023;長江大學工程技術學院,湖北荊州434020)

劉 晶 (中原油田采油工程技術研究院,河南濮陽457001)

劉 義 (武漢大學化學與分子科學學院,湖北武漢430072)

蛋白質是生命的最基本物質之一,它與營養(yǎng)、發(fā)育、遺傳、新陳代謝等生命活動等密切相關,血清白蛋白是血漿中含量最豐富的重要載體蛋白,它能和許多內源性和外源性物質廣泛結合。許多藥物、農藥和染色劑等有機小分子都能和蛋白質等生物大分子發(fā)生相互作用。研究它們與蛋白質等生物大分子相互作用特征,探討相互作用的熱力學性質、結合力性質等,可以從分子水平的角度認識蛋白質與小分子相互作用的機理,這對于促進小分子的生物學效應、藥理學和毒理學的研究,以及蛋白質組學和生命科學研究等有著重要的意義[1,2]。有機小分子染料可以與蛋白質結合,引起染料或蛋白質光譜特性的變化,因此小分子染料作為測定蛋白質的探針得到了廣泛應用,但它們相互作用的機理尚在研究探討之中。茜素黃 (Alizarin Yellow R,AYR)是一種穩(wěn)定性比較好的有機染料,可以作為研究有機小分子與蛋白質相互作用的熱力學特征及其對蛋白質構象影響熒光的探針。下面,筆者掃描了AYR和AYR作用于牛血清白蛋白 (bovine serum albumin,BSA)的熒光猝滅光譜、同步熒光光譜、三維熒光光譜和紫外-可見吸收光譜,分別用Stern-Volmer方程和Lineweaver-Burk方程等處理試驗數(shù)據,得到了相互作用常數(shù)和熱力學參數(shù)等,為研究AYR的染色機理,探討釋放到環(huán)境中的AYR產生的生物學效應和對蛋白質構象的影響等提供重要信息。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

1)儀器 LS-55型熒光分光光度計 (美國PE公司);TU-1901型紫外可見分光光度計 (北京普析通用儀器有限責任公司);AY120電子天平 (日本島津公司);恒溫水浴SYC-15型 (南京桑力電子設備廠)。

2)試劑 AYR儲備液,200μ g/mL;AYR工作液,12μ g/mL;BSA(上海生物化學制劑廠)溶液,5.0×10-5mol/L;NaCl溶液,0.5mol/L;Tris-HCl緩沖溶液,pH=7.40。所用試劑均為分析純,水為二次去離子水,經檢測均無熒光雜質。

1.2 試驗方法

在10ml比色管中依次加入 2.0ml的NaCl(0.5mol/L)溶液、2.0ml的 Tris-HCL緩沖溶液(pH=7.40)和2.0ml的BSA(5.0×10-5mol/L)溶液及0～3.5ml的AYR溶液,以二次去離子水定容;當激發(fā)光波長為285nm、狹縫寬度分別為15nm和2.5nm時,常壓下,分別于21、26、31、36、41℃時,在250～500nm范圍內掃描了BSA的熒光猝滅光譜,同時在26℃時測定了體系的同步熒光光譜、三維熒光光譜和紫外-可見吸收光譜,分別獲得試驗對象的相對熒光強度和吸光度等。

2 AYR對BSA的熒光猝滅光譜

2.1 熒光猝滅光譜

BSA分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基能夠發(fā)射內源熒光,當激發(fā)光波長為285nm時,BSA熒光發(fā)射峰位置在347nm附近。按試驗方法分別掃描了21、26、31、36、41℃等溫度下BSA的熒光發(fā)射光譜和BSA-AYR體系的熒光猝滅光譜,26℃的BSA和BSA-AYR體系的熒光猝滅光譜見圖1。由圖1可以看出,隨著AYR濃度增加,BSA的熒光發(fā)射峰強度有規(guī)律地降低,表明AYR分子能夠與BSA發(fā)生相互作用進而猝滅BSA的內源性熒光。

圖1 BSA和BSA-AYR體系熒光猝滅光譜

2.2 熒光猝滅作用描述

有機小分子對蛋白質的熒光猝滅作用可分為動態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉移猝滅等。動態(tài)猝滅主要是一種能量轉移或電子轉移過程,不影響蛋白質的結構和生理活性,而靜態(tài)猝滅主要是由于小分子和蛋白質等生物大分子發(fā)生了相互作用,可能生成不發(fā)熒光的配合物,影響了蛋白質的二級結構,導致蛋白質生理活性發(fā)生變化。

動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅作用可分別用Stern-Volmer方程:

和Lineweaver-Burk方程:

進行描述。式中,IF為有猝滅劑時BSA的熒光強度;為無猝滅劑時BSA的熒光強度;cAYR為猝滅劑濃度;KSV為動態(tài)猝滅常數(shù),它反映了生物大分子與熒光猝滅劑分子彼此擴散和相互碰撞到達動態(tài)平衡時的量效關系;Kq為動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù),它反映了體系中分子的彼此擴散和相互碰撞對生物大分子熒光壽命衰減速率的影響,各類熒光猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)約為2.0×1010L/(mol·s);τ0為猝滅劑不存在時熒光分子的平均壽命,生物大分子的熒光平均壽命約為10-8s;KLB為靜態(tài)熒光猝滅結合常數(shù),單位是mol/L,它反映了在靜態(tài)猝滅過程中生物大分子與熒光猝滅劑分子相互作用達到平衡時的量效關系[3,4]。

3 熒光猝滅作用性質和相互作用力

3.1 熒光猝滅作用性質

在溫度分別為 21、26、31、36、41℃時,由試驗數(shù)據分別作出 BSA的Stern-Volmer曲線和Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線,如圖2所示。對數(shù)據線性擬合得到直線方程、相關系數(shù)R等見表1。

圖2 Stern-Volmer曲線和Lineweaver-Burk曲線

表1 線性回歸方程和相關系數(shù)

表2 AYR對BSA作用常量和熱力學參數(shù)

由AYR對BSA作用的試驗結果可以看出,Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線的線性關系明顯優(yōu)于Stern-Volmer曲線的線性關系;動態(tài)猝滅作用的Kq值一般都小于2.0×1010L/(mol·s),但表2中Kq值大于2.0×1010L/(mol·s);相互作用的吉布斯自由能 Δ G小于零,相互作用常量 KLB達到4.394×104mol/L,說明它們之間的相互作用能自發(fā)進行,且作用產物穩(wěn)定性良好。BSA、AYR和BSA-AYR體系的紫外-可見吸收光譜如圖3所示。在圖3中,BSA、AYR和BSA-AYR體系的紫外-可見吸收光譜的吸收峰強度和吸收峰位置明顯有別。按照試驗方法分別得到 Δλ=60nm 和 Δ λ=15nm 時,BSA和 BSA 與AYR作用的同步熒光光譜,如圖4(a)和4(b)所示 。在 Δλ=60nm和 Δ λ=15nm時的同步熒光光譜主要分別反映蛋白質中Trp和Tyr氨基酸殘基的熒光光譜特征[5]。隨著 AYR濃度的增加,相對BSA的熒光發(fā)射峰而言,T rp的發(fā)射波長紅移0.85nm,Tyr的發(fā)射波長藍移2.0nm。這些都是BSA與AYR相互作用生成一種新復合物的佐證。

圖3 AYR(1)、BSA(2)和AYR-BSA體系的BSA紫外-可見吸收光譜(3～6)

3.2 相互作用力

有機小分子與蛋白質相互作用的主要部位是蛋白質上的精氨酸、賴氨酸、組氨酸和N端氨基等堿性氨基酸殘基。相互作用力有氫鍵作用力、靜電作用力、疏水作用和范德華力等。Ross等[6]總結了判斷生物大分子與有機小分子等作用力性質的熱力學規(guī)律,即疏水作用力可使體系的ΔH(等壓熱效應)和ΔS(熵變化)增大,氫鍵力或 Vander Waals力有可能使體系的 ΔH和ΔS減小,靜電作用力使ΔH ≈0,Δ S＞0。

圖4 同步熒光光譜

當溫度變化范圍不太大時,反應的焓變ΔH可以看作是一個常數(shù)。由Van't Hoff等壓方程的不定積分式:

作圖可以求得ΔH(見圖5),由方程:

可求 Δ Gθ和ΔS等,見表2。相互作用的ΔH ≈0,ΔS＞0,說明AYR與BSA之間的作用力可能主要是靜電作用力。這可能是在試驗條件下,BSA上的正電性氨基 (—NH3+)把帶負電荷的茜素黃分子吸引到了蛋白質空間結構的表面,同時由于氫鍵等其他非靜電力使兩者結合的更加緊密。

圖5 ln KLBθ～1/T圖

4 AYR與BSA相互作用的表觀作用常數(shù)KA和作用位點數(shù)n

設生物大分子B有2個相同且獨立的結合位點,與猝滅劑(Q)間的結合常數(shù)為KA,它們與熒光強度之間符合以下關系式:

式中,KA為表觀作用常數(shù),斜率為作用位點數(shù)n。作圖,由直線截距可求表觀作用常數(shù)平均值為5.930×105,由斜率可求作用位點數(shù)平均值為1.183。表明BSA與AYR分子可能是1對1相互結合為復合物。

5 AYR對BSA構象的影響

研究證明,三維熒光光譜能提供更多被研究對象的相關信息[7]。蛋白質中氨基酸殘基的最大熒光發(fā)射波長與外界分子的作用和它們所處環(huán)境的極性等因素有關。BSA在AYR作用前后的熒光猝滅光譜、同步熒光光譜和三維熒光光譜的峰強度和峰波長均有明顯變化。BSA的空間結構由3個結構域組成,每個結構域由2個亞結構域以槽口相對的方式形成圓筒狀結構,幾乎所有的疏水性氨基酸殘基都包埋在圓筒內部,構成疏水腔。在水溶液中,BSA主要由疏水作用力維持其空間結構和疏水腔。按照試驗方法掃描了BSA和AYR-BSA體系的三維熒光光譜 (見圖6),繪制了等熒光強度圖 (見圖7)。由圖6、圖7可比較AYR作用BSA前后三維熒光光譜的變化,探討AYR對BSA構象和微環(huán)境的影響。AYR作用BSA后,在熒光發(fā)射光譜中BSA的Trp的峰位有明顯紅移,其對應的同步熒光光譜證實紅移現(xiàn)象(見圖4(a))。而Tyr峰位紅移現(xiàn)象 (見圖4(b))在圖1中是被掩蓋了的。在圖6(a)中,當BSA的濃度為1.0×10-5mol/L時,其熒光峰峰頂?shù)南鄬晒鈴姸群头屙斪鴺?IF,λex/λem)為 (492.1,280.0nm/348.5nm),與二維熒光發(fā)射光譜圖一樣,主要描述T rp和Tyr的熒光光譜行為。在圖6(b)中,當加入AYR后,BSA的峰頂?shù)南鄬晒鈴姸群头屙斪鴺?IF,λex/λem)為 (283.2,280.0nm/346.0nm),熒光強度降低了208.9,激發(fā)波長未移動,但發(fā)射波長藍移了2.5 nm,說明AYR與BSA作用后,部分能量轉移到了AYR上,同時顯示Trp所處微環(huán)境的極性有所削弱,它們盡可能分布在BSA腔內的疏水區(qū)內,而Tyr所處微環(huán)境的極性有所增強,可能分布在BSA分子表面附近的親水區(qū)內,導致BSA形成了一種新的無序結構。

圖6 BSA和BSA-AYR體系的三維熒光光譜

6 結 論

1)由21～41℃溫度范圍內體系的熒光猝滅光譜數(shù)據,得到了AYR和BSA相互作用的熒光猝滅結合常數(shù)KLB的平均值為4.394×104mol/L,熱力學參數(shù)ΔHθ、Δ Gθ和Δ Sθ的平均值分別為-3.408kJ/mol、-27.02kJ/mol和77.64J/K,結合位點數(shù)的平均值為1.183;熒光猝滅性質主要是靜態(tài)猝滅,相互作用力主要是靜電作用力。蛋白質分子中的疏水效應、各基團之間的氫鍵作用和靜電作用力是穩(wěn)定和維持其二、三級結構的重要因素。

2)由同步熒光光譜和三維熒光光譜的特征可以看出,AYR作用BSA后,BSA所處微環(huán)境的極性發(fā)生了明顯變化,加上靜電力的作用,肽鏈緊密度增加;非極性的Trp可能更加傾向于分布在BSA分子的疏水部位,而極性的Tyr則更傾向于分布在AYR親水區(qū)內,這就導致了BSA原有的有序結構破壞,形成了一種新的無序結構。

圖7 BSA和BSA-AYR體系的等熒光強度圖

3)從所得結合常數(shù)看,與BSA的結合常數(shù)達到104數(shù)量級,且能改變蛋白質的構象,說明AYR也可在哺乳動物等生物體內運載、貯存和積蓄,這也是AYR對生態(tài)環(huán)境一定負面效應的有力證明[8,9]。

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