桑 丹 孫海洲* 趙存發(fā) 郭俊清

（1.內蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院動物營養(yǎng)研究所,呼和浩特 010030;2.內蒙古農(nóng)牧業(yè)科學院,呼和浩特 010031; 3.內蒙古農(nóng)業(yè)大學動物科學與醫(yī)學學院,呼和浩特 010018）

畜牧生產(chǎn)的目的是提供肉、蛋、奶等畜產(chǎn)品,以滿足人類對蛋白質的需求。如何提高動物機體蛋白質合成量和飼料中蛋白質的利用效率,為人類提供更加安全、健康的食品,是近年來反芻動物蛋白質營養(yǎng)研究,特別是分子營養(yǎng)學興起以來的熱點和焦點。近年來,隨著氨基酸營養(yǎng)組學的興起,研究者們提出了功能性氨基酸的概念。功能性氨基酸是指除了合成蛋白質外還具有其他特殊功能的氨基酸,其不僅對動物的正常生長及維持是必需的,而且對多種生物活性物質的合成也是必需的。此類氨基酸包括精氨酸、谷氨酰胺、支鏈氨基酸（branched-chain am ino acids,BCAAs）、色氨酸、甘氨酸和脯氨酸等[1]。BCAAs包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸,是唯一一類調控肝外代謝的必需氨基酸。它們主要在骨骼肌代謝,約占骨骼肌蛋白質必需氨基酸的35%,同骨骼肌的合成有著密切的關系[2]。早期研究表明BCAAs在調節(jié)骨骼肌中蛋白質合成具有重要作用[3]。亮氨酸是動物體內唯一的生酮氨基酸,它是BCAAs中對蛋白質代謝起主要調節(jié)作用的氨基酸。近年來有研究進一步證實,BCAAs中的亮氨酸在刺激肌肉內部蛋白質合成是最有效的,而異亮氨酸和纈氨酸要差一些[4]。有研究報道,亮氨酸增加蛋白質合成高達50%,而抑制分解僅為25%[5]。抑制分解的主要是亮氨酸分解代謝產(chǎn)物α-酮異己酸的作用。

功能性氨基酸具有特殊的營養(yǎng)功能,補充功能性氨基酸在增強機體能量代謝、增強免疫能力、延遲中樞疲勞、促進肌肉合成、加快機體恢復等方面具有一定的功效。為此,本試驗根據(jù)代謝動力學原理,結合常規(guī)動物營養(yǎng)學研究方法,采用大劑量一次性灌注法,從組織蛋白質周轉入手,研究瘤胃保護性亮氨酸對綿羊機體蛋白質合成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

選用12只體況良好,體重為（25.00±2.86）kg的6月齡綿羊羯羊,按體重隨機分為4組,每組3只,進行動物試驗。

1.2 試驗飼糧

試驗基礎飼糧參照肉羊飼養(yǎng)標準（NY/T 816—2004）配制,基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。對照組試羊（1組）飼喂基礎飼糧,每只日喂量1.0 kg;試驗組試羊每日每只分別補飼0.5（2組）、1.0（3組）和1.5 g（4組）瘤胃保護性亮氨酸。試驗組每日基礎飼糧飼喂量1.0 kg,補飼瘤胃保護性亮氨酸混入基礎飼糧中喂給。試驗期間各組試羊無剩料現(xiàn)象。瘤胃保護性亮氨酸添加量參考Flakoll等[6]。亮氨酸購自生工生物工程（上海）有限公司,純度99%,包被產(chǎn)品來源于常州佳發(fā)制粒干燥設備有限公司。

表1 基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平（干物質基礎）Tab le 1 Com position and nutrient levels of basal diet （DM basis,%）

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗羊每日在06:00和18:00分別先粗后精等量飼喂2次,自由飲水。預試期15 d,飼喂基礎飼糧。試驗期15 d,對照組飼喂基礎飼糧,試驗組飼喂添加瘤胃保護性亮氨酸的飼糧。

1.4 試驗方法

本試驗采用大劑量一次灌注法,測定不同組織的蛋白質合成率（FSR）[8]。

試驗期結束后,在預先刮好的腹部皮膚處用普魯卡因進行局部麻醉,用直徑1 cm的環(huán)鉆在該區(qū)域的后底緣采取2個皮膚組織樣品,用作組織的本底樣品（t0）。采下的樣品用冰生理鹽水沖洗,液氮冷凍,-80℃冷藏保存。通過綿羊一側頸靜脈插管將L-d5苯丙氨酸灌注液緩慢注入,10 m in注完。灌注劑量為按每kg BW0.75灌注0.2 gL-苯丙氨酸（L-Phe,其中含0.027 gL-d5苯丙氨酸,純度99%）。

灌注前,從另一側頸靜脈插管采取血液樣品作為0時間點樣品。灌注開始后,分別在5（灌注中）、10（灌注后）、20、40、60及90m in采取血樣,每次采血5～10 m L。在冰浴中保存,然后在4℃條件下2 000×g離心15 m in,血漿樣品-20℃保存,供同位素Phe分析。在灌注開始后90m in,迅速放血屠宰?？焖俨扇”匙铋L肌、股二頭肌、肝臟等組織樣品,冷鹽水沖洗,液氮冷凍,-80℃保存。準確記錄組織樣品的采樣時間。準確記錄肌肉、肝臟和皮膚等各組織的重量。經(jīng)過前處理后[8],通過氣-質聯(lián)用儀（GC-MS）來測定各組織FSR及蛋白質合成量。

1.5 計算方法

1.5.1 血漿游離氨基酸庫中示蹤氨基酸的豐度（MPEp）的計算[8]

MPEp等于90m in采樣期間各采樣點MPE的加權平均值。M PE0,M PE5,…,M PE90分別代表0, 5,…,90m in的MPE值。

1.5.2 各組織FSR的計算

FSR的計算根據(jù)Lobley等[9]采用的公式計算:

MPE0和MPEt分別代表0時間點本底樣品和90 m in采集樣品中蛋白質結合的MPE值。

1.5.3 總蛋白質合成量的計算

總蛋白質合成量（g/d）=（蛋白質含量×FSR）/100

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel軟件進行整理,運用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進行One-way ANOVA分析,用Duncan氏法進行多重比較,P＜0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 瘤胃保護性亮氨酸對各組織FSR的影響

在本研究中,瘤胃保護性亮氨酸對骨骼肌FSR有顯著影響（P＜0.05）。如表3所示,3組股二頭肌FSR顯著高于1、2和4組（P＜0.05）;各試驗組背最長肌FSR與對照組比較差異顯著（P＜0.05）。各試驗組肝臟FSR與對照組比較差異均不顯著（P＞0.05）。

表3 瘤胃保護性亮氨酸對綿羊機體蛋白質合成速率的影響Table 3 Effects of the rumen-protected leucine on fractional synthesis rates of protein in sheep（%/d）

2.2 瘤胃保護性亮氨酸對各組織蛋白質含量和合成量的影響

瘤胃保護性亮氨酸對各組織蛋白質含量的影響見表4。3組股二頭肌蛋白質含量顯著高于其他各組（P＜0.05）,其他各組之間差異不顯著（P＞ 0.05）,以對照組蛋白質含量最低。3組背最長肌蛋白質含量顯著高于1組和2組（P＜0.05）,4組背最長肌蛋白質含量與對照組比較顯著提高（P＜0.05）。各組肝臟蛋白質含量差異不顯著（P＞0.05）,其中以3組最高。

表4 瘤胃保護性亮氨酸對綿羊機體蛋白質含量的影響Table 4 Effects o f the rumen-p rotected leucine on p rotein content in sheep（g）

瘤胃保護性亮氨酸對股二頭肌、背最長肌及肝臟的蛋白質合成量的影響見表5。各試驗組股二頭肌、背最長肌和肝臟的蛋白質合成量均顯著高于對照組（P＜0.05）,3組股二頭肌和背最長肌合成量顯著高于其他各組（P＜0.05）

表5 瘤胃保護性亮氨酸對綿羊機體蛋白質合成量的影響Table 5 Effects of the rumen-protected leucine on synthesis content of protein in sheep（g/d）

3 討 論

3.1 亮氨酸對骨骼肌蛋白質合成的影響

傳統(tǒng)營養(yǎng)學研究是利用生長試驗或氮平衡試驗評定動物生產(chǎn)能力和飼糧中粗蛋白質的營養(yǎng)潛力,但是始終不能滿意地解釋粗蛋白質攝入變化對機體蛋白質沉淀過程變化的影響。體蛋白質的動態(tài)平衡概念提出以后,人們對營養(yǎng)素的中間代謝才有了比較深刻的認識。作為認識體蛋白質代謝的基本理論,蛋白質的動態(tài)平衡仍然是提高動物生產(chǎn)效率、提高飼料利用率、準確評定動物營養(yǎng)需要的重要研究領域[10]。

本試驗從蛋白質周轉入手,研究亮氨酸對綿羊機體蛋白質合成的影響。蛋白質周轉受到諸如營養(yǎng)水平、激素、動物生理狀態(tài)等多種因素的影響。蛋白質周轉對飼糧的采食水平也非常敏感,而蛋白質的沉積主要與飼糧的蛋白質品質及能量攝入有關。很多研究是針對整體蛋白質周轉代謝,而整體蛋白質周轉代謝的改變并不意味著機體的所有組成部分都同樣發(fā)生改變。

Fulks等[11]研究發(fā)現(xiàn),同其他氨基酸相比,在離體培養(yǎng)的老鼠隔膜的介質里加入等同于其血清中濃度的BCAAs,包括亮氨酸、異亮氨酸與纈氨酸,可更有效地促進蛋白質的合成并抑制蛋白質的分解。而當加入介質里的BCAAs達到5倍于血清濃度（0.5 mmol/L亮氨酸、異亮氨酸或纈氨酸）時,會促進蛋白質的合成并抑制其降解。此后,Buse等[12-13]進一步研究發(fā)現(xiàn),促進老鼠半隔膜蛋白質的合成并抑制蛋白質的降解的是亮氨酸而不是異亮氨酸或纈氨酸。Libby等[5]也研究表明,對蛋白質代謝具有調節(jié)作用的支鏈氨基酸主要是亮氨酸,而異亮氨酸和纈氨酸對體內蛋白質合成和降解影響甚小。亮氨酸可能通過其氧化脫羧反應中支鏈含氧酸脫氫酶活性形式的改變,降低蛋白質的降解[5]。Tischler等[14]和Li等[15]也分別證實了亮氨酸在骨骼肌蛋白質周轉代謝中的這種作用。在本試驗中,瘤胃保護性亮氨酸對骨骼肌FSR有顯著影響,其對股二頭肌、背最長肌的蛋白質合成量也都有顯著影響,這與以上研究結果一致。

3.2 亮氨酸對肝臟蛋白質合成的影響

Libby等[5]認為,亮氨酸對肌肉中蛋白質平衡的生理調節(jié)作用類似胰島素,但亮氨酸對蛋白質的調節(jié)作用僅限于肌肉組織,對肝臟和成纖維細胞則無此效應。Lobley等[16]研究表明,肝臟FSR對迅速變化的營養(yǎng)供應反映并不敏感,提高營養(yǎng)水平對肝臟FSR無明顯影響,但隨著營養(yǎng)水平的提高,肝臟的重量和蛋白質總量增加。由于FSR無變化,提高營養(yǎng)水平時蛋白質的沉積增加,肝臟體積增大有可能是蛋白質降解率下降的結果[17]。H?ussinger等[18]研究表明,肝臟的蛋白質降解可能由肝臟細胞體積變化來調節(jié),當營養(yǎng)素和代謝產(chǎn)物濃度和量發(fā)生變化時,影響了細胞內滲透壓,進而使得肝臟細胞體積以及數(shù)量改變,肝重量和蛋白質總量也發(fā)生相應的變化。本研究中,各組肝臟蛋白質總量差異均不顯著,可能因為機體可利用氨基酸數(shù)量相對較高,導致肝臟蛋白質的降解速率下降,從而造成肝臟重量和蛋白質總量的增加。

4 結 論

①瘤胃保護性亮氨酸對綿羊骨骼肌FSR的影響顯著（P＜0.05）,但對肝臟FSR則影響不顯著（P＞0.05）。

②瘤胃保護性亮氨酸對綿羊骨骼肌及肝臟組織的蛋白質合成量顯著增加（P＜0.05）,以1.0 g/d添加量效果最好。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:sunhaizhou@china.com

（編輯 田艷明）