閔曉春 趙書民 楊德剛

生物變異是自然界普遍存在的現(xiàn)象，乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）復(fù)制活躍，且 HBV DNA聚合酶逆轉(zhuǎn)錄功能區(qū)不具備校正功能，因而具有更高的基因突變率，約為10-5核苷酸替換/位點(diǎn)/年[1]。對(duì)于未經(jīng)抗病毒治療的慢性HBV感染者，HBV在慢性持續(xù)感染過程中將可能出現(xiàn)自然變異。近年來國內(nèi)外學(xué)者采用了各種YMDD變異檢測(cè)方法，對(duì)未經(jīng)抗病毒治療的慢性HBV感染者血清進(jìn)行檢測(cè)，均發(fā)現(xiàn)體內(nèi)有著較高的YMDD自然變異株[2-4]。對(duì)于YMDD變異株相對(duì)較少的YMDD自然變異的慢性HBV患者來講，目前許多檢測(cè)方法仍存在一定的局限性。因此，確定一種特異性及靈敏性較高的檢測(cè)方法將具有重要意義。本研究選用臨床上常用的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法、單探針特異性熒光PCR技術(shù)及引物特異性熒光PCR技術(shù)進(jìn)行比較，以確定一種臨床上更具優(yōu)勢(shì)的檢測(cè)YMDD自然變異的檢測(cè)方法。

資料與方法

一、YMDD、YVDD、YIDD質(zhì)粒（以下分別簡(jiǎn)稱M、V、I質(zhì)粒）的構(gòu)建 構(gòu)建質(zhì)粒所設(shè)計(jì)引物：Y3U（上游引 物） 5’-GCCTCAGTCCGTTTCTC-3’（652-668），Y3D（下游引物） 5’-GGCAGGATAGCCACATT-3’（1052-1036），以YMDD、YVDD和YIDD陽性血清為模板（取自上海長征醫(yī)院感染科血清庫，對(duì)象均為慢性乙型肝炎患者，用S區(qū)引物熒光PCR法檢測(cè)HBV DNA均為107拷貝/ml，用包含YMDD的P基因片段的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)上海生工公司測(cè)序?yàn)?YMDD、YVDD和 YIDD變異），PCR擴(kuò)增包含YMDD的P基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提?。ò丛噭┖姓f明操作，試劑盒購自TaKaRa及上海華美生物公司），質(zhì)粒經(jīng)HindHI、EcoRI酶切鑒定，以M13（-）引物測(cè)序（上海生工生物公司）。

二、質(zhì)粒濃度的定量 抽提質(zhì)粒M、質(zhì)粒I、質(zhì)粒V用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量，根據(jù)公式換算成拷貝數(shù)；并予HBV DNA熒光定量PCR法檢測(cè)以進(jìn)一步驗(yàn)證。獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品依次梯度稀釋后供下一步實(shí)驗(yàn)使用。

三、不同比例混合的質(zhì)粒的直接測(cè)序 取I質(zhì)粒和 V 質(zhì)粒各 100μl，分別按 1：1、1：1.5、1：2、1：3、1：4、1.5：1、2：1、3：1、4：1 比例混合，各取混合液 10μl進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果依據(jù)圖型文件的比較進(jìn)行判定，序列比較采用Vector NTI Suite 7.0軟件包中的AlignX模塊完成。

四、單探針特異性熒光PCR技術(shù)的檢驗(yàn) 將構(gòu)建的M質(zhì)粒與I質(zhì)粒（分別配制成1×108copies/ml、1×107copies/ml、1×106copies/ml的質(zhì)粒溶液），按 10：1、2：1、1：1、1：2、1：5、1：10、1：50、1：100 混合，取混合液作為擴(kuò)增模板（YMDD變異檢測(cè)試劑盒購自杭州博賽基因診斷技術(shù)有限公司）。判定標(biāo)準(zhǔn)：待測(cè)樣品在檢測(cè)液A和檢測(cè)液B的熒光檢測(cè)Ct值（每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）均≤38時(shí)，該樣品為HBV YMDD野生型；當(dāng)檢測(cè)液A的熒光檢測(cè)Ct值≤38，檢測(cè)液B的熒光檢測(cè)Ct值＞38，則該樣品為HBV YMDD變異型。

五、引物特異性熒光PCR技術(shù)的檢驗(yàn) 以梯度稀釋的 V 質(zhì)粒、M 質(zhì)粒、I質(zhì)粒（均為 1×108copies/ml）為模板，采用引物特異性熒光PCR法進(jìn)行檢測(cè)。（YMDD變異檢測(cè)試劑盒購自上海復(fù)星醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司，有三個(gè)檢測(cè)管：C管、I管、V管，C管對(duì)樣本的總病毒株進(jìn)行定量，I管對(duì)YIDD變異毒株進(jìn)行定量，V管對(duì)YVDD毒株進(jìn)行定量；依據(jù)I、V管的Ct值與C管Ct值的差值來判定有無變異毒株以及與總病毒株的相對(duì)比例）

結(jié) 果

一、質(zhì)粒鑒定結(jié)果 重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定陽性，電泳觀察可見陽性條帶，目的片段與DNA Marker對(duì)比，大小約為400bp；經(jīng)測(cè)序后與HBV全基因組序列進(jìn)行比對(duì)（Vector NTI Suite 7軟件），顯示插入片段序列與預(yù)期一致。

二、質(zhì)粒濃度的定量結(jié)果 質(zhì)粒M、I、V經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量（84ng/μl、98ng/μl、99ng/μl），根據(jù)公式換算成拷貝數(shù)（2.48×1010拷貝/μl、2.89×1010拷貝/μl、2.92×1010拷貝/μl），并經(jīng)熒光定量PCR檢測(cè)后得到驗(yàn)證。

三、不同比例混合的質(zhì)粒的直接測(cè)序 不同比例（I/I+V：50%，60%，67%，75%） 混合的 I和 V 兩種質(zhì)粒，測(cè)序圖譜（圖略）rt612位出現(xiàn)T/G雜合峰（G峰逐漸降低），讀出兩種密碼子：ATT（異亮氨酸-I）及GTG（纈氨酸-V），但以I質(zhì)粒為主；當(dāng)I/I+V為80%時(shí)，G雜峰低于主峰的30%，很難與背景峰區(qū)別，不能判定混合了V質(zhì)粒。在混合質(zhì)粒（I/I+V 25%，33%，40%，50%）中，以V質(zhì)粒為主；在混合質(zhì)粒（I/I+V 20%）中，不能判定混合了I質(zhì)粒。

四、單探針特異性實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的檢驗(yàn) 檢測(cè)結(jié)果（圖略）顯示，當(dāng)野生模板與變異模板的比例為10：1時(shí)，B 檢測(cè)液的 Ct值為 23.94；當(dāng)比例為 1：1時(shí)，其Ct值為25.56；當(dāng)比例為1：10時(shí)，因?yàn)镃t值為33.11，根據(jù)判定標(biāo)準(zhǔn)（B檢測(cè)液的Ct值＞38時(shí)，可以判定為HBV YMDD變異型），此時(shí)不能判定該樣品為變異型，但實(shí)際突變模板已約占10/11；當(dāng)野生型模板與突變模板的比例為1：50時(shí)，Ct值＞40，可判定該樣品為YMDD變異型，此時(shí)突變模板已約占50/51。

五、引物特異性熒光PCR技術(shù)的檢驗(yàn) 檢測(cè)結(jié)果（圖略）顯示，當(dāng)M質(zhì)粒以I管進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際約相差三個(gè)數(shù)量級(jí)；以V管進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，約相差二個(gè)數(shù)量級(jí)；當(dāng)V質(zhì)粒以I管進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際約相差三個(gè)數(shù)量級(jí)；當(dāng)I質(zhì)粒以V管進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際約相差四個(gè)數(shù)量級(jí)。經(jīng)計(jì)算分析，當(dāng)YIDD突變株占總毒株的比例高于1/101時(shí)，I引物的非特異性結(jié)合可忽略，當(dāng)YVDD突變株占總毒株的比例高于1/11時(shí)，V引物的非特異性結(jié)合可忽略；即只要突變株占總毒株的比例高于1/11時(shí)，該技術(shù)非特異結(jié)合的影響均可忽略，此時(shí)具有很好的特異性，同時(shí)具有較高的靈敏性，檢測(cè)突變株占總毒株的最低比例可達(dá)到1/11。

討 論

近年來出現(xiàn)了多種YMDD變異的檢測(cè)技術(shù)，但在特異性及靈敏性方面存在著一定的差異。目前臨床上常用的YMDD變異檢測(cè)有PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法、單探針特異性熒光PCR法及引物特異性熒光PCR法三種技術(shù)。

直接測(cè)序法是其他檢測(cè)方法所參照的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但直接測(cè)序法往往只能檢測(cè)到優(yōu)勢(shì)株，當(dāng)變異株高于總毒株的20%時(shí)，才能檢測(cè)到[5]。本研究分析不同比例混合的質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果，當(dāng)V質(zhì)粒占總質(zhì)粒（V及I質(zhì)粒）的比例高于25%時(shí)，測(cè)序圖譜出現(xiàn)T/G雜合峰，但以YIDD為主；當(dāng)V質(zhì)粒占總質(zhì)粒的比例為20%時(shí)，測(cè)序圖譜顯示以T峰為主，另可見G雜峰，但G雜峰低于T峰高度的30%，很難與背景峰所區(qū)別，依據(jù)基因測(cè)序的常規(guī)，不能提示檢測(cè)到Y(jié)VDD突變，這與實(shí)際情況不符合。所以認(rèn)為，直接測(cè)序法能夠檢測(cè)出優(yōu)勢(shì)模板，但當(dāng)某模板占總模板的比例較低（約20%）時(shí)，則難以對(duì)該模板進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)，PCR擴(kuò)增的競(jìng)爭(zhēng)抑制作用導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)株的信號(hào)掩蓋了非優(yōu)勢(shì)株的信號(hào)，而造成檢測(cè)結(jié)果誤差。有學(xué)者[3]采用PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者在抗病毒治療前存在YMDD變異株?？寺y(cè)序法雖能檢測(cè)出相對(duì)較少的自然變異株，但要經(jīng)歷基因克隆的過程，技術(shù)難度高、檢測(cè)周期長，且挑選克隆測(cè)序時(shí)，在挑選的有限克隆內(nèi)可能不能發(fā)現(xiàn)變異株，易造成假陰性結(jié)果?？傊?，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序法適合用于核苷類藥物治療過程中出現(xiàn)的基因型耐藥檢測(cè)，即YMDD變異的“事后檢測(cè)”，但對(duì)于變異株較少的YMDD自然變異來講，該檢測(cè)方法靈敏性不夠。此外，該方法還存在著其它一些不足：一是技術(shù)要求高，費(fèi)材、費(fèi)時(shí)，不能成為臨床實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)。二是直接測(cè)序前必須進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)血清HBV的載量有一定的要求，103～104拷貝/ml的血清很難進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序。

本研究中我們采用單探針特異性熒光PCR技術(shù)檢測(cè)不同比例混合的質(zhì)粒，此方法只采用一條能與YMDD野生株互補(bǔ)的Taqman MGB探針，故只能辨別HBV是YMDD野生株或是變異株。結(jié)果顯示，當(dāng)野生型模板與突變型模板的比例為1：10時(shí)，根據(jù)檢測(cè)的Ct值不能判定該樣品為變異型，但實(shí)際突變模板已約占10/11；當(dāng)比例為1：50時(shí)，才可以判定該樣品為YMDD變異型，此時(shí)突變模板已約占50/51。由此可見，本方法可用于HBV DNA的YMDD突變檢測(cè)，但只能認(rèn)為適合于YMDD變異株已成為明顯優(yōu)勢(shì)株的患者，對(duì)于YMDD變異株較少的YMDD自然變異，該方法靈敏性明顯不夠，且不能確定突變株的類型。季秀玲等[6]采用與YMDD野生株互補(bǔ)的Taqman MGB探針對(duì)47例正予拉米夫定治療的患者進(jìn)行YMDD變異檢測(cè)，結(jié)果有19例為變異株；由于此法靈敏度的不足，不能排除檢測(cè)的假陰性。目前市場(chǎng)上針對(duì)HBV YMDD變異檢測(cè)的試劑盒多為單探針型，僅采用檢測(cè)YMDD野生株的探針，可以基本滿足拉米夫定等核苷類藥物使用過程中基因耐藥監(jiān)測(cè)的需用。如果采用檢測(cè)YMDD突變株的探針，可以提高YMDD變異株檢測(cè)的靈敏度；分別設(shè)計(jì)針對(duì)YMDD野生株、YIDD及YVDD突變株的探針，根據(jù)相應(yīng)的Ct值來判定突變株的存在。Cane等[7]設(shè)計(jì)了4條探針，1條上游探針的3′端標(biāo)記熒光素；3條下游探針的5′端標(biāo)記另一種熒光素，分別與YMDD、YVDD和YIDD序列相匹配，通過與直接測(cè)序的結(jié)果比較，顯示兩種方法的靈敏度及特異性相接近。Malmstrom S等[8]采用此方法檢測(cè)拉米夫定治療的患者，檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序法及RFLP法基本一致。此方法快速方便，但設(shè)計(jì)多條探針，成本明顯加大，并且檢測(cè)結(jié)果還會(huì)受到探針非特異性結(jié)合及PCR競(jìng)爭(zhēng)抑制的影響。因此，出于監(jiān)測(cè)核苷類藥物治療過程中YMDD變異的目的，市場(chǎng)上目前僅有單探針特異性的熒光PCR技術(shù)的商品試劑盒。

引物特異性熒光PCR技術(shù)是根據(jù)待測(cè)位點(diǎn)的堿基分別設(shè)計(jì)與野生模板或變異模板結(jié)合的引物的，在該技術(shù)特異性的驗(yàn)證過程中發(fā)現(xiàn)，特異性引物會(huì)優(yōu)先結(jié)合到完全互補(bǔ)的堿基上，但也會(huì)結(jié)合到不完全互補(bǔ)的堿基上。在檢測(cè)混合模板時(shí)，I管中I引物3’末端的堿基（ATT）將優(yōu)先結(jié)合YIDD突變株序列上的TAA三個(gè)堿基，同時(shí)也會(huì)結(jié)合YMDD野生株序列上的TAC堿基及YVDD突變株序列上的CAC堿基，只是存在著結(jié)合程度的差異。通過我們的實(shí)驗(yàn)可確定不同引物結(jié)合程度上量的差異，經(jīng)計(jì)算分析，當(dāng)突變株占總毒株的比例高于1/11時(shí)，該技術(shù)非特異結(jié)合的影響可忽略，此時(shí)具有很好的特異性，同時(shí)檢測(cè)模板所占總模板的最低比例可達(dá)到1/11，因此適合用于YMDD變異株較少的YMDD自然變異的檢測(cè)。進(jìn)一步通過確定相應(yīng)的ΔCt，能夠?qū)ψ儺惗局赀M(jìn)行相對(duì)定量。Shi M等[9]采用引物特異性熒光PCR技術(shù)對(duì)98例從未予抗病毒治療的乙型肝炎患者檢測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5例檢測(cè)出YMDD變異株，變異株占野生株的比例皆在10%～20%?；艏t等[10]采用該方法對(duì)183例近半年來未經(jīng)抗病毒治療的慢性乙型肝炎患者進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果示有21例存在YMDD自然變異毒株，其中變異株低于50%者占95.24%（20/21）。由此可見，引物特異性PCR技術(shù)適合用于檢測(cè)YMDD變異株較少的YMDD自然變異。另外INNO-LiPA方法在國外已獲準(zhǔn)應(yīng)用于臨床檢測(cè)[11]，該法靈敏度較高，可檢測(cè)出樣品中5%～10%的變異株[12]，但儀器、試劑價(jià)格昂貴，國內(nèi)尚難廣泛用于臨床檢測(cè)。

需要指出的是，受本檢測(cè)方法對(duì)變異毒株檢出效能的限制，只有變異毒株超過總毒株量約1/11時(shí)，才能準(zhǔn)確地給予變異株相對(duì)定量。因此，通過改善該技術(shù)的特異性，從而可進(jìn)一步提高其靈敏性，以提高YMDD自然變異檢出率。由于YIDD變異還有兩種少見變異類型，實(shí)際檢測(cè)中會(huì)出現(xiàn)此型的漏檢，因此在檢測(cè)系統(tǒng)中補(bǔ)充這兩種變異類型的檢測(cè)將會(huì)使該方法更加完美。

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