劉 霞，李宗軍*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實驗室，湖南 長沙 410128)

SPR傳感器在食品微生物檢測中的應(yīng)用

劉 霞，李宗軍*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實驗室，湖南 長沙 410128)

表面等離子體子共振 (SPR)是一種新興的現(xiàn)代分析技術(shù)，它不僅可以實時監(jiān)測分子間相互作用，還可以準(zhǔn)確、靈敏、快速、簡便的檢測出各種生化指標(biāo)。利用SPR檢測食品中的微生物是近年來興起的一個熱門課題。本文簡單介紹了SPR的基本原理，綜述了SPR在食品微生物中應(yīng)用的研究進(jìn)展。

表面等離子體子共振；生物傳感器；食品中微生物；檢測

表面等離子體子共振 (surface plasmon resonance，SPR)是一種基于物質(zhì)折射率變化的動態(tài)﹑無標(biāo)記的現(xiàn)代檢測手段，具有高識別性、高靈敏性、快速、原位(無需標(biāo)記)、便捷、實時、芯片可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞信號傳導(dǎo)、受體配體、癌癥研究和新藥篩選等生命科學(xué)領(lǐng)域[1-3]。近年已出現(xiàn)了多種模式的SPR分析儀，其樣品池由單通道發(fā)展到多通道，檢測方式由點(diǎn)檢測發(fā)展到成像(表面等離子共振成像，SPRI)檢測，應(yīng)用范圍也由生命科學(xué)領(lǐng)域擴(kuò)展到食品、環(huán)境、材料等領(lǐng)域。目前，SPR已成功的測定食品中營養(yǎng)物、細(xì)菌和真菌、藥物殘留等物質(zhì)，隨著食源性疾病的頻繁爆發(fā)，各種食源性致病菌及其毒素已成為SPR檢測的主要目標(biāo)[4]。

1SPR基本原理

SPR檢測是一種利用表面等離子體波(surface plasmon wave，SPW)進(jìn)行檢測的技術(shù)。表面等離子體(SP)是沿著金屬和電介質(zhì)間界面?zhèn)鞑サ碾姶挪ㄐ纬傻摹．?dāng)平行表面的偏振光以稱之為表面等離子體共振角入射在界面上發(fā)生衰減全反射時，入射光被耦合入表面等離子體內(nèi)，光能大量被吸收，在這個角度上由于表面等離子體共振引起界面反射光顯著減少。由于SPR對金屬表面電介質(zhì)的折射率非常敏感，不同電介質(zhì)其表面等離子體共振角不同。同種電介質(zhì)附在金屬表面的量不同，則SPR的響應(yīng)強(qiáng)度不同?；谶@種原理的生物傳感器通常將一種具特異識別屬性的分子即配體固定于金屬膜表面，監(jiān)控溶液中的被分析物與該配體的結(jié)合過程。在復(fù)合物形成或解離過程中，金屬膜表面溶液的折射率發(fā)生變化，隨即被SPR生物傳感器檢測出來。

2 SPR在食品微生物檢測中的應(yīng)用

近年來，隨著國內(nèi)外口蹄疫、瘋牛病、禽流感、“瘦肉精”等重大食品安全事故的相繼爆發(fā)，食品安全問題已成了全球關(guān)注的焦點(diǎn)，特別是食源性致病菌導(dǎo)致的食源性疾病已是當(dāng)代全球食品安全面臨的巨大威脅。食品的安全問題不僅直接關(guān)系到人類的健康生存，

也嚴(yán)重影響到經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和社會的穩(wěn)定。傳統(tǒng)檢測微生物的方法操作繁瑣、耗時，已不再適應(yīng)現(xiàn)代社會發(fā)展的需要，SPR生物傳感器為解決這一問題提供了新的技術(shù)平臺。

2.1 細(xì)菌病原體

2.1.1 大腸桿菌O157∶H7(Escherichia coli O157∶H7，E. coli O157∶H7)

自1998年Fratamico等[5]應(yīng)用SPR生物傳感器檢測了大腸桿菌O157∶H7之后，許多研究報道了E.coli O157∶H7的SPR檢測。Oh等[6]將E.coli O157∶H7的單克隆抗體固定在蛋白G修飾的商業(yè)化SPR傳感器芯片表面，直接檢測E.coli O157∶H7的檢測限為104cells/mL。隨后，他們將同樣的抗體固定在巰基烷烴修飾的傳感器芯片表面，使用同樣的儀器直接檢測E.coli O157∶H7的檢測限可達(dá)到102cells/mL[7]。Taylor等[8]應(yīng)用波長檢測型SPR傳感器研究了芯片表面不同修飾方法對傳感器性能的影響，將單克隆抗體固定在巰基烷烴修飾并氨基偶聯(lián)化后的芯片表面，引入含有E.coli O157∶H7的溶液，然后再引入多克隆抗體作為二抗，分別檢測了細(xì)胞溶解后的細(xì)菌、熱處理的細(xì)菌和未處理的細(xì)菌，其檢測限分別為1 04、105、106CFU/mL。Meeusen等[9]報道了應(yīng)用Spreeta SPR傳感器檢測E.coli O157∶H7，將生物素化的E.coli O157∶H7多克隆抗體固定在親和素修飾的芯片表面，檢測E. coli O157∶H7可達(dá)到8.7×106CFU/mL，耗時35min。葛晶等[10]利用大腸桿菌抗體的免疫吸附反應(yīng)，使用集成化手持式Spreeta SPR傳感器快速檢測大腸桿菌E.Coli O157∶H7，采用親和素-生物素系統(tǒng)放大檢測的響應(yīng)信號，并引入復(fù)合抗體作為二次抗體，使該傳感器對大腸桿菌的檢測限由106CFU/mL下降到105CFU/mL。

Taylor等[11]應(yīng)用多通道的波長檢測型SPR傳感器，采用三明治的方法檢測了蘋果汁中的E.coli O157∶H7。他們首先在傳感器芯片表面修飾了乙烯基乙二醇的巰基烷烴，將其生物素化后，引入鏈霉親和素，讓其與芯片表面的生物素充分結(jié)合后，再將生物素化的E.coli O157∶H7多克隆抗體固定在芯片表面，分別檢測了緩沖液、4種細(xì)菌的混合液及蘋果汁中的E.coli O157∶H7。此外，他們還研究了蘋果汁的pH值對傳感器信號的影響，研究結(jié)果表明，蘋果汁的pH值為7.4時的SPR信號比pH值為3.7的SPR信號強(qiáng)，在pH7.4的緩沖液和蘋果汁中檢測E.coli O157∶H7的檢測限為1.4×104CFU/mL。Waswa等[12-13]分別應(yīng)用Biacore 2000和便攜式Spreeta SPR傳感器檢測了E.coli O157∶H7。先將Biacore 2000的芯片表面自組裝一層羧甲基葡聚糖，將其氨基偶聯(lián)化，再引入蛋白A，然后將E.coli O157∶H7抗體流經(jīng)傳感器表面，與蛋白A結(jié)合，使其固定在傳感器芯片表面，直接檢測巴氏消毒牛奶中的E.coli O157∶H7，檢測限為25CFU/mL[12]；而應(yīng)用Spreeta傳感器，則將生物素化的E.coli O157∶H7抗體固定在親和素修飾的芯片表面，檢測牛奶、蘋果汁和牛肉中E.coli O157∶H7的范圍均在102～103CFU/mL[13]。Joung等[14]采用肽氨酸提高靈敏度的方法檢測了大腸桿菌O157∶H7的16S rRNA。

2.1.2 沙門氏菌(Salmonella enteritidis，S. enteritidis)

2001年，Koubova等[15]報道了應(yīng)用波長檢測型SPR傳感器檢測S.enteritidis。將S.enteritidis抗體固定在戊二醛交聯(lián)的芯片表面，直接檢測了熱處理和乙醇浸泡過的S.enteritidis，其檢測限為106CFU/mL。Oh等[16]使用商業(yè)化的SPR傳感器檢測了鼠傷寒沙門氏菌，先在芯片表面自組裝了一層巰基烷烴，再將蛋白G固定在傳感器表面，然后將鼠傷寒沙門氏菌抗體固定在芯片表面，直接檢測鼠傷寒沙門氏菌的檢測限為102CFU/mL。隨后，他們使用同樣的儀器和同樣的方法檢測了副傷寒沙門氏菌，檢測限也為102CFU/mL[17]。王凱等[18]使用集成化手持式SpreetaTMSPR傳感器快速檢測沙門氏菌，他們利用親和素-生物素系統(tǒng)保證檢測的準(zhǔn)確性；利用沙門氏菌抗體的免疫吸附反應(yīng)，保證結(jié)果的特異性；并引入復(fù)合抗體作為第二抗體以擴(kuò)大檢測的響應(yīng)信號，檢測到鼠傷寒沙門氏菌的濃度為105CFU/mL，耗時1h。

Waswa等[12]應(yīng)用Biacore 2000SPR傳感器檢測了牛奶中S.enteritidis。先將傳感器的芯片表面自組裝一層羧甲基葡聚糖，將其氨基偶聯(lián)化，再引入蛋白A，然后將S.enteritidis抗體流經(jīng)傳感器表面，與蛋白A結(jié)合，使其固定在傳感器芯片表面，直接檢測巴氏消毒的牛奶中的S.enteritidis，檢測限為23CFU/mL。2007年，Mazumdar等[19]也報道了用商業(yè)化的SPR儀器，采用三明治的方法檢測牛奶中的沙門氏菌。先將其多克隆抗體固定在硅烷修飾的憎水芯片表面，再將感染了鼠傷寒沙門氏菌的牛奶流經(jīng)傳感器芯片，培育15min，然后再將二抗流經(jīng)傳感器芯片進(jìn)行檢測，其檢測限為105cells/mL。最近，Mazumdar等[20]應(yīng)用SPR直接檢測了被沙門氏菌污染的豬血清，其檢測下限為67.5μg/mL。

2.1.3 單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，L. monocytogenes)

Koubova等[15]報道了L. monocytogenes的SPR檢測，他們應(yīng)用的是波長檢測型SPR傳感器。將L.monocytogenes的抗體固定在戊二醛交聯(lián)的芯片表面，直接檢測了熱處理的L. monocytogenes，檢測限為107cells/mL。Leonard等[21]則用B i a c o r e 3 0 0 0，采用競爭模式檢測了L.monocytogenes。他們先將多克隆抗羊抗體固定在經(jīng)過氨基偶聯(lián)的羧甲基葡聚糖修飾的芯片表面，并將已知濃度的L.monocytogenes和兔抗李斯特菌的抗體混合培育一段時間，讓其充分結(jié)合后，離心將細(xì)胞-抗體復(fù)合物與

自由的抗體分離，將含有自由抗體的溶液流經(jīng)SPR芯片進(jìn)行檢測，其檢測限可達(dá)到105cells/mL。Taylor等[11]應(yīng)用多通道的波長檢測型S P R，檢測了蘋果汁中的L. monocytogenes。檢測方法與他們檢測E.coli O157∶H7的相同，在p H 7.4的緩沖液和蘋果汁中檢測L. monocytogenes的檢測限大約為3×103CFU/mL。

2.1.4 空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni，C. jejuni)

Taylor等[11]應(yīng)用多通道的波長檢測型SPR，檢測了蘋果汁中的L.monocytogenes。檢測方法與他們檢測E.coli O157∶H7的相同，在pH7.4的緩沖液和蘋果汁中檢測L.monocytogenes的檢測限分別為1×105CFU/mL和5×104CFU/mL。

2.1.5 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus a ureus，S. aureus)

2006年，Subramanian等[22]使用SR 7000，采用直接法和三明治法檢測了S. aureus，檢測限分別為107CFU/mL和105CFU/mL。Balasubramainan等[23]則使用溶解性噬菌體作為生物識別元素檢測了S.aureus。將噬菌體吸附在Spreeta SPR傳感器芯片表面，直接檢測S.aureus的檢測限為104CFU/mL。

2.1.6 結(jié)腸炎耶爾森桿菌(Yersinia enterocolitica，Y. enterocolitica)

Oh等[24]報道了Y. enterocolitica的SPR檢測。他們先在傳感器芯片表面自組裝了巰基烷烴，再將蛋白G偶聯(lián)在巰基烷烴表面，然后將Y. enterocolitica的單克隆抗體固定在傳感器芯片表面，檢測Y. enterocolitica的檢測限為102CFU/mL。

2.1.7 霍亂弧菌(Vibrio cholerae)

Jyoung等[25]同樣用檢測Y. enterocolitica的儀器和方法檢測了霍亂弧菌O 1，在緩沖液中的檢測限為4× 105CFU/mL。

2.2 寄生蟲(Protozoan parasite)

2006年，Kang等[26]報道了隱孢子蟲卵囊的SPR檢測。他們將Biacore 2000傳感器芯片表面組裝了一層巰基烷烴，并將鏈霉親和素偶聯(lián)在其表面，然后將生物素化的隱孢子蟲卵囊單克隆抗體固定在傳感器表面，在緩沖液中檢測隱孢子蟲卵囊的檢測限為106卵囊/mL。

2.3 真菌病原體(Fungal pathogen)

Zezza等[27]應(yīng)用Biacore X，采用DNA雜交的方法檢測了小麥中的大刀鐮刀菌(Fusarium culmorum)。從樣品中提取出含有Fusarium culmorum的特異性DNA片段，擴(kuò)增后，注入固定有與其互補(bǔ)的DNA序列的傳感器芯片表面，進(jìn)行檢測，其檢測限為0.25ng/μL。在30ng硬質(zhì)小麥中，最小可檢測出特異性Fusarium culmorum DNA 0.06pg。

2.4 毒素(Toxins)

在食品安全中涉及到的毒素主要是由細(xì)菌、真菌和藻類產(chǎn)生的。

2.4.1 葡萄球菌腸毒素B(Staphylococcal enterotoxin B，SEB)

2000年，Nedelkov等[28-29]應(yīng)用Biacore X，采用直接法檢測了SEB。將SEB抗體固定在經(jīng)過氨基偶聯(lián)后的羧甲基葡聚糖修飾的芯片表面，直接檢測了牛奶和蘑菇中的SEB，檢測限可達(dá)到1ng/mL。隨后，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測了同樣的樣品，其結(jié)果與SPR結(jié)果一致。2002年，Slavík等[30]使用光纖SPR傳感器檢測了SEB，他們將SEB抗體吸附在戊二醛交聯(lián)的芯片表面，直接檢測緩沖液中的SEB，檢測限為10ng/mL。Homola等[31]使用波長檢測型SPR傳感器檢測了緩沖液和牛奶中的SEB，將多克隆SEB抗體固定在經(jīng)過氨基偶聯(lián)的巰基烷烴修飾的芯片表面，在緩沖液直接檢測SEB的檢測限為5ng/mL，三明治法檢測緩沖液和牛奶中SEB的檢測限為0.5ng/mL。2003年，Medina等[32]應(yīng)用競爭模式檢測了SEB，將SEB固定在傳感器芯片表面，含有SEB的樣品和已知濃度的SEB抗體培育20～30min，離心分離，將上層液(未結(jié)合的抗體)流經(jīng)傳感器進(jìn)行分析檢測，在牛奶中的檢測限為0.3ng/mL。檢測一個樣品僅需要15min。

2.4.2 葡萄球菌腸毒素A(Staphylococcal enterotoxin A，SEA)

Medina等[33]應(yīng)用Biacore 1000，采用競爭的實驗方法檢測了生雞蛋中的SEA。首先將SEA固定在經(jīng)過氨基偶聯(lián)的羧甲基葡聚糖修飾的芯片表面，將生雞蛋溶液混合均勻后離心，取其上清液并加入SEA抗體，待其與樣品中的SEA充分結(jié)合后離心分離，將上層液(未結(jié)合的抗體)注入傳感器芯片，使用這樣的方法，在整個雞蛋中檢測SEA的檢測限為1ng/mL。

2.4.3 軟骨藻酸(domoic acid，DA)

Lotierzo等[34]應(yīng)用Biacore 3000檢測了DA，將分子印跡聚合物光接枝在芯片表面作為識別元素，以競爭的實驗方法檢測了DA，在緩沖液中的檢測限為5ng/mL。2005年，Yu等[35]應(yīng)用SPR傳感器檢測了DA，他們在緩沖液中的檢測限為0.1ng/mL。Traynor等[36]報道了貝類提取物中DA的SPR檢測，他們將DA固定在經(jīng)過氨基偶聯(lián)的羧甲基葡聚糖修飾的芯片表面，以競爭的實驗方法檢測了蚌類、牡蠣和小貝殼中的DA，檢測限分別為1、4.9μg/g和7μg/g。Stevens等[37]應(yīng)用便攜式的Spreeta 2000傳感器檢測了DA，將多克隆DA抗體固定在縮氨酸修飾的芯片表面，檢測緩沖液和蛤俐中的DA，檢測限為3ng/mL。

2.4.4黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1)

2000年，Daly等[38]成功的應(yīng)用Biacore 1000檢測了aflatoxin B1，aflatoxin B1被固定在經(jīng)過氨基偶聯(lián)的羧甲基葡聚糖修飾的芯片表面，以競爭的實驗方法進(jìn)行檢測，在緩沖液中的檢測限為3ng/mL。Dunne等[39]使用單鏈抗體(scFvs)作為識別元素檢測了aflatoxin B1，對于單體scFvs和二聚體scFvs作為生物識別元素，在緩沖液中的檢測限分別為375pg/mL和190pg/mL。

2.4.5 脫氧雪腐鐮刀菌醇(deoxynivalenol)

deoxynivalenol 是由鐮刀菌霉產(chǎn)生的具有強(qiáng)毒性的真菌代謝物。Tüdos等[40]成功的應(yīng)用Biacore Q檢測了緩沖液和小麥中的deoxynivalenol，將deoxynivalenol與酪蛋白偶合之后被固定在經(jīng)過氨基偶聯(lián)的羧甲基葡聚糖修飾的芯片表面，deoxynivalenol與其過量的抗體混合并培育一段時間后，流經(jīng)傳感器表面進(jìn)行檢測，在緩沖液中的檢測限為2.5ng/mL，其檢測結(jié)果與液-質(zhì)聯(lián)機(jī)檢測的結(jié)果一致。

3 展 望

SPR生物傳感器經(jīng)過20多年的發(fā)展，已成為生化分析中備受矚目的研究分析工具。近幾年，隨著分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)的不斷突破和儀器自身結(jié)構(gòu)的不斷改進(jìn)，SPR生物傳感器在食品微生物的應(yīng)用前景將更為廣闊。各種單克隆抗體的不斷問世，為SPR生物傳感器敏感膜的多樣性提供了可能。通過利用固定有不同單克隆抗體的SPR生物傳感器，食品中各種微生物的鑒定及其含量的測定等都將成為現(xiàn)實。

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Application of SPR Biosensor in the Detection of Food Microorganisms：A Review

LIU Xia，LI Zong-jun*
(Key Laboratory of Food Science and Biotechnology of Hunan Province, College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Surface plasma resonance (SPR) is one of modern analytical techniques and can be used for monitoring inter-molecular interaction in real time. In addition, it can also be applied to detect biochemical parameters in an accurate, fast and convenient manner. Moreover, the detection of food microorganisms using SPR has been attracted extensive attentions in recent years. Current progresses in the detection of food microorganisms through SPR technique has been reviewed in this paper.

surface plasma resonance；biosensor；food microorganism；detection

Q93-332

A

1002-6630(2010)09-0301-05

2009-07-30

國家“863”計劃重點(diǎn)項目(2008AA10081)；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才基金項目(08YJ07)

劉霞(1976—)，女，副教授，博士，研究方向為食品分析、食品生物技術(shù)。E-mail：liuxia608@gmail.com

*通信作者：李宗軍(1968—)，男，教授，博士，研究方向為食品微生物學(xué)。E-mail：lizongjun@yahoo.com.cn