劉 霞，李宗軍*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

SPR傳感器在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

劉 霞，李宗軍*

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

表面等離子體子共振 (SPR)是一種新興的現(xiàn)代分析技術(shù)，它不僅可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子間相互作用，還可以準(zhǔn)確、靈敏、快速、簡(jiǎn)便的檢測(cè)出各種生化指標(biāo)。利用SPR檢測(cè)食品中的微生物是近年來興起的一個(gè)熱門課題。本文簡(jiǎn)單介紹了SPR的基本原理，綜述了SPR在食品微生物中應(yīng)用的研究進(jìn)展。

表面等離子體子共振；生物傳感器；食品中微生物；檢測(cè)

表面等離子體子共振 (surface plasmon resonance，SPR)是一種基于物質(zhì)折射率變化的動(dòng)態(tài)﹑無標(biāo)記的現(xiàn)代檢測(cè)手段，具有高識(shí)別性、高靈敏性、快速、原位(無需標(biāo)記)、便捷、實(shí)時(shí)、芯片可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、受體配體、癌癥研究和新藥篩選等生命科學(xué)領(lǐng)域[1-3]。近年已出現(xiàn)了多種模式的SPR分析儀，其樣品池由單通道發(fā)展到多通道，檢測(cè)方式由點(diǎn)檢測(cè)發(fā)展到成像(表面等離子共振成像，SPRI)檢測(cè)，應(yīng)用范圍也由生命科學(xué)領(lǐng)域擴(kuò)展到食品、環(huán)境、材料等領(lǐng)域。目前，SPR已成功的測(cè)定食品中營(yíng)養(yǎng)物、細(xì)菌和真菌、藥物殘留等物質(zhì)，隨著食源性疾病的頻繁爆發(fā)，各種食源性致病菌及其毒素已成為SPR檢測(cè)的主要目標(biāo)[4]。

1SPR基本原理

SPR檢測(cè)是一種利用表面等離子體波(surface plasmon wave，SPW)進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。表面等離子體(SP)是沿著金屬和電介質(zhì)間界面?zhèn)鞑サ碾姶挪ㄐ纬傻?。?dāng)平行表面的偏振光以稱之為表面等離子體共振角入射在界面上發(fā)生衰減全反射時(shí)，入射光被耦合入表面等離子體內(nèi)，光能大量被吸收，在這個(gè)角度上由于表面等離子體共振引起界面反射光顯著減少。由于SPR對(duì)金屬表面電介質(zhì)的折射率非常敏感，不同電介質(zhì)其表面等離子體共振角不同。同種電介質(zhì)附在金屬表面的量不同，則SPR的響應(yīng)強(qiáng)度不同。基于這種原理的生物傳感器通常將一種具特異識(shí)別屬性的分子即配體固定于金屬膜表面，監(jiān)控溶液中的被分析物與該配體的結(jié)合過程。在復(fù)合物形成或解離過程中，金屬膜表面溶液的折射率發(fā)生變化，隨即被SPR生物傳感器檢測(cè)出來。

2 SPR在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用

近年來，隨著國(guó)內(nèi)外口蹄疫、瘋牛病、禽流感、“瘦肉精”等重大食品安全事故的相繼爆發(fā)，食品安全問題已成了全球關(guān)注的焦點(diǎn)，特別是食源性致病菌導(dǎo)致的食源性疾病已是當(dāng)代全球食品安全面臨的巨大威脅。食品的安全問題不僅直接關(guān)系到人類的健康生存，

也嚴(yán)重影響到經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和社會(huì)的穩(wěn)定。傳統(tǒng)檢測(cè)微生物的方法操作繁瑣、耗時(shí)，已不再適應(yīng)現(xiàn)代社會(huì)發(fā)展的需要，SPR生物傳感器為解決這一問題提供了新的技術(shù)平臺(tái)。

2.1 細(xì)菌病原體

2.1.1 大腸桿菌O157∶H7(Escherichia coli O157∶H7，E. coli O157∶H7)

自1998年Fratamico等[5]應(yīng)用SPR生物傳感器檢測(cè)了大腸桿菌O157∶H7之后，許多研究報(bào)道了E.coli O157∶H7的SPR檢測(cè)。Oh等[6]將E.coli O157∶H7的單克隆抗體固定在蛋白G修飾的商業(yè)化SPR傳感器芯片表面，直接檢測(cè)E.coli O157∶H7的檢測(cè)限為104cells/mL。隨后，他們將同樣的抗體固定在巰基烷烴修飾的傳感器芯片表面，使用同樣的儀器直接檢測(cè)E.coli O157∶H7的檢測(cè)限可達(dá)到102cells/mL[7]。Taylor等[8]應(yīng)用波長(zhǎng)檢測(cè)型SPR傳感器研究了芯片表面不同修飾方法對(duì)傳感器性能的影響，將單克隆抗體固定在巰基烷烴修飾并氨基偶聯(lián)化后的芯片表面，引入含有E.coli O157∶H7的溶液，然后再引入多克隆抗體作為二抗，分別檢測(cè)了細(xì)胞溶解后的細(xì)菌、熱處理的細(xì)菌和未處理的細(xì)菌，其檢測(cè)限分別為1 04、105、106CFU/mL。Meeusen等[9]報(bào)道了應(yīng)用Spreeta SPR傳感器檢測(cè)E.coli O157∶H7，將生物素化的E.coli O157∶H7多克隆抗體固定在親和素修飾的芯片表面，檢測(cè)E. coli O157∶H7可達(dá)到8.7×106CFU/mL，耗時(shí)35min。葛晶等[10]利用大腸桿菌抗體的免疫吸附反應(yīng)，使用集成化手持式Spreeta SPR傳感器快速檢測(cè)大腸桿菌E.Coli O157∶H7，采用親和素-生物素系統(tǒng)放大檢測(cè)的響應(yīng)信號(hào)，并引入復(fù)合抗體作為二次抗體，使該傳感器對(duì)大腸桿菌的檢測(cè)限由106CFU/mL下降到105CFU/mL。

Taylor等[11]應(yīng)用多通道的波長(zhǎng)檢測(cè)型SPR傳感器，采用三明治的方法檢測(cè)了蘋果汁中的E.coli O157∶H7。他們首先在傳感器芯片表面修飾了乙烯基乙二醇的巰基烷烴，將其生物素化后，引入鏈霉親和素，讓其與芯片表面的生物素充分結(jié)合后，再將生物素化的E.coli O157∶H7多克隆抗體固定在芯片表面，分別檢測(cè)了緩沖液、4種細(xì)菌的混合液及蘋果汁中的E.coli O157∶H7。此外，他們還研究了蘋果汁的pH值對(duì)傳感器信號(hào)的影響，研究結(jié)果表明，蘋果汁的pH值為7.4時(shí)的SPR信號(hào)比pH值為3.7的SPR信號(hào)強(qiáng)，在pH7.4的緩沖液和蘋果汁中檢測(cè)E.coli O157∶H7的檢測(cè)限為1.4×104CFU/mL。Waswa等[12-13]分別應(yīng)用Biacore 2000和便攜式Spreeta SPR傳感器檢測(cè)了E.coli O157∶H7。先將Biacore 2000的芯片表面自組裝一層羧甲基葡聚糖，將其氨基偶聯(lián)化，再引入蛋白A，然后將E.coli O157∶H7抗體流經(jīng)傳感器表面，與蛋白A結(jié)合，使其固定在傳感器芯片表面，直接檢測(cè)巴氏消毒牛奶中的E.coli O157∶H7，檢測(cè)限為25CFU/mL[12]；而應(yīng)用Spreeta傳感器，則將生物素化的E.coli O157∶H7抗體固定在親和素修飾的芯片表面，檢測(cè)牛奶、蘋果汁和牛肉中E.coli O157∶H7的范圍均在102～103CFU/mL[13]。Joung等[14]采用肽氨酸提高靈敏度的方法檢測(cè)了大腸桿菌O157∶H7的16S rRNA。

2.1.2 沙門氏菌(Salmonella enteritidis，S. enteritidis)

2001年，Koubova等[15]報(bào)道了應(yīng)用波長(zhǎng)檢測(cè)型SPR傳感器檢測(cè)S.enteritidis。將S.enteritidis抗體固定在戊二醛交聯(lián)的芯片表面，直接檢測(cè)了熱處理和乙醇浸泡過的S.enteritidis，其檢測(cè)限為106CFU/mL。Oh等[16]使用商業(yè)化的SPR傳感器檢測(cè)了鼠傷寒沙門氏菌，先在芯片表面自組裝了一層巰基烷烴，再將蛋白G固定在傳感器表面，然后將鼠傷寒沙門氏菌抗體固定在芯片表面，直接檢測(cè)鼠傷寒沙門氏菌的檢測(cè)限為102CFU/mL。隨后，他們使用同樣的儀器和同樣的方法檢測(cè)了副傷寒沙門氏菌，檢測(cè)限也為102CFU/mL[17]。王凱等[18]使用集成化手持式SpreetaTMSPR傳感器快速檢測(cè)沙門氏菌，他們利用親和素-生物素系統(tǒng)保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性；利用沙門氏菌抗體的免疫吸附反應(yīng)，保證結(jié)果的特異性；并引入復(fù)合抗體作為第二抗體以擴(kuò)大檢測(cè)的響應(yīng)信號(hào)，檢測(cè)到鼠傷寒沙門氏菌的濃度為105CFU/mL，耗時(shí)1h。

Waswa等[12]應(yīng)用Biacore 2000SPR傳感器檢測(cè)了牛奶中S.enteritidis。先將傳感器的芯片表面自組裝一層羧甲基葡聚糖，將其氨基偶聯(lián)化，再引入蛋白A，然后將S.enteritidis抗體流經(jīng)傳感器表面，與蛋白A結(jié)合，使其固定在傳感器芯片表面，直接檢測(cè)巴氏消毒的牛奶中的S.enteritidis，檢測(cè)限為23CFU/mL。2007年，Mazumdar等[19]也報(bào)道了用商業(yè)化的SPR儀器，采用三明治的方法檢測(cè)牛奶中的沙門氏菌。先將其多克隆抗體固定在硅烷修飾的憎水芯片表面，再將感染了鼠傷寒沙門氏菌的牛奶流經(jīng)傳感器芯片，培育15min，然后再將二抗流經(jīng)傳感器芯片進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)限為105cells/mL。最近，Mazumdar等[20]應(yīng)用SPR直接檢測(cè)了被沙門氏菌污染的豬血清，其檢測(cè)下限為67.5μg/mL。

2.1.3 單核細(xì)胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes，L. monocytogenes)

Koubova等[15]報(bào)道了L. monocytogenes的SPR檢測(cè)，他們應(yīng)用的是波長(zhǎng)檢測(cè)型SPR傳感器。將L.monocytogenes的抗體固定在戊二醛交聯(lián)的芯片表面，直接檢測(cè)了熱處理的L. monocytogenes，檢測(cè)限為107cells/mL。Leonard等[21]則用B i a c o r e 3 0 0 0，采用競(jìng)爭(zhēng)模式檢測(cè)了L.monocytogenes。他們先將多克隆抗羊抗體固定在經(jīng)過氨基偶聯(lián)的羧甲基葡聚糖修飾的芯片表面，并將已知濃度的L.monocytogenes和兔抗李斯特菌的抗體混合培育一段時(shí)間，讓其充分結(jié)合后，離心將細(xì)胞-抗體復(fù)合物與

自由的抗體分離，將含有自由抗體的溶液流經(jīng)SPR芯片進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)限可達(dá)到105cells/mL。Taylor等[11]應(yīng)用多通道的波長(zhǎng)檢測(cè)型S P R，檢測(cè)了蘋果汁中的L. monocytogenes。檢測(cè)方法與他們檢測(cè)E.coli O157∶H7的相同，在p H 7.4的緩沖液和蘋果汁中檢測(cè)L. monocytogenes的檢測(cè)限大約為3×103CFU/mL。

2.1.4 空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni，C. jejuni)

Taylor等[11]應(yīng)用多通道的波長(zhǎng)檢測(cè)型SPR，檢測(cè)了蘋果汁中的L.monocytogenes。檢測(cè)方法與他們檢測(cè)E.coli O157∶H7的相同，在pH7.4的緩沖液和蘋果汁中檢測(cè)L.monocytogenes的檢測(cè)限分別為1×105CFU/mL和5×104CFU/mL。

2.1.5 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus a ureus，S. aureus)

2006年，Subramanian等[22]使用SR 7000，采用直接法和三明治法檢測(cè)了S. aureus，檢測(cè)限分別為107CFU/mL和105CFU/mL。Balasubramainan等[23]則使用溶解性噬菌體作為生物識(shí)別元素檢測(cè)了S.aureus。將噬菌體吸附在Spreeta SPR傳感器芯片表面，直接檢測(cè)S.aureus的檢測(cè)限為104CFU/mL。

2.1.6 結(jié)腸炎耶爾森桿菌(Yersinia enterocolitica，Y. enterocolitica)

Oh等[24]報(bào)道了Y. enterocolitica的SPR檢測(cè)。他們先在傳感器芯片表面自組裝了巰基烷烴，再將蛋白G偶聯(lián)在巰基烷烴表面，然后將Y. enterocolitica的單克隆抗體固定在傳感器芯片表面，檢測(cè)Y. enterocolitica的檢測(cè)限為102CFU/mL。

2.1.7 霍亂弧菌(Vibrio cholerae)

Jyoung等[25]同樣用檢測(cè)Y. enterocolitica的儀器和方法檢測(cè)了霍亂弧菌O 1，在緩沖液中的檢測(cè)限為4× 105CFU/mL。

2.2 寄生蟲(Protozoan parasite)

2006年，Kang等[26]報(bào)道了隱孢子蟲卵囊的SPR檢測(cè)。他們將Biacore 2000傳感器芯片表面組裝了一層巰基烷烴，并將鏈霉親和素偶聯(lián)在其表面，然后將生物素化的隱孢子蟲卵囊單克隆抗體固定在傳感器表面，在緩沖液中檢測(cè)隱孢子蟲卵囊的檢測(cè)限為106卵囊/mL。

2.3 真菌病原體(Fungal pathogen)

Zezza等[27]應(yīng)用Biacore X，采用DNA雜交的方法檢測(cè)了小麥中的大刀鐮刀菌(Fusarium culmorum)。從樣品中提取出含有Fusarium culmorum的特異性DNA片段，擴(kuò)增后，注入固定有與其互補(bǔ)的DNA序列的傳感器芯片表面，進(jìn)行檢測(cè)，其檢測(cè)限為0.25ng/μL。在30ng硬質(zhì)小麥中，最小可檢測(cè)出特異性Fusarium culmorum DNA 0.06pg。

2.4 毒素(Toxins)

在食品安全中涉及到的毒素主要是由細(xì)菌、真菌和藻類產(chǎn)生的。

2.4.1 葡萄球菌腸毒素B(Staphylococcal enterotoxin B，SEB)

2000年，Nedelkov等[28-29]應(yīng)用Biacore X，采用直接法檢測(cè)了SEB。將SEB抗體固定在經(jīng)過氨基偶聯(lián)后的羧甲基葡聚糖修飾的芯片表面，直接檢測(cè)了牛奶和蘑菇中的SEB，檢測(cè)限可達(dá)到1ng/mL。隨后，應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)了同樣的樣品，其結(jié)果與SPR結(jié)果一致。2002年，Slavík等[30]使用光纖SPR傳感器檢測(cè)了SEB，他們將SEB抗體吸附在戊二醛交聯(lián)的芯片表面，直接檢測(cè)緩沖液中的SEB，檢測(cè)限為10ng/mL。Homola等[31]使用波長(zhǎng)檢測(cè)型SPR傳感器檢測(cè)了緩沖液和牛奶中的SEB，將多克隆SEB抗體固定在經(jīng)過氨基偶聯(lián)的巰基烷烴修飾的芯片表面，在緩沖液直接檢測(cè)SEB的檢測(cè)限為5ng/mL，三明治法檢測(cè)緩沖液和牛奶中SEB的檢測(cè)限為0.5ng/mL。2003年，Medina等[32]應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)模式檢測(cè)了SEB，將SEB固定在傳感器芯片表面，含有SEB的樣品和已知濃度的SEB抗體培育20～30min，離心分離，將上層液(未結(jié)合的抗體)流經(jīng)傳感器進(jìn)行分析檢測(cè)，在牛奶中的檢測(cè)限為0.3ng/mL。檢測(cè)一個(gè)樣品僅需要15min。

2.4.2 葡萄球菌腸毒素A(Staphylococcal enterotoxin A，SEA)

Medina等[33]應(yīng)用Biacore 1000，采用競(jìng)爭(zhēng)的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了生雞蛋中的SEA。首先將SEA固定在經(jīng)過氨基偶聯(lián)的羧甲基葡聚糖修飾的芯片表面，將生雞蛋溶液混合均勻后離心，取其上清液并加入SEA抗體，待其與樣品中的SEA充分結(jié)合后離心分離，將上層液(未結(jié)合的抗體)注入傳感器芯片，使用這樣的方法，在整個(gè)雞蛋中檢測(cè)SEA的檢測(cè)限為1ng/mL。

2.4.3 軟骨藻酸(domoic acid，DA)

Lotierzo等[34]應(yīng)用Biacore 3000檢測(cè)了DA，將分子印跡聚合物光接枝在芯片表面作為識(shí)別元素，以競(jìng)爭(zhēng)的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了DA，在緩沖液中的檢測(cè)限為5ng/mL。2005年，Yu等[35]應(yīng)用SPR傳感器檢測(cè)了DA，他們?cè)诰彌_液中的檢測(cè)限為0.1ng/mL。Traynor等[36]報(bào)道了貝類提取物中DA的SPR檢測(cè)，他們將DA固定在經(jīng)過氨基偶聯(lián)的羧甲基葡聚糖修飾的芯片表面，以競(jìng)爭(zhēng)的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了蚌類、牡蠣和小貝殼中的DA，檢測(cè)限分別為1、4.9μg/g和7μg/g。Stevens等[37]應(yīng)用便攜式的Spreeta 2000傳感器檢測(cè)了DA，將多克隆DA抗體固定在縮氨酸修飾的芯片表面，檢測(cè)緩沖液和蛤俐中的DA，檢測(cè)限為3ng/mL。

2.4.4黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1)

2000年，Daly等[38]成功的應(yīng)用Biacore 1000檢測(cè)了aflatoxin B1，aflatoxin B1被固定在經(jīng)過氨基偶聯(lián)的羧甲基葡聚糖修飾的芯片表面，以競(jìng)爭(zhēng)的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，在緩沖液中的檢測(cè)限為3ng/mL。Dunne等[39]使用單鏈抗體(scFvs)作為識(shí)別元素檢測(cè)了aflatoxin B1，對(duì)于單體scFvs和二聚體scFvs作為生物識(shí)別元素，在緩沖液中的檢測(cè)限分別為375pg/mL和190pg/mL。

2.4.5 脫氧雪腐鐮刀菌醇(deoxynivalenol)

deoxynivalenol 是由鐮刀菌霉產(chǎn)生的具有強(qiáng)毒性的真菌代謝物。Tüdos等[40]成功的應(yīng)用Biacore Q檢測(cè)了緩沖液和小麥中的deoxynivalenol，將deoxynivalenol與酪蛋白偶合之后被固定在經(jīng)過氨基偶聯(lián)的羧甲基葡聚糖修飾的芯片表面，deoxynivalenol與其過量的抗體混合并培育一段時(shí)間后，流經(jīng)傳感器表面進(jìn)行檢測(cè)，在緩沖液中的檢測(cè)限為2.5ng/mL，其檢測(cè)結(jié)果與液-質(zhì)聯(lián)機(jī)檢測(cè)的結(jié)果一致。

3 展 望

SPR生物傳感器經(jīng)過20多年的發(fā)展，已成為生化分析中備受矚目的研究分析工具。近幾年，隨著分子生物學(xué)和分子免疫學(xué)的不斷突破和儀器自身結(jié)構(gòu)的不斷改進(jìn)，SPR生物傳感器在食品微生物的應(yīng)用前景將更為廣闊。各種單克隆抗體的不斷問世，為SPR生物傳感器敏感膜的多樣性提供了可能。通過利用固定有不同單克隆抗體的SPR生物傳感器，食品中各種微生物的鑒定及其含量的測(cè)定等都將成為現(xiàn)實(shí)。

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Application of SPR Biosensor in the Detection of Food Microorganisms：A Review

LIU Xia，LI Zong-jun*
(Key Laboratory of Food Science and Biotechnology of Hunan Province, College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

Surface plasma resonance (SPR) is one of modern analytical techniques and can be used for monitoring inter-molecular interaction in real time. In addition, it can also be applied to detect biochemical parameters in an accurate, fast and convenient manner. Moreover, the detection of food microorganisms using SPR has been attracted extensive attentions in recent years. Current progresses in the detection of food microorganisms through SPR technique has been reviewed in this paper.

surface plasma resonance；biosensor；food microorganism；detection

Q93-332

A

1002-6630(2010)09-0301-05

2009-07-30

國(guó)家“863”計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(2008AA10081)；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)引進(jìn)人才基金項(xiàng)目(08YJ07)

劉霞(1976—)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称贩治觥⑹称飞锛夹g(shù)。E-mail：liuxia608@gmail.com

*通信作者：李宗軍(1968—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸飳W(xué)。E-mail：lizongjun@yahoo.com.cn