王瑞云，王計(jì)平，李潤(rùn)植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

糧食短缺是全球21世紀(jì)面臨的最嚴(yán)峻問(wèn)題之一[1]。水稻、小麥和玉米是最重要的3種糧食作物，其中水稻在亞洲的消費(fèi)和種植超過(guò)90%，養(yǎng)活著占全球60%的亞洲人口。30多億亞洲人需要的能量有35%～75%來(lái)源于水稻。每年水稻的種植面積達(dá)0.103億hm2，占全球耕地的11%[2]。然而，由于水稻消費(fèi)國(guó)人口的迅速增加，估計(jì)到2030年水稻產(chǎn)量需再增加40%才能滿(mǎn)足需求[2]。生物技術(shù)和傳統(tǒng)育種的有機(jī)結(jié)合是高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的保障，而高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)則依賴(lài)于有特征明顯的水稻基因組序列。因此，解譯其基因組是對(duì)水稻和其他禾谷類(lèi)作物進(jìn)行應(yīng)用和基礎(chǔ)研究的先決條件。

1 水稻基因組測(cè)序計(jì)劃

基因組包含了生物的進(jìn)化、遺傳和生命的奧秘，是細(xì)胞遺傳物質(zhì)的總和，其大小通常以全部DNA堿基對(duì)總數(shù)來(lái)表示。水稻基因組有12條染色體，其中染色體1最長(zhǎng)，染色體10最短，核基因組序列總長(zhǎng)約389Mb[3]。迄今，水稻全基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成，其覆蓋度為95%。并且有6條染色體[4-9]和2個(gè)著絲粒[10-12]已完全測(cè)序。

國(guó)際水稻基因組測(cè)序計(jì)劃（IRGSP）于1998年正式啟動(dòng)，由來(lái)自10個(gè)國(guó)家的測(cè)序小組共同完成水稻2個(gè)亞種粳稻和秈稻基因組的測(cè)序工作。已完成的序列誤差率低于1/10 000（精度99.99%），即1萬(wàn)個(gè)核苷酸中測(cè)定錯(cuò)誤的核苷酸少于1個(gè)。以往存在的分歧得到解決，圖距再度縮短。該成果使遺傳學(xué)家能夠根據(jù)特征鑒定一些基因，并且發(fā)現(xiàn)了以前未知的較大區(qū)段重復(fù)，該區(qū)段重復(fù)占全基因組的60%[13-15]。

2002年12月，水稻12條染色體的堿基測(cè)序工作完成（提前3年）。日本在其中發(fā)揮著主導(dǎo)作用，并最先以99.99%的精度完成了最長(zhǎng)的第1條染色體的測(cè)序工作。隨后，中國(guó)、美國(guó)、中國(guó)臺(tái)灣、印度和法國(guó)分別完成了染色體4，10，5，11和12全長(zhǎng)序列的精確測(cè)定。

2 物理圖譜、序列測(cè)定和覆蓋度

IRGSP運(yùn)用BAC和PAC 2個(gè)克隆系，采用克隆連克隆測(cè)定法（clone by clone sequencing）測(cè)定了日本晴的染色體序列。該策略運(yùn)用的材料包括：高密度遺傳圖譜、表達(dá)序列標(biāo)簽、YAC和BAC物理圖譜、BAC末端序列和2個(gè)草圖序列[16-23]。對(duì)3 401個(gè)的BAC/PAC克隆系測(cè)序到約為10倍的序列覆蓋度，并將該克隆系裝配，完成序列的堿基錯(cuò)誤率小于1/10 000。運(yùn)用一系列底物（包括PCR片段、10 kb的質(zhì)粒、40 kb的fosmid克隆系），在BAC/PAC的tiling通道中，橋接了物理缺口染色體的大部分。在12條染色體上仍有62個(gè)缺口染色體（包括9個(gè)著絲粒缺口染色體和17個(gè)端粒缺口染色體）未測(cè)序。已經(jīng)測(cè)量了染色體臂和端粒缺口染色體，在CentO衛(wèi)星DNA含量的基礎(chǔ)上估測(cè)了9個(gè)著絲粒缺口染色體。估計(jì)其余的缺口染色體全長(zhǎng)為18.1Mb[3]。

已經(jīng)在GenBank/DDBJ/EMBL的PLN分區(qū)定位了97%的BAC/PAC和缺口染色體序列。上述序列和其他的草圖序列克隆系組成水稻12條染色體上的假分子。這些假分子的核苷酸序列全長(zhǎng)為370 733 456 bp，具有一個(gè)長(zhǎng)為6.9Mb的N-average連續(xù)序列。通過(guò)比較來(lái)自不同實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)為1.2Mb的重疊序列可以估測(cè)特征序列，總精確度達(dá)99.99%。

基于錨定BAC重疊群長(zhǎng)度和缺口染色體大小的推定值，日本晴基因組具有403Mb的單倍體核DNA[24]。將推定的缺口染色體長(zhǎng)度加到全部未重疊序列中，水稻核基因組的總長(zhǎng)達(dá)388.8Mb。因此，在全基因組中假分子約占95.3%，在常染色質(zhì)中假分子約占98.9%。通過(guò)尋找單一表達(dá)序列標(biāo)簽標(biāo)記得到了通過(guò)假分子來(lái)體現(xiàn)基因組覆蓋度的獨(dú)立衡量尺度[19]。在假分子的8 440個(gè)表達(dá)序列標(biāo)簽中，有8 391個(gè)（99.4%）被鑒定。

染色體1的預(yù)測(cè)長(zhǎng)度達(dá)51.4Mb，約占水稻堿基總數(shù)的1/10[5]。迄今，已完成了大約43.3Mb的測(cè)序工作（精度99.99%），其中短臂序列長(zhǎng)為493 729 bp，約6 756個(gè)基因，其中約30%的基因（2 073個(gè)）已被功能分類(lèi)?；虼笮〉木凳?.4 kb。染色體1富含G+C，特別是在編碼區(qū)具有幾個(gè)分散或串聯(lián)重復(fù)序列基因簇分布的特征。

染色體4的預(yù)測(cè)長(zhǎng)度達(dá)36.8Mb[6]，已經(jīng)以99.99%的精度完成了大約34.6Mb的測(cè)序工作。著絲點(diǎn)長(zhǎng)達(dá)1 116Mb，是目前已知序列植物中最長(zhǎng)的。共預(yù)測(cè)到4 658個(gè)基因和70個(gè)tRNA編碼基因，其中1 681個(gè)基因與EST相匹配。35%的基因功能已被分類(lèi)。G+C含量達(dá)44.16%。轉(zhuǎn)座子明顯偏向常染色質(zhì)域。染色體5的預(yù)測(cè)序列長(zhǎng)為42.2Mb，其中包括29.8Mb的非重疊序列[8]。運(yùn)用日本晴基因組的指紋重疊群數(shù)據(jù)，通過(guò)整合280個(gè)BAC/PAC克隆序列和232個(gè)STS/EST標(biāo)記，構(gòu)建了依賴(lài)于BAC和PAC克隆的日本晴的精細(xì)物理圖譜。該圖譜包括5個(gè)重疊群，覆蓋估測(cè)染色體（30.08Mb）的99%。4個(gè)物理間隙估測(cè)分別是1～3缺口為30 kb、第4缺口為20 kb。該圖譜有利于對(duì)水稻功能基因組進(jìn)行定位克隆和更多特征的研究。

染色體10的預(yù)測(cè)長(zhǎng)度達(dá)23.7Mb[7]，已經(jīng)以99.99%的精度完成了大約22 422 563 bp的測(cè)序工作，短臂和長(zhǎng)臂分別為7.6，14.8Mb。共預(yù)測(cè)到3 471個(gè)基因和67個(gè)tRNA編碼基因，其中81.3%的基因與EST相匹配。已經(jīng)對(duì)51.4%的基因的功能進(jìn)行了分類(lèi)。G+C含量達(dá)43.5%。這些序列貯存在美國(guó)的DNA公共數(shù)據(jù)庫(kù)中，記錄代碼為AE016959。染色體11和12的預(yù)測(cè)序列總長(zhǎng)為55.9Mb，占基因組全長(zhǎng)的14.3%[4]。鑒定了5 993個(gè)非轉(zhuǎn)座元件相關(guān)基因，其中包括289個(gè)類(lèi)抗病基因和28個(gè)防御響應(yīng)基因，這遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他染色體上類(lèi)抗病基因的含量。

2007年，全基因組SwaI光學(xué)限制性（酶切）圖譜被構(gòu)建，該物理圖譜的全基因組大小為382.17Mb，圖距比以往縮短了11%，包括覆蓋12條染色體的14個(gè)重疊群，位于除染色體6，9和11以外的9條染色體上的9個(gè)重疊群不存在缺口[25]。

3 著絲點(diǎn)定位

典型真核細(xì)胞的著絲點(diǎn)含有重復(fù)序列，該重復(fù)序列包括CentO衛(wèi)星DNA和側(cè)翼逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座子。水稻的全部著絲點(diǎn)都含有高度重復(fù)的155～165 bp的CentO衛(wèi)星DNA序列和著絲點(diǎn)-特異性逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子[26-27]。染色體4和8分別含有59 kb和69 kb的CentO重復(fù)序列簇[10-12]，CentO重復(fù)序列簇呈從頭到尾的串聯(lián)排列。已經(jīng)找到介于CentO重復(fù)間和CentO重復(fù)周?chē)拇罅康哪孓D(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，包括著絲點(diǎn)-特異性逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子RIRE7。CentO重復(fù)序列簇顯示了2條染色體在長(zhǎng)度和取向方面存在差異。

對(duì)假分子進(jìn)行BLASTN分析，結(jié)果顯示，約0.9Mb的CentO重復(fù)序列簇被測(cè)序，并且這些重復(fù)序列簇與著絲點(diǎn)-特異性逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子有關(guān)。全部的CentO序列位點(diǎn)都與已鑒定的與遺傳有關(guān)的著絲點(diǎn)區(qū)相似。在染色體4，5，8的著絲點(diǎn)區(qū)遍布假分子，而在其他染色體上假分子僅存在于著絲點(diǎn)區(qū)的某些部位[3]。

熒光原位雜交證實(shí)染色體5上與端粒和著絲粒區(qū)相應(yīng)的BAC克隆在粗線(xiàn)期的染色體上。54.6 cM的著絲點(diǎn)區(qū)覆蓋著一個(gè)沒(méi)有物理缺口的跨度為2.1Mb的最小tiling通道。運(yùn)用3個(gè)重疊的BAC/PAC約150 kb揭示了著絲點(diǎn)的精確位置。另外，F(xiàn)ISH結(jié)果顯示，粗線(xiàn)期著絲點(diǎn)區(qū)的染色質(zhì)濃度不均一[8]。

4 串聯(lián)重復(fù)序列和簡(jiǎn)單序列重復(fù)

禾本科植物中許多激素應(yīng)答蛋白和防御蛋白家族（幾丁質(zhì)酶、病原相關(guān)蛋白、種子過(guò)敏原等）屬于串聯(lián)重復(fù)序列[3]。在水稻的基因組中，串聯(lián)重復(fù)序列占14%。水稻染色體10上有2個(gè)基因家族，即具有27個(gè)拷貝的編碼富含甘氨酸蛋白的基因家族和具有48個(gè)拷貝的編碼TRAF/BTB域蛋白的基因家族[28]。每隔5Mb檢測(cè)串聯(lián)排列的基因，發(fā)現(xiàn)水稻的153個(gè)基因列陣含有10 134個(gè)成員，65%的具有27個(gè)以上成員的串聯(lián)列陣和33%的具有10個(gè)以上成員的列陣中含有蛋白激酶域[3]。盡管水稻染色體11和染色體12的長(zhǎng)度和基因總數(shù)相似，但是染色體12上所含的類(lèi)抗病基因不到染色體11的1/2。染色體11和12間類(lèi)抗病基因數(shù)量的差異影響其串聯(lián)基因序列的長(zhǎng)度，各有924個(gè)和684個(gè)（分別占染色體11和12基因總量的29%和24%），基因在較短的遺傳距離上至少重復(fù)一次[4]。

水稻基因組Ι型簡(jiǎn)單序列重復(fù)是多于20個(gè)核苷酸的完全序列重復(fù)，而重復(fù)序列若多于20個(gè)核苷酸則被看作高變異度區(qū)，這可以為遺傳育種提供豐富的標(biāo)記[3，29]。已經(jīng)鑒定了代表47個(gè)明顯的基序家族的水稻基因組Ι型SSR 18 828個(gè)，該序列已注釋在水稻基因組中；提供了應(yīng)用較廣的RFLP及已經(jīng)公布的SSR相關(guān)的基因組Ι型SSR物理圖譜位置的有關(guān)信息[16，29-30]。高變異度的SSR平均每Mb為51個(gè)，其中，最高的分布在染色體3上，為55.8個(gè)SSR/Mb；最低的分布在染色體4上，為41個(gè)SSR/Mb。成千上萬(wàn)的SSR在一系列不同的栽培種中顯示出擴(kuò)增性好、多態(tài)性高的特點(diǎn)，這樣便可很快將其用于基因分析[3，29]。

5 結(jié)語(yǔ)

水稻基因組序列圖譜的完成和準(zhǔn)確定位是引人注目的，如今已經(jīng)擁有了水稻全部染色體的藍(lán)圖。目前，已經(jīng)獲得基因、重復(fù)序列和著絲粒等主要組成元件的分布和定位[3]，近41 000個(gè)水稻基因的功能已經(jīng)被搞清楚[31]，絕大部分的圖譜序列已經(jīng)被公布在公共數(shù)據(jù)庫(kù)中?；谠撔蛄猩汐@得的暫時(shí)的水稻假分子為科學(xué)界估測(cè)基因組提供了契機(jī)。而且，已有的SNP和SSR方面的信息將促進(jìn)分子標(biāo)記輔助育種和定位克隆，加速水稻改良的進(jìn)程，進(jìn)而為全人類(lèi)的食物安全提供保障。

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