劉華梅 陳振民 李青 謝翔

20世紀50年代以來，抗生素作為疾病治療劑和動物生長促進劑對畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展發(fā)揮了重大作用。然而，大規(guī)模集約化養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展導(dǎo)致抗生素的過度濫用，使食品安全受到日益嚴峻的挑戰(zhàn)，近年來，歐洲、美國、日本等發(fā)達國家已明令禁用抗生素作為飼料添加劑，并在積極地尋找抗生素的替代品。人們研究發(fā)現(xiàn)，益生菌用于飼料添加劑飼喂動物，能很好地控制動物病原菌的增殖、促進動物生長作用，同時不會出現(xiàn)耐藥性，也不存在有害殘留或污染等副作用，因此，目前益生菌已經(jīng)發(fā)展成為替代抗生素、控制動物疾病的最有效的工具之一。其中芽孢桿菌益生菌，如凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillu coagulans)、緩慢芽孢桿菌(B.lentus)、枯草芽孢桿菌 (B.subtilis)、地衣芽孢桿菌 (B.licheniforms)和短小芽孢桿菌(B.pumilus)等，由于其具有抗逆性強、耐儲藏、應(yīng)用條件不苛求等優(yōu)良性狀，全部或部分被美國FDA、中國農(nóng)業(yè)部列入可直接用于飼料添加劑的菌種目錄，成為目前應(yīng)用最為廣泛的一種益生菌，對畜禽、水產(chǎn)業(yè)都顯示良好的應(yīng)用效果。

但是，當(dāng)前我國益生菌產(chǎn)業(yè)還處在起步階段，產(chǎn)品純度和含量低，產(chǎn)品穩(wěn)定性差，使用效果也不很理想。但隨著科技的發(fā)展，研究的不斷深入，益生菌產(chǎn)業(yè)必將朝著健康、規(guī)范、高水平方向發(fā)展。目前，武漢科諾公司采用先進的制造技術(shù)，已分別開發(fā)出活芽孢高含量的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌產(chǎn)品，活芽孢數(shù)分別達到10000億個活芽孢/g，并申請了國家專利。

1 多種生物學(xué)技術(shù)保障了高效安全的菌種篩選與鑒定

作為活菌制劑，在菌種的篩選時，一定要進行系統(tǒng)的安全性毒理學(xué)試驗，確定無毒副作用，并經(jīng)權(quán)威機構(gòu)鑒定后，方可用于生產(chǎn)，這是保證產(chǎn)品安全的前提條件，避免可能存在的安全隱患。其次，菌種應(yīng)具有優(yōu)良的特性，能耐受動物腸道內(nèi)的極端條件，包括胃中的酸性環(huán)境和十二指腸中的膽汁，同時產(chǎn)品還應(yīng)能耐受飼料制粒過程中的熱處理。分離在不同條件下收集的芽孢桿菌樣品，通常采用顯微觀察、生理生化試驗、現(xiàn)代微生物鑒定系統(tǒng)-API系統(tǒng)（API50試劑盒）及16S rRNA基因的PCR擴增等生物學(xué)技術(shù)對菌株進行鑒定與選育。經(jīng)過優(yōu)選的芽孢桿菌同時應(yīng)具有以下特性：生長迅速、生物量高、良好的產(chǎn)芽孢能力，有耐酸、耐堿、耐高溫的良好穩(wěn)定性及優(yōu)良的產(chǎn)酸、產(chǎn)酶、產(chǎn)維生素等性能。同時對目標菌種進行安全性鑒定，評價其對動物和環(huán)境的影響，如急性毒性試驗和毒理學(xué)試驗等。最后選擇高效、安全的芽孢桿菌作為生產(chǎn)菌種，進行保藏，并定期對生產(chǎn)菌種進行安全性檢測。

2 響應(yīng)面方法優(yōu)化培養(yǎng)基顯著提高了芽孢桿菌的發(fā)酵水平

培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分（如碳源、氮源、微量元素和生長因子）是影響微生物生長、繁殖和代謝的重要因素。針對原料不同的來源、價格、產(chǎn)地及運輸情況，綜合考慮其投入產(chǎn)出比，優(yōu)選來源容易、價格低廉、芽孢產(chǎn)率高的培養(yǎng)基成分用于工業(yè)生產(chǎn)，如葡萄糖、淀粉、大米粉、豆粕、花生粕、蛋白胨、酵母粉、大豆蛋白粉，玉米蛋白粉、大米蛋白粉、魚粉、硫酸銨、硝酸銨等碳氮源及對生長和芽孢形成有促進作用的Co2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Zn2+、P2+、Na+、K+等微量元素。

采用單因素實驗，考察以上不同的培養(yǎng)基成分對芽孢產(chǎn)量的影響，優(yōu)選8～20種培養(yǎng)基成分用于響應(yīng)面優(yōu)化。主要包括部分因子篩選實驗，最陡坡試驗和中心組合設(shè)計，主要考察各種營養(yǎng)成分對發(fā)酵生物量、芽孢數(shù)和發(fā)酵周期的影響，并采用多元一次和二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，優(yōu)化得到1～2個成本低廉、芽孢產(chǎn)率高、易于操作的工業(yè)化生產(chǎn)的培養(yǎng)基組成，使芽孢桿菌發(fā)酵水平達到活芽孢數(shù)150億個活芽孢/ml以上。

3 高密度補料發(fā)酵技術(shù)提高芽孢桿菌的發(fā)酵水平

除了營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件對發(fā)酵水平有重要影響外，發(fā)酵工藝和方式也對發(fā)酵水平和產(chǎn)率有重要影響。

芽孢桿菌益生菌可采用固體發(fā)酵和液體發(fā)酵兩種方式。固體發(fā)酵是把益生菌接種到固體培養(yǎng)基上進行發(fā)酵培養(yǎng)，優(yōu)點是管理粗放，工藝簡單，投資較少，但有易受雜菌污染、菌體含量不易控制、產(chǎn)品質(zhì)量和應(yīng)用效果不穩(wěn)定、安全性不能保證等缺點。液體深層發(fā)酵采用現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)，將益生菌菌種接種到反應(yīng)器中進行通風(fēng)培養(yǎng)，對整個發(fā)酵過程進行精細的過程控制，無菌培養(yǎng)，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)，但技術(shù)水平要求較高，隨著各國政府對食品安全的高度關(guān)注，液體深層發(fā)酵必將是未來益生菌產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的方向。

采用有效提高發(fā)酵生物量和產(chǎn)率的高密度液體補料發(fā)酵技術(shù)，制造出高含量芽孢桿菌益生菌。首先利用響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)基，進行分批發(fā)酵動力學(xué)研究，包括研究不同培養(yǎng)溫度、pH值、通氣比、轉(zhuǎn)速、溶氧和消泡劑對芽孢形成和泡沫的控制的影響，得到一個最佳的分批發(fā)酵工藝條件，然后進行補料分批發(fā)酵工藝優(yōu)化，著重研究不同基質(zhì)、不同補料方式（恒速補料和變速補料）和不同補料時機對高密度培養(yǎng)的影響，確定高密度發(fā)酵條件及工藝，使芽孢形成率達95%以上，活芽孢數(shù)200億個/ml以上。

4 高效清潔的芽孢回收技術(shù)保證了較高的活芽孢回收率和高含量產(chǎn)品

提取與回收工藝是影響產(chǎn)品的品質(zhì)、收率和穩(wěn)定性的重要環(huán)節(jié)，如何有效的回收穩(wěn)定性的芽孢和制備高含量的枯草芽孢原粉一直是本行業(yè)的難點。

通過比較和優(yōu)化多種提取和回收方式對芽孢收率、質(zhì)量和穩(wěn)定性的影響，包括不同的回收方式（如工業(yè)離心、板框過濾、膜過濾技術(shù)、真空濃縮、生物絮凝劑）、干燥方式（冷凍干燥、真空烘干和噴霧干燥等方式）以及不同消毒劑和消毒方式對環(huán)境中噬菌體和雜菌的殺滅效果，綜合考慮效率、收率、成本及環(huán)境影響等因素，最終選擇終產(chǎn)品的品質(zhì)高、穩(wěn)定性好、操作簡單、環(huán)境潔凈及生產(chǎn)兼容性好的優(yōu)化工藝組合，使芽孢回收率達90%以上，制備出活芽孢10000億個活芽孢/g的芽孢桿菌產(chǎn)品。

5 獨創(chuàng)的高含量活芽孢數(shù)的檢測技術(shù)有力保障了檢測結(jié)果的準確性

活菌計數(shù)技術(shù)作為常規(guī)的微生物學(xué)技術(shù)，是衡量細胞生物量和產(chǎn)率的重要手段。高含量芽孢桿菌原藥（10000億個活芽孢/g）中，芽孢成分占到90%以上，由于芽孢高度集聚，芽孢所攜帶的靜電等因素使芽孢很難分散，使用常規(guī)的平板計數(shù)技術(shù)，檢測結(jié)果的變異系數(shù)往往非常大，難以準確判斷其真實值，一直是本行業(yè)的難點之一。

通過研究不同的表面活性劑、不同的振蕩打散方式及不同的操作流程對芽孢準確性和重復(fù)性的影響，建立一套精確度高、重復(fù)性好，易操作的檢測流程，包括稀釋液添加表面活性劑吐溫-80，對樣品進行磁力攪拌和超聲波預(yù)處理，80℃水浴處理殺滅營養(yǎng)體和不完整芽孢，保證產(chǎn)品活芽孢數(shù)檢測的準確與有效，使檢測變異系數(shù)可以控制在3.5%以內(nèi)。

6 綜合采用多種先進生物學(xué)技術(shù)保障了產(chǎn)品的純度

產(chǎn)品的純度保證產(chǎn)品的高品質(zhì)、良好的應(yīng)用效果及安全性的重要指標之一，越來越受到行業(yè)，特別是發(fā)達國家的重視?？浦Z公司采用顯微觀察、平板劃線、菌種特性鑒定、API50-CHB及16SrRNA的PCR鑒定等技術(shù)，并通過對菌種特有功效特性的鑒定。分別對菌種、中間品和產(chǎn)品進行純度鑒定，保證了生產(chǎn)過程無污染和產(chǎn)品的同源性。

7 結(jié)語

高品質(zhì)芽孢桿菌等飼用益生菌推廣使用，不僅直接為取代抗生素提供有效解決途徑，同時也對我國無抗生素殘留的動物產(chǎn)品出口帶來積極效果，并在垃圾除臭、染污水體修復(fù)領(lǐng)域取得初步成效，進一步顯示良好的社會和生態(tài)效益。