河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院(石家莊 050091)

段彥蒼 杜惠蘭* 靳亞慈

乳腺增生病為乳腺常見病、多發(fā)病,被認(rèn)為是乳腺癌癌前的一種良性病變。在病理方面除了表現(xiàn)在上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、腺泡、導(dǎo)管等組織的增生外,亦存在著血管的增生[1]。血管增生在乳腺腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移過程中起到了重要作用。血管的生成與血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生成因子(Basic fibroblast growth factor,b FGF)密切相關(guān)。本研究采用肌注外源性激素刺激大鼠乳腺增生,測定其血清VEGF和b FGF及其在乳腺組織中的表達(dá)強(qiáng)度,以期研究V EGF和bFGF在大鼠乳腺增生中的作用。

材料和方法

1 動(dòng)物模型的建立與分組 動(dòng)物:75～85日齡健康清潔級(jí)雌性Wistar大鼠20只(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):602089),體重220±20g。適應(yīng)性喂養(yǎng) 2周后,按隨機(jī)數(shù)字表法將其分為2組,每組10只:即正常對(duì)照組、模型組。正常組大鼠常規(guī)喂養(yǎng),模型組參照張璐[2]等造模方法。大鼠腹腔注射苯甲酸雌二醇(天津金耀氨基酸有限公司)0.5 mg/(kg· d),連續(xù) 25d,然后注射黃體酮(天津金耀氨基酸有限公司)5 mg/(kg· d),連續(xù) 5d,建立大鼠乳腺增生的模型。

2 方 法 30d后,用游標(biāo)卡尺測量第2對(duì)乳房的直徑。同時(shí)取血離心保存,用酶聯(lián)免疫法測定血清VEGF和bFGF的含量。切取第2對(duì)乳房,甲醛液固定,常規(guī) HE染色及免疫組織化學(xué)染色(按 ABC試劑盒操作指南進(jìn)行)。光鏡觀察乳腺組織形態(tài)學(xué)變化,應(yīng)用日本 Nikon E800顯微鏡進(jìn)行觀察,美國 IPP(Imageproplus)分析軟件對(duì)免疫組化染色切片進(jìn)行圖像分析,每個(gè)切片采集5個(gè)視野,得出度量物質(zhì)含量信息的灰度等級(jí),將所得灰度值取平均數(shù)作為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)。平均灰度與陽性表達(dá)強(qiáng)弱成反比,灰度值越小,陽性染色越強(qiáng),蛋白表達(dá)越多。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用 SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。對(duì)所測定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn),組間比較用單因素方差分析,檢驗(yàn)以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠乳頭直徑的變化:正常組大鼠乳房大小正常,色淡紅,質(zhì)軟,用棉簽觸壓時(shí)大鼠無明顯的痛苦感,隔毛看不見乳頭位置,將毛分開后,僅見乳頭呈小米樣,緊貼在皮膚上,蒼白、柔軟、個(gè)別稍隆起 1 mm左右。模型組大鼠乳房乳頭增大,色鮮紅,質(zhì)硬,用棉簽觸壓時(shí)大鼠出現(xiàn)明顯的痛苦感,易激惹。乳頭豎起,較堅(jiān)實(shí),充血,增高 2～3 mm。

2 血清生殖激素變化:正常組大鼠血清為E2(15.238±8.218)pg/ml,模 型組 為E2(36.864±20.599)pg/ml,兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);正常組大鼠血清 P(57.047±17.014)ng/ml,模型組大鼠血清 P(31.571±5.821)ng/ml,兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01);正常組大鼠血清 PRL(7.947±1.459)ng/ml;模型組大鼠血清 PRL(9.912±4.206)ng/ml,兩組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

3 血清 VEGF、bFGF含量:正常組血清 VEGF為(16.414±3.798)pg/ml,模型組為(21.357±4.816)pg/ml;正常組血清 b FGF為(244.370±57.431)pg/ml,模型組為(507.900±79.051)pg/ml。與正常組相比,模型組大鼠血清中 VEGF和bFGF含量均明顯升高(P＜0.01)。

4 乳腺組織 V EGF、b FGF的表達(dá):乳腺 VEGF、b FGF的陽性表達(dá)定位于細(xì)胞漿內(nèi),為棕黃色染色。正常組乳腺組織 VEGF表達(dá)平均灰度為84.76±8.30,模型組為62.89±8.05;正常組乳腺組織 bFGF表達(dá)平均灰度為102.00±4.90,模型組為77.61±5.08。與正常組相比,模型組大鼠乳腺組織中 VEGF、bFGF的表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01)。

討 論

研究表明乳腺癌患者VEGF蛋白在乳腺的表達(dá)和MVD數(shù)值呈正相關(guān)[3]。乳腺癌中彩色血流分級(jí)隨著VEGF表達(dá)水平的增強(qiáng)而明顯增高[4]。V EGF是目前已知的促使血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加的作用最強(qiáng)的誘發(fā)因子[5]。VEGF又稱為血管滲透因子,是一種內(nèi)皮細(xì)胞特異性有絲分裂原,具有核心作用,還能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移,具有特異性促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖并增加血管通透性的活性促進(jìn)血漿蛋白外漏,基底膜降解,最終導(dǎo)致新的基質(zhì)及新生血管形成。因此在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[6,7]。

在血管形成的調(diào)控中,b FGF起著關(guān)鍵作用。bFGF能促進(jìn)表皮、內(nèi)皮細(xì)胞再生,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂,誘導(dǎo)其從基膜中分離出來,以刺激內(nèi)皮細(xì)胞向腫瘤組織趨化運(yùn)動(dòng),并形成管狀結(jié)構(gòu),還可提高組織中血纖維蛋白溶解酶原激活因子類(PAs),誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生其他蛋白酶,是血管形成較為直接的誘導(dǎo)物[8]。

經(jīng)典理論認(rèn)為乳腺增生病的發(fā)生與內(nèi)分泌紊亂,卵巢功能失調(diào)有關(guān)。體內(nèi)長時(shí)間的孕激素(P)不足與雌二醇(E2)絕對(duì)或相對(duì)增多,是乳腺組織發(fā)生增生的主要原因。依據(jù)該理論,近幾年,研究學(xué)者常采用肌注外源性激素的方法或摘除實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雙側(cè)卵巢的方法來復(fù)制動(dòng)物乳腺增生的模型,我們認(rèn)為通過手術(shù)摘除動(dòng)物的卵巢本身會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成機(jī)體的損害,可能影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性,所以本實(shí)驗(yàn)采用保守的肌注外源性激素的方法來復(fù)制大鼠乳腺增生的模型。造模后,與正常組相比,模型組大鼠的乳頭豎起,較堅(jiān)實(shí),充血,增高 2～3mm,模型大鼠VEGF和bFGF在乳腺組織的表達(dá)均較正常組明顯升高,提示模型組大鼠體內(nèi)存在的某些血管因子被激活后,直接或間接促進(jìn)了局部乳腺組織血管的增生而造成乳腺增生。有學(xué)者證實(shí)乳腺癌患者血清VEGF表達(dá)明顯高于健康志愿者,并與與乳腺癌的進(jìn)展、惡性程度、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān),認(rèn)為可作為判斷乳腺癌惡性程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個(gè)生物學(xué)指標(biāo)[9],在本實(shí)驗(yàn)中模型大鼠血清VEGF和b FGF水平均較正常組明顯升高,提示血管生成因子表達(dá)的強(qiáng)弱可能與乳腺腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。

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