趙 棟 黃詩穎 翁 雷 孫 靜

(1.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第一婦嬰保健院婦科,上海 200040;2.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室,上海 201203)

子宮內(nèi)膜異位癥是一種常見的復(fù)雜婦科疾病,發(fā)病機(jī)制尚不明確,主要臨床表現(xiàn)是疼痛及不孕。子宮內(nèi)膜異位癥在正常婦女中發(fā)病率為0.5%～5%,而在患不孕癥的婦女中高達(dá)25%～45%[1]。有研究[2]表明子宮內(nèi)膜的基質(zhì)和腺體細(xì)胞主要表達(dá)雌激素受體α(ER-α),而對(duì)于子宮內(nèi)膜是否表達(dá)雌激素受體β(ER-β),研究結(jié)果并不一致。本研究應(yīng)用RT-PCR以及免疫組化法測定ERβ在異位內(nèi)膜及在位內(nèi)膜的表達(dá)情況。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集2008年7月—2008年12月同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第一婦嬰保健院進(jìn)行手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜異位癥患者異位及其在位子宮內(nèi)膜標(biāo)本,常規(guī)4%甲醛固定,石蠟包埋。收集異位內(nèi)膜標(biāo)本15例,對(duì)應(yīng)增生期在位內(nèi)膜12例,分泌期在位內(nèi)膜3例,患者年齡23～41歲,平均年齡35歲。選擇同期因?qū)m頸病變行全子宮切除患者的子宮內(nèi)膜15

例作為對(duì)照,增生期10例,分泌期5例,患者年齡36～49歲,平均年齡45歲。所有患者月經(jīng)周期規(guī)律,術(shù)前半年之內(nèi)未接受激素治療,術(shù)前簽署知情同意書。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增 采用Trizol法制備總RNA,制備的RNA樣品用核酸定量分析儀檢測OD260、OD260/OD280的值,并計(jì)算 RNA產(chǎn)量。所用Trizol試劑購自GIBCO公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 主要步驟包括5μm切片,脫蠟水化,抗原修復(fù),封閉內(nèi)源性過氧化物酶。一抗為小鼠抗人ERb(Serotec,UK),二抗為連接生物素的馬抗小鼠抗體(Vector Lab,CA),非特異性的小鼠IgG作為陰性對(duì)照,已知陽性的卵巢組織作為陽性對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增 組織的OD260/OD280在1.8～2.0,RNA的純度高,同時(shí)得到總RNA的濃度;紫外燈下28S、18S帶清晰,5S帶模糊,RNA的完整性好。在位及異位內(nèi)膜組織中ER-βmRNA陽性表達(dá)率均為100%。

2.2 免疫組化 ER-β在內(nèi)膜異位癥患者的異位內(nèi)膜病灶,在位內(nèi)膜及正常對(duì)照組的在位內(nèi)膜的基質(zhì)細(xì)胞和腺上皮細(xì)胞均不表達(dá),僅有部分血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ER-β(圖 1)。

圖1 A正常卵巢組織(陽性對(duì)照)B對(duì)照組子宮內(nèi)膜C子宮內(nèi)膜異位病灶D內(nèi)膜異位癥患者的在位子宮內(nèi)膜

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥是一種雌激素依賴性的疾病,雌激素可以刺激異位內(nèi)膜細(xì)胞的增殖,是內(nèi)膜異位病灶形成的必要條件之一[3]。ER-β激動(dòng)劑在小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型中可有效治療子宮內(nèi)膜異位癥,使得研究者對(duì)于ER-β在子宮內(nèi)膜細(xì)胞中的作用產(chǎn)生極大的興趣。因?yàn)榇萍に刈饔媒^大多數(shù)是通過受體介導(dǎo)的,所以要了解這種新的雌激素受體在子宮內(nèi)膜異位癥的作用,首先必需了解ER-β在子宮內(nèi)膜組織中的分布情況。有關(guān)ER-β在子宮內(nèi)膜中及內(nèi)膜異位病灶的表達(dá),雖有相關(guān)報(bào)道,但結(jié)果不一[4-5]。分析其原因主要是試驗(yàn)試劑及試驗(yàn)方法的不同。有些學(xué)者用流式細(xì)胞技術(shù)檢測雌激素受體,首先細(xì)胞在制備過程中生化特性可能發(fā)生改變;其次,流式細(xì)胞技術(shù)主要用于檢測細(xì)胞表面抗原,而且雌激素受體為核蛋白,抗體要與細(xì)胞結(jié)合,必須破壞核膜,或者用注射器將抗體注入細(xì)胞核內(nèi)同時(shí)固定,所以用流式細(xì)胞技術(shù)研究核蛋白在方法上面值得商榷。

本研究用RT-PCR法探測15例子宮內(nèi)膜異位癥患者的在位及異位內(nèi)膜以及15例非內(nèi)膜異位癥患者的子宮內(nèi)膜,結(jié)果顯示內(nèi)膜異位癥組及對(duì)照組均表達(dá)ER-αmRNA。免疫組化法測定正常組及對(duì)照組子宮內(nèi)膜蛋白質(zhì)分布結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞及腺上皮細(xì)胞的細(xì)胞核中均無ER-β蛋白表達(dá),只有血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ER-β。本試驗(yàn)采用小鼠抗人的單克隆抗體具有極高的特異性,使用非特異獨(dú)特型抗體作為陰性對(duì)照有效地排除假陽性,結(jié)果直觀、真實(shí)、可靠。

特異性ER-β激動(dòng)劑在小鼠模型中可有效治療包括子宮內(nèi)膜異位癥在內(nèi)的一些炎性疾病,目前正在進(jìn)行人類的臨床研究。而子宮內(nèi)膜及異位內(nèi)膜的細(xì)胞核中很可能無ER-β存在,所以,ER-β激動(dòng)劑對(duì)于子宮內(nèi)膜異位癥的治療作用可能為非受體依賴性的。它可能是通過影響細(xì)胞增殖、自然凋亡、免疫系統(tǒng)、新生血管形成、或者下丘腦-垂體-卵巢軸等起的作用,不過這還需要進(jìn)一步研究加以驗(yàn)證。

1 Ozkan S,Murk W,and A rici A.Endometriosis and infertility:epidemiology and evidence-based treatments[J].Ann Acad Sci,2008,1127:92-100.

2 Brandenberger AW,Lebovic DI,Tee DK,et al.,Oestrogen recep tor(ER)-alpha and ER-beta isoforms in normal endometrial and endometriosis-derived stromal cells[J].Mol Hum Reprod,1999,5(7):651-655.

3 Lebovic,DI,Mueller MD,Taylor RN,Immunobiology of end ometriosis[J].Fertil Steril,2001,75(1):1-10.

4 王海霞,解其貴,趙俊紅,等.子宮內(nèi)膜癌雌激素受體α、β亞型和孕激素受體m RNA表達(dá)與臨床病理的關(guān)系[J].中國臨床醫(yī)學(xué),2008,15(6):863-865.

5 Lecce G.,Meduri G,A ncelin M,et al.,Presence of estrogen receptor beta in the human endometrium through the cycle:expression in glandular,stromal,and vascular cells[J].JClin End ocrinol Metab,2001,86(3):1379-1386.