在過(guò)去的30多年，人們開(kāi)發(fā)了多種原核和真核表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)外源重組蛋白。和其它表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、表達(dá)水平高、操作容易和成本低等優(yōu)點(diǎn)，成為表達(dá)外源蛋白最常用的表達(dá)系統(tǒng)之一。

近年來(lái),隨著固定化細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究者關(guān)注于固定化大腸桿菌細(xì)胞。固定化大腸桿菌細(xì)胞具有如下優(yōu)勢(shì)：首先，相較于游離細(xì)胞，固定化細(xì)胞在催化反應(yīng)過(guò)程中，其質(zhì)粒更加穩(wěn)定，目的基因產(chǎn)物的活力較高[1,2]，產(chǎn)物易于分離純化；其次，和其它重組菌相比，大腸桿菌更易操作、發(fā)酵成本低、可快速大規(guī)模催化反應(yīng)物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物[3]。自1959年Hattori首次將大腸桿菌細(xì)胞吸附在樹(shù)脂上實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌細(xì)胞固定化以來(lái)，固定大腸桿菌活細(xì)胞或稱為固定化增殖大腸桿菌細(xì)胞的研究工作相繼展開(kāi)。

目前，固定化重組大腸桿菌細(xì)胞已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于小分子藥物生產(chǎn)、工業(yè)廢水處理、能源開(kāi)發(fā)以及大宗化學(xué)品生產(chǎn)等方面[4,5]。

1 大腸桿菌細(xì)胞固定化方法

從理論上講，任何一種限制細(xì)胞自由流動(dòng)的技術(shù)，都可以用于大腸桿菌細(xì)胞的固定化。但目前使用最普遍的固定化大腸桿菌細(xì)胞的方法是包埋法和吸附法。

1.1 包埋法

包埋法的原理是將微生物細(xì)胞截流在水不溶性的凝膠聚合物孔隙的網(wǎng)絡(luò)空間中或埋于半透膜聚合物的超濾膜內(nèi)，通過(guò)聚合作用、離子網(wǎng)絡(luò)形成、沉淀作用，以及通過(guò)改變?nèi)軇囟取H值來(lái)阻止細(xì)胞的泄漏，同時(shí)能讓底物滲入和產(chǎn)物擴(kuò)散出來(lái)。目前應(yīng)用最為廣泛的是凝膠包埋法固定大腸桿菌細(xì)胞，其特點(diǎn)如下[6]：

(1)操作簡(jiǎn)便。將大腸桿菌細(xì)胞與單體或聚合物一起聚凝，細(xì)胞被包埋在形成的聚合物中。

(2)條件溫和?？蛇x用不同的聚合物載體、不同的包埋系統(tǒng)和條件，以保持大腸桿菌的酶催化活性。

(3)穩(wěn)定性好。大腸桿菌細(xì)胞不易滲漏。

(4)細(xì)胞容量高。大腸桿菌細(xì)胞在聚合體中含量可高達(dá)50%～70%。

(5)可以反復(fù)利用。與液體發(fā)酵相比，包埋的大腸桿菌生產(chǎn)周期短、產(chǎn)物分離方便、能耗低、設(shè)備投資少且可大大改善操作條件。

20世紀(jì)80年代末，趙景聯(lián)[7]利用海藻酸鈉包埋重組大腸桿菌細(xì)胞合成了高純度的γ-氨基丁酸，間歇反應(yīng)轉(zhuǎn)化率可達(dá)100%。隨后，由英才等[8]利用固定的大腸桿菌AS1.881合成了L-天門(mén)冬氨酸，固定化菌株在pH值9.0、40℃的條件下反應(yīng)48 h，產(chǎn)物量達(dá)到最高。張曉梅等[9]通過(guò)固定化重組大腸桿菌JM109(pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇，成功地克服了底物抑制作用，產(chǎn)率大幅提高。

包埋法的優(yōu)點(diǎn)使其在大腸桿菌細(xì)胞固定化研究中占有較大的優(yōu)勢(shì)，但包埋法仍存在一些不足，如包埋材料對(duì)細(xì)胞的毒性作用、材料本身阻礙大分子底物和氧的擴(kuò)散、使用過(guò)程中的雜菌污染等，這些還需要進(jìn)行更深入的研究。

1.2 吸附法

吸附法又稱載體結(jié)合法，是利用帶電的微生物細(xì)胞和載體之間的靜電、表面張力和粘附力等作用，而使微生物細(xì)胞固定在載體表面和內(nèi)部的方法。該方法操作簡(jiǎn)單、大腸桿菌細(xì)胞活力損失小。

Torre等[10]分別利用多孔玻璃、網(wǎng)狀聚氨酯、合成海綿吸附大腸桿菌JM109/pBB1催化阿魏酸鹽合成香蘭素，發(fā)現(xiàn)合成海綿吸附后，催化效果最好，香蘭素的終濃度達(dá)到0.080 g·L-1，產(chǎn)率達(dá)0.019 g·L-1·h-1。

吸附法操作簡(jiǎn)單、成本較低，但所固定的大腸桿菌數(shù)目受所用載體的種類及其表面積的限制，并且大腸桿菌與載體作用力小，易脫落，只有通過(guò)與其它材料混合使用或者用交聯(lián)劑進(jìn)行交聯(lián)，才能得到更廣泛的應(yīng)用。

2 大腸桿菌細(xì)胞固定化載體

理想的大腸桿菌細(xì)胞固定化載體應(yīng)具備以下條件：機(jī)械強(qiáng)度高、壽命長(zhǎng)、容量大、價(jià)格低、性質(zhì)穩(wěn)定、不易被生物降解、固定化過(guò)程簡(jiǎn)單、常溫下易于成形；對(duì)于固定化活體細(xì)胞，固定化過(guò)程及固定化后對(duì)微生物無(wú)毒，生化及熱力學(xué)穩(wěn)定性好，基質(zhì)通透性好，沉淀分離性好，具有惰性，不干擾生物分子的功能。此外，還要根據(jù)具體的使用環(huán)境，來(lái)選擇大腸桿菌細(xì)胞固定化載體，或者優(yōu)化載體性能。目前應(yīng)用較多的大腸桿菌細(xì)胞固定化載體有葡聚糖類、海藻酸鹽、聚丙烯酰胺和聚乙烯醇、無(wú)機(jī)載體等。

2.1 葡聚糖類

應(yīng)用較廣的葡聚糖類材料主要有瓊脂糖凝膠、卡拉膠、黃原膠，它們的生物相容性良好，具有較大孔隙，可以允許高分子物質(zhì)的擴(kuò)散，并且不帶電荷，不會(huì)與底物或產(chǎn)物形成離子鍵，不影響大腸桿菌生長(zhǎng)，因此成為近年來(lái)研究最熱門(mén)的固定化載體材料之一[11]。

童群義等[12]用PVA-卡拉膠混合載體固定化大腸桿菌-酵母菌混合體系生產(chǎn)谷胱甘肽，產(chǎn)率達(dá)446.7 mg·L-1，成功降低了生產(chǎn)成本，固定化細(xì)胞連續(xù)使用10批次，其酶活力無(wú)顯著下降，也未見(jiàn)明顯的膨脹和破碎。Trelles等[13]固定化EscherichiacoliBL21催化合成腺嘌呤和次黃嘌呤核苷，分別對(duì)比了海藻酸鈉、瓊脂、瓊脂糖和聚丙烯酰胺包埋材料對(duì)產(chǎn)率的影響，發(fā)現(xiàn)在連續(xù)進(jìn)行30批次反應(yīng)后，相較于其它材料，固定在瓊脂糖上的大腸桿菌細(xì)胞在前26批次反應(yīng)均沒(méi)有酶活損失；在相同的時(shí)間內(nèi)，1 g瓊脂糖固定化菌株能合成182 g腺苷，相當(dāng)于73 g游離菌的產(chǎn)率；并且固定化大腸桿菌細(xì)胞在4℃存放6個(gè)月后酶活沒(méi)有明顯的下降。

但是葡聚糖類材料強(qiáng)度較低，容易溶脹、破碎，因此若要工業(yè)化應(yīng)用，還需要在提高機(jī)械強(qiáng)度、改善力學(xué)性能等方面進(jìn)一步探索，如與某些人工高分子材料混合使用，來(lái)提高其強(qiáng)度。

2.2 海藻酸鹽

海藻酸鹽是一種天然線性高聚物固定化介質(zhì)，其二價(jià)以上的鹽(Ca2+、Al3+) 為水不溶性鹽，因此可形成耐熱的凝膠，而且其易與蛋白質(zhì)、明膠等多種物質(zhì)共溶，并可與大腸桿菌混合形成均勻的懸浮液，具有機(jī)械性能較高、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、無(wú)毒、包埋效率高且價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，因此近年來(lái)應(yīng)用廣泛。

Lu等[14]用海藻酸鈉固定化E.coliBL21-P450-BM3細(xì)胞，成功催化吲哚合成靛藍(lán)，在pH值7.0、50℃時(shí)，合成靛藍(lán)的活性達(dá)到了游離細(xì)胞的94%，并且固定化細(xì)胞重復(fù)使用6批次后，產(chǎn)率沒(méi)有明顯的下降。Birgisson等[15]用海藻酸鈣固定化重組大腸桿菌細(xì)胞水解柚皮苷來(lái)生產(chǎn)α-L-鼠李糖，在50℃完全降解7.9 mmol·L-1的柚皮苷速率能達(dá)到1 mL·min-1，并且固定化細(xì)胞能連續(xù)使用3 d，第4 d降解能力下降10%～15%。牛衛(wèi)寧等[16]用海藻酸鈣包埋重組大腸桿菌E.coliJM109 (pBR322-MAT)細(xì)胞催化合成S-腺苷蛋氨酸，對(duì)比研究了聚乙烯醇和海藻酸鈣的包埋效果，發(fā)現(xiàn)用海藻酸鈣包埋重組大腸桿菌細(xì)胞合成S-腺苷蛋氨酸產(chǎn)率更高，包埋后小球的力學(xué)性能和傳質(zhì)效率較好。

然而在細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的高濃度磷酸鹽和Mg2+、K+、Na+等陽(yáng)離子溶液中，海藻酸鈉與CaCl2形成的海藻酸鈣凝膠小球不穩(wěn)定，容易破碎和溶解，因此，近年來(lái)展開(kāi)了對(duì)該載體的改性研究。海洪等[17]用聚乙烯亞胺溶液處理海藻酸鈣凝膠，發(fā)現(xiàn)用聚乙烯亞胺-戊二醛交聯(lián)和聚乙烯亞胺-高碘酸鈉來(lái)強(qiáng)化凝膠顆粒，能提高其抗磷酸鹽的能力和機(jī)械強(qiáng)度，并且酶活力沒(méi)有變化，操作穩(wěn)定性較好。

海藻酸鹽作為一種無(wú)毒、低成本的固定化載體，隨著其改性研究的深入，應(yīng)用會(huì)更加廣泛。

2.3 聚丙烯酰胺和聚乙烯醇

聚丙烯酰胺(PAM)由丙烯酰胺單體聚合而成，是一種水溶性線型高分子物質(zhì)，具有良好的機(jī)械、化學(xué)和熱穩(wěn)定性能。Prabhune等[18]將具有青霉素?；D(zhuǎn)移酶活性的大腸桿菌細(xì)胞固定于聚丙烯酰胺凝膠珠中，其水解活性顯著提高，且在使用90批次后，其酶活也沒(méi)有明顯損失。但是由于交聯(lián)過(guò)程中會(huì)放熱，細(xì)胞在固定化過(guò)程中酶活損失很大，因此對(duì)大腸桿菌表達(dá)的重組酶選擇性較高，使得其在大腸桿菌細(xì)胞的固定化中使用較少。

聚乙烯醇(PVA)是一種水溶性高分子聚合物,是目前國(guó)內(nèi)外研究較為廣泛的包埋固定化載體，其凝膠強(qiáng)度高、化學(xué)穩(wěn)定性好、抗微生物降解性能強(qiáng)、毒性很小、細(xì)胞的活性損失小，具有很大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。Huang等[19]用含硼硅酚醛樹(shù)脂PSB固定化E.coliATCC-11303細(xì)胞合成L-天冬氨酸，發(fā)現(xiàn)用聚乙烯亞胺處理的PSB固定化細(xì)胞后，細(xì)胞中L-天冬氨酸合成酶活性具有一定的特異性，而且底物的傳輸速率更快、凝膠強(qiáng)度更高，為L(zhǎng)-天冬氨酸的大規(guī)模生產(chǎn)提供了更優(yōu)越的條件。

由于PVA凝膠顆粒具有非常強(qiáng)的附聚傾向，不易制備成珠體，限制了其工業(yè)化應(yīng)用。為了增強(qiáng)其傳質(zhì)和成球能力，需要在材料混合改性方面進(jìn)行更深入的研究。

2.4 無(wú)機(jī)載體

多孔陶瓷、氧化鋁、活性炭、微孔玻璃、高嶺土、硅藻土等無(wú)機(jī)載體，大多具有多孔結(jié)構(gòu)，可以利用其吸附作用和電荷效應(yīng)將微生物或細(xì)胞固定。無(wú)機(jī)載體具有機(jī)械強(qiáng)度大、對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性、不易被微生物降解、耐酸堿、成本低、壽命長(zhǎng)等特性，是一類重要的吸附法固定化大腸桿菌細(xì)胞載體材料。

陳文謀等[20]用多孔陶瓷和浮石固定化重組大腸桿菌細(xì)胞合成β-葡聚糖，發(fā)酵液的酶活力分別達(dá)到97 U·mL-1和73 U·mL-1，比無(wú)載體液體發(fā)酵 (32 U·mL-1) 分別提高了3倍和2.3倍，并且固定化細(xì)胞具有良好的重復(fù)使用能力，在連續(xù)10批次實(shí)驗(yàn)后，多孔陶瓷和浮石固定化發(fā)酵液的酶活力分別不低于91 U·mL-1和71 U·mL-1。

由于菌株與無(wú)機(jī)材料之間的結(jié)合力弱，易脫落，用無(wú)機(jī)載體固定化的細(xì)胞不適宜在流化床中長(zhǎng)時(shí)間參與催化反應(yīng)，但可以利用無(wú)機(jī)載體孔隙大、傳質(zhì)容易等優(yōu)點(diǎn)，將其與其它傳質(zhì)效果差的材料混合使用，以提高產(chǎn)率。

3 固定化大腸桿菌細(xì)胞的應(yīng)用

近年來(lái)，隨著固定化細(xì)胞技術(shù)的日趨成熟，一些固定化大腸桿菌細(xì)胞的研究成果已經(jīng)應(yīng)用于制藥工業(yè)、環(huán)境保護(hù)、能源開(kāi)發(fā)等領(lǐng)域。

3.1 小分子藥物生產(chǎn)

很多小分子藥物是利用重組大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行生產(chǎn)的，如果采用游離細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)，存在產(chǎn)物分離純化困難、不易操作、生產(chǎn)成本較高等缺點(diǎn)。如果將重組大腸桿菌進(jìn)行固定化培養(yǎng)，可以簡(jiǎn)化目的產(chǎn)物的分離純化步驟，生產(chǎn)成本大幅降低。

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，是生物體內(nèi)最重要的非蛋白巰基化合物之一，廣泛用于治療肝臟疾病、腫瘤、氧中毒、衰老和內(nèi)分泌疾病。沈立新等[21]構(gòu)建了重組E.coliBL21 (pTrc-gsh) 菌，利用卡拉膠固定化后催化合成谷胱甘肽，采用延緩甘氨酸加入的方法，控制GSH的合成分階段進(jìn)行，有效削弱了GSH的反饋抑制作用，GSH 的產(chǎn)率提高17.5%；在填充床中對(duì)催化合成GSH進(jìn)行了考察，GSH合成量達(dá)1.24 g·L-1，比直接加入ATP提高24.2%。

γ-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid，GABA)是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有效的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、保持神經(jīng)安定、改善腦機(jī)能、保肝護(hù)腎等作用。早在1883年γ-氨基丁酸就被人工合成。趙景聯(lián)[7]用海藻酸鈉固定化大腸桿菌細(xì)胞得到γ-氨基丁酸，并在間歇反應(yīng)、連續(xù)攪拌式反應(yīng)及連續(xù)柱式反應(yīng)等擴(kuò)大生產(chǎn)中獲得了轉(zhuǎn)化率達(dá)85%以上的γ-氨基丁酸。隨后，沈俞等[22]又用卡拉膠與明膠復(fù)合載體固定化E.coli-AS1-505，結(jié)果表明,在卡拉膠與明膠質(zhì)量比為1.5∶1時(shí)， 12 g·L-1的混合膠在60 g·L-1的 KCl溶液中固定化80 g·L-1的菌體，3 h后，酶活回收率最高；包埋量為100 g·L-1的固定化細(xì)胞重復(fù)反應(yīng)7批次，可將40 g·L-1的底物完全轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸。

牛衛(wèi)寧等[16]對(duì)固定化E.coliJM109(pBR322-MAT)催化合成S-腺苷蛋氨酸的大腸桿菌細(xì)胞固定化方法和材料、反應(yīng)條件等進(jìn)行了比較深入的研究。結(jié)果表明，采用2%海藻酸鈣固定化細(xì)胞連續(xù)反應(yīng)5批次后，固定化細(xì)胞酶活力為初始酶活力的91%；固定化細(xì)胞在35℃反應(yīng)8 h，底物轉(zhuǎn)化率超過(guò)95%。

3.2 廢水處理

大腸桿菌細(xì)胞固定化技術(shù)以其微生物密度高、耐毒害能力強(qiáng)、微生物流失少、處理設(shè)備小型化等優(yōu)點(diǎn)在廢水處理領(lǐng)域中引起了普遍關(guān)注。

謝珊等[23]利用固定化基因工程菌E.coliBL21/pET2opd2b1處理有機(jī)磷混合農(nóng)藥廢水，結(jié)果表明，固定化大腸桿菌細(xì)胞的降解速率與懸浮工程菌細(xì)胞相比有所降低，主要是受底物傳質(zhì)過(guò)程的限制和固定化過(guò)程對(duì)細(xì)胞活性的損害的影響，但固定化細(xì)胞比懸浮細(xì)胞有更高的比降解速率，工程菌細(xì)胞的穩(wěn)定性較好(在50 d內(nèi)活性保持良好)，而且與懸浮細(xì)胞相比，工程菌細(xì)胞不易流失，單位反應(yīng)體積內(nèi)的細(xì)胞密度增加了，工程菌細(xì)胞的耐毒害能力也大大增強(qiáng)，因此更適宜于實(shí)際廢水處理和大規(guī)模應(yīng)用。

萬(wàn)瓊等[24]用固定化重組大腸桿菌細(xì)胞處理尿素廠廢水，中試研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)21 h后，廢水中總氮、氨氮和尿素的去除率可達(dá)90%以上，該法工藝簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)，基本不產(chǎn)生污泥，對(duì)高濃度氨氮和有機(jī)氮有較強(qiáng)的抗抑制作用。

3.3 能源開(kāi)發(fā)和化工原料的生產(chǎn)

由于化石燃料的燃燒已對(duì)全球環(huán)境造成嚴(yán)重污染，甚至對(duì)人類生存造成威脅。氫能作為理想的清潔能源之一，引起了人們的廣泛重視。目前，氫氣的工業(yè)化生產(chǎn)大都采用物化法，需要消耗大量的電能和礦物原料，生產(chǎn)成本過(guò)高，從而限制了氫能的發(fā)展。

Yokoi等[25]以葡萄糖為底物對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌E.aerogenesHO-39菌株進(jìn)行的非固定化實(shí)驗(yàn)中，產(chǎn)氫速率僅為120 mL·L-1·h-1；采用多孔玻璃作為載體對(duì)菌體細(xì)胞進(jìn)行固定化后，產(chǎn)氫速率提高到850 mL·L-1·h-1，較非固定化細(xì)胞產(chǎn)氫速率提高了7倍。

Chittibabu等[26]構(gòu)建了重組菌E.cloacaeIIT-BT-08，并對(duì)其進(jìn)行固定化，產(chǎn)氫量較野生型菌株提高了3.12 mol·(mol葡萄糖)-1，最高產(chǎn)氫速率為66 mmol·h-1，而相同條件下游離菌催化產(chǎn)氫速率僅為0.55 mmol·h-1。

1,3-丙二醇(1,3-Propanediol,1,3-PD)是一種重要的溶劑和化工原料。為了得到高產(chǎn)量的1,3-PD，張曉梅等[9]構(gòu)建了工程菌JM109 (pHsh-dhaB-dhaG-dhaF-yqhD)，在最適培養(yǎng)條件下，1,3-PD的產(chǎn)量和生產(chǎn)能力分別達(dá)到43.1 g·L-1和1.54 g·L-1·h-1；將該菌細(xì)胞用海藻酸鈣固定化后，細(xì)胞對(duì)底物甘油和產(chǎn)物1,3-PD的耐受力有了明顯的提高，1,3-PD產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率及生產(chǎn)能力分別可達(dá)61.5 g·L-1、76.8%和2.57 g·L-1·h-1。

4 結(jié)語(yǔ)

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成為表達(dá)外源蛋白最常用的表達(dá)系統(tǒng)之一，而固定化大腸桿菌細(xì)胞因操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)在工業(yè)化生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用前景。

大腸桿菌細(xì)胞固定化技術(shù)還需要在以下方面進(jìn)行更深入的研究：(1)利用磁性聚合物微球、超臨界技術(shù)、納米技術(shù)等改進(jìn)大腸桿菌細(xì)胞固定化方法。(2)尋找價(jià)廉、半衰期長(zhǎng)、底物易于擴(kuò)散、對(duì)大腸桿菌細(xì)胞毒性小的固定化載體材料，進(jìn)一步研究混合使用各種材料，令材料間優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。(3)對(duì)大腸桿菌催化反應(yīng)機(jī)理及動(dòng)力學(xué)進(jìn)行更深入的研究，完善高效的固定化反應(yīng)工藝，使其滿足大型化、自動(dòng)化和連續(xù)化生產(chǎn)的需要，充分體現(xiàn)固定化細(xì)胞生物反應(yīng)器的優(yōu)勢(shì)。(4)在多種菌株共生的固定化體系以及生物再生技術(shù)方面也有待更深入研究。

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