張登祿，韓金祥，崔亞洲，周小艷

胰腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 C14orf166 的真核表達及其蛋白相互作用的蛋白質(zhì)組學(xué)篩選

張登祿，韓金祥，崔亞洲，周小艷

【摘要】

目的旨在對胰腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 C14orf166 進行真核重組表達，并在此基礎(chǔ)上結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)方法初步篩選其相互作用蛋白，為進一步研究 C14orf166 在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用提供研究基礎(chǔ)。

方法構(gòu)建人 C14orf166 的帶雙標簽的真核表達載體pcDNA3.1-Flag-C14orf166-His，通過脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染至人胚腎 293T 細胞。采用 Ni-agrose 進行 His 標簽蛋白的pull-down 純化，分離 C14orf166 的蛋白結(jié)合復(fù)合體，對蛋白混合物進行 SDS-PAGE 分析，選擇差異條帶，進行MALDI-TOF-TOF 質(zhì)譜鑒定。

結(jié)果在 293T 細胞中重組表達了 C14orf166 蛋白，對C14orf166 蛋白復(fù)合體進行分離鑒定后，篩選出 RS8、EFCB9 和 NRAP 3 個可能與 C14orf166 相互作用的蛋白。

結(jié)論基因重組表達結(jié)合 pull-down 和蛋白質(zhì)組學(xué)方法可以發(fā)現(xiàn)新的相互作用蛋白，為進一步了解 C14orf166 在腫瘤發(fā)病機制中的作用提供了新的線索。

【關(guān)鍵詞】胰腺腫瘤； 蛋白質(zhì)組學(xué)； 基因表達

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, 5(3):186-190

C14orf166 蛋白相對分子量約為 26 kD，廣泛存在于人體各組織中[1]。我們在前期研究中通過定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法首次發(fā)現(xiàn) C14orf166 在轉(zhuǎn)移的胰腺癌中高表達[2]，近期有研究進一步支持C14orf166 可能參與了胰腺癌的發(fā)病過程，但其機制尚不清楚[3]。

本研究通過基因轉(zhuǎn)染的方法在真核細胞中表達帶標簽的 C14orf166 重組蛋白，然后采用pull-down 的方法獲得 C14orf166 蛋白及其相互作用蛋白的復(fù)合物，再利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對蛋白復(fù)合體進行成分鑒定，以期發(fā)現(xiàn)新的 C14orf166的相互作用蛋白，為進一步研究其促轉(zhuǎn)移機制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所需大腸桿菌菌株 DH5α 和質(zhì)粒pcDNA3.1(-) 均為本實驗室保存；DMEM 培養(yǎng)基購自美國 Gibco 公司；限制性內(nèi)切酶 Nhe I、Xho I、T4 連接酶、RT-PCR 試劑盒均購自日本 Takara公司；Protein A and G agrose 及鼠源的 His 標簽抗體均購自德國默克公司；兔源的 C14orf166 單克隆抗體購自美國 Aviva 公司；鼠源的 β-actin 抗體購自美國 Abcam 公司；山羊抗鼠二抗和山羊抗兔二抗購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine2000 購自美國 Invitrogen 公司；Ni-agrose 購自北京康為世紀生物科技有限公司。

293T 細胞株系本實驗保存，用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，常規(guī)消化傳代。

1.2 實驗方法

1.2.1 從胰腺癌 Panc-1 細胞中克隆 C14orf166基因 Trizol 法從胰腺癌 Panc-1 細胞中提取總RNA 做為模板。利用 RT-PCR 試劑盒擴增C14orf166 基因核心編碼區(qū)。上游引物：5’ GTGATG ATGACGATAAGTTCCGACGCAAGTT 3’，下游引物：5’ GGCATGATGATGGTGATGTCATCTTCCAA CT 3’，擴增片段長度約為 750 bp。然后利用 PCR的方法引入酶切位點（Nhe I 和 Xho I）和標簽（Flag和 His）。上游引物：5’ CGCTAGCATGGATTACAA GGATGATGACGAT 3’，下游引物：5’ GCCTCGAGT TAATGATGATGATGGTGATGCAG 3’。PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性 5 min，94 ℃，30 s；59 ℃，45 s；72 ℃，90 s；循環(huán) 39 次。反應(yīng)完畢，取 PCR產(chǎn)物進行 1% 瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。1.2.2 C14orf166 重組載體的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化擴增及鑒定 用 Nhe I 和 Xho I 分別對 C14orf166 基因和pcDNA3.1(-) 進行雙酶切，酶切片段經(jīng)瓊脂糖電泳回收后經(jīng) T4 連接酶連接后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌 DH5α，挑取陽性單克隆，在含氨芐西林的 LB培養(yǎng)液（100 μg/ml）中搖菌培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，提取質(zhì)粒。利用 Nhe I 和 Xho I 雙酶切驗證。同時將質(zhì)粒送 Invitrogen 公司測序。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒命名為 pcDNA3.1- Flag-C14orf166-His。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 參照 Invitrogen Lipofectamine 2000 說明書進行操作，將 pcDNA3.1-Flag-C14orf166-His 和 pcDNA3.1 分別轉(zhuǎn)染 293T 細胞。

1.2.4 Western-blot 檢測 C14orf166 蛋白的表達 細胞轉(zhuǎn)染 48 h 后，離心收集細胞，用非變性細胞裂解液（1% NP-40，1 mmol/L EDTA，50 mmol/L KCl，20 mmol/L HEPES-KOH，pH 7.8）冰上裂解30 min，超速離心（13 000 × g）提總蛋白。Bradford法測蛋白濃度。每孔上樣量 40 μg。采用 12.5% 的SDS-PAGE 膠分離蛋白，將目的條帶轉(zhuǎn)到 NC 膜上 ECL 顯色，以 β-actin 作為內(nèi)參驗證蛋白含量。

1.2.5 pull-dwon 實驗 細胞轉(zhuǎn)染（參照說明書）48 h 后，離心收集細胞（約 107個），非變性裂解液（配方同上）冰上裂解 30 min，超速離心（13 000 × g）提總蛋白，Bradford 法蛋白定量，用結(jié)合緩沖液（Tris-HCl 7.9，10 mmol/L咪唑，0.5 mol/L NaCl）稀釋蛋白濃度至 2 mg/ml 左右；加 Protein A and G agrose 去除非特異性，加 Ni-agrose 100 冰上緩緩搖動 30 min 以上，450 × g 離心 5 min，收集沉淀，用結(jié)合緩沖液洗 3 次；加 40 μl 洗脫液（Tris-HCl 7.9，500 mmol/L 咪唑，0.5 mmol/L NaCl）和 10 μl SDS上樣 buffer，煮沸 3 min。

1.2.6 SDS-PAGE 制 12.5% 的 SDS 聚丙烯酰胺凝膠；每孔上樣 20 μl；電泳完畢之后，考馬斯亮藍法染色，比較空轉(zhuǎn)組和轉(zhuǎn) C14orf166 組的差異條帶。

1.2.7 膠內(nèi)酶解和 MALDI-TOF-MS/MS 鑒定 將 7 個差異條帶從凝膠上切割下來，用脫色工作液（50 mmol/L NH4HCO3和乙腈 1∶1 用前混合）37 ℃ 水浴脫色，乙腈脫水直至膠塊變?yōu)榘咨?。?0.2% DTT 還原，1% 的 IAA 氨基化，乙腈脫水。再用 10 μg/μl 胰酶（trypsin）37 ℃ 水浴酶解過夜。用萃取液（50 % 乙腈 + 5 % 三氟乙酸）將蛋白從膠中萃取出來，真空離心濃縮抽干樣品。然后再用溶解液（30 % 乙腈 + 1 % 三氟乙酸）溶解樣品，取 0.3 μl 樣品與等體積飽和的 CHCA 基質(zhì)液混合，點樣于不銹鋼點樣板上，空氣中干燥，然后在 MALDI-TOF-MS/MS 質(zhì)譜儀上分析。當質(zhì)荷比達到 800 ～ 3500 D 時，獲得肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）。選取最強的 5 個峰值來獲得 MS/MS 數(shù)值。最后通過 Mascot 軟件檢索 Swiss Prot 數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 人 C14orf166 的核心編碼區(qū) DNA 制備

采用 RT-PCR 從人胰腺癌 Panc-1 擴增C14orf166 的核心編碼區(qū)，如圖 1 所示，在 750 bp處可見一清晰條帶，與實際人 C14orf166 基因長度一致。

圖 1 RT-PCR 擴增出的 C14orf166 基因核心編碼區(qū)Figure 1 CDS of C14orf166 gene was obtainded by RT-PCR

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒 pcDNA3.1-C14orf166 經(jīng) Nhe I 和Xho I 雙酶切，產(chǎn)生了兩條片段，其中一條在 750 bp附近（圖 2）。測序結(jié)果進一步證實 C14orf166 克隆片段的插入方向正確，插入序列符合要求，測序發(fā)現(xiàn)克隆的 C14orf166 基因片段的編碼區(qū)序列和Genank 中報道的序列完全一致。

2.3 Western-blot 檢測外源 C14orf166 蛋白在細胞中的表達

293T 細胞轉(zhuǎn)染 48 h 后提總蛋白，分別用 His抗體和 C14orf166 蛋白抗體進行 western blot 驗證，實驗表明轉(zhuǎn)染后細胞中的 C14orf166 蛋白表達量明顯提高（圖 3），并且?guī)?His 標簽（圖 4）。即獲得了高表達帶 His 標簽的 C14orf166 蛋白的細胞。

圖 2 酶切驗證結(jié)果Figure 2 Restriction enzyme analysis result

圖 3 用 C14orf166 抗體 western blots 結(jié)果Figure 3 Western blots result using C14orf166 antibody

圖 4 用 His 抗體 western blots 結(jié)果Figure 4 Western blots result using His antibody

2.4 C14orf166 蛋白復(fù)合體的分離和質(zhì)譜鑒定

將瞬時轉(zhuǎn)染 48 h 的 293T 細胞溫和裂解法抽提總蛋白，進行 pull-down 實驗，得到兩組蛋白質(zhì)復(fù)合物，通過 SDS-PAGE 分離得到 7 條差異條帶（圖 5），其中最明顯的條帶 S6 通過質(zhì)譜鑒定是C14orf166 蛋白，其余條帶里的蛋白可能與C14orf166 相互作用。

我們對 7 條差異條帶進行質(zhì)譜分析初步得到3 種蛋白：40S ribosomal protein S8（RS8）、EF-hand calcium-binding domain-containing protein 9（EFCB9）、Nebulin-related-anchoring protein（NRAP），其中RS8 與 C14orf166 存在于 S6 條帶中，NRAP 存在于 S2 條帶中，EFCB9 存在于 S3 條帶中。

圖 5 SDS-PAGE 結(jié)果Figure 5 SDS-PAGE results

3 討論

C14orf166 基因定位于人 14 號染色體上，基因全長 1064 bp，核心編碼區(qū) 735 bp，編碼一個分子量約 26 kD 的蛋白分子，廣泛分布于人體各種組織[1]，主要表達于細胞質(zhì)，在細胞核中也有表達[4]。但其分子功能尚不清楚。關(guān)于該蛋白的報道最早見于 2001 年，Huarte 等[4]研究發(fā)現(xiàn) C14orf166與甲型流感病毒聚合酶復(fù)合物 PA 亞基相互作用，后來 Pérez-González 等[5]進一步證明了上述相互作用調(diào)節(jié) RNA 聚合酶 II 活性，影響 mRNA 的轉(zhuǎn)錄。近年來研究發(fā)現(xiàn) C14orf166 與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)[1-3]。但其內(nèi)在機制尚不清楚。

任何一個蛋白質(zhì)起作用都是通過與其他蛋白相互作用實現(xiàn)的，研究 C14orf166 蛋白的功能作用機制必需從相互作用蛋白研究開始。親和層析或pull-down 與質(zhì)譜串聯(lián)的技術(shù)已經(jīng)成為研究蛋白相互作用的重要的方法[6-7]。其基本流程是：在真核或原核細胞中轉(zhuǎn)染一個帶標簽的外源基因的表達載體，讓其在細胞中表達，參與細胞的生理生化反應(yīng)，然后利用標簽抗體將外源蛋白連同與其組成復(fù)合物的蛋白分子一起 pull-down 或純化出來，然后對產(chǎn)物進行分析鑒定，這樣就能得到一組與外源蛋白直接或間接相互作用的蛋白。

本研究首先選擇了常用的 pcDNA3.1 真核表達載體，構(gòu)建了 C14orf166 真核表達載體，并在C14orf166 的兩端分別添加了 Flag 和 His 標簽。我們選擇了易轉(zhuǎn)染、表達效率高的 293T 細胞做為靶細胞。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，在細胞中表達帶標簽的 C14orf166蛋白。通過 His pull-down 的方法成功地分離了 C14orf166 的蛋白復(fù)合體，表明這一方法對于研究目的蛋白特別是低豐度蛋白的相互作用是可行的。

質(zhì)譜鑒定初步得到了 RS8、EFCB9 和 NRAP 3 個可能與 C14orf166 相互作用的蛋白。RS8 是一種核糖體小亞基蛋白，參與蛋白的翻譯。關(guān)于該蛋白沒有直接的文獻報道。Wang 等[8]研究發(fā)現(xiàn)CNG6_MOUSE（C14orf166 同系物）和 RS3A 都與小鼠腦發(fā)育有關(guān)。另有文獻報道 RS13 通過下調(diào)P27 促進胃癌的發(fā)展[9]。NRAP 是伴肌動蛋白相關(guān)的錨定蛋白，參與肌原纖維的形成[10]。EFCB9 是一種含有鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的 EF 手型蛋白，具有類似結(jié)構(gòu)域的蛋白有很多，例如 S100。有文獻報道 S100 在胃癌中高表達，可能參與胃癌的發(fā)展[11]。

僅僅通過一兩種方法并不能完全確定蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系，在今后的研究中將對這些潛在的相互作用蛋白利用其他方法進行進一步的驗證和功能研究，以闡明 C14orf166在腫瘤發(fā)病機制中的可能作用。

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ObjectiveThe aim of this study was to express C14orf166 in eukaryotic cells, and to screen and identify proteins interacting with C14orf166, which will provide foundation for further study on its function on tumor metastasis.

MethodsConstructed eukaryotic expression vector of human C14orf166 gene pcDNA3.1- Flag-C14orf166-His with two tags, then the recombinated vector were transfected into 293T cells by Lipofectamine2000.Using Ni-agrose to pull-down His labeled Proteins, then C14orf166 compouds were obtained. SDS-PAGE was used to separate the compouds, then different straps were selected and identified by MALDI-TOF- TOF.

ResultsC14orf166 was successfully overexpressed in 293T cells, three poteintial interaction proteins of C14orf166 were identified.

ConclusionGene recombination expression combined with pull-down and Proteomics methods are eligible to find out novelinteracting proteins, which provide new clues to investigate the effect of C14orf166 on tumor pathogenesis.

【Key words】Pancreatic neoplasms; Proteomics; Gene expression

Author Affiliations: Shandong Academy of Medical Sciences/Shandong Medical Biotechnological Center/Key Laboratory for Biotech Drugs of Health Ministry, Key Laboratory for Medical Molecular Biology of Shandong Province, Jinan 250062, China

Corresponding author:HAN Jin-xiang, Email: jxhan@sdu.edu.cn www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2010, 5(3):186-190

基金項目：山東省科技攻關(guān)計劃項目（2005GG1102003）

作者單位：250062 濟南，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心/國家衛(wèi)生部生物技術(shù)藥物重點實驗室/山東省現(xiàn)代醫(yī)用藥物與技術(shù)重點實驗室

通訊作者：韓金祥，Email：jxhan@sdu.edu.cn

收稿日期：2010-02-08

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.03.005

The eukaryotic expression of pancreatic cancer relted gene C14orf166 and screening of its interacting proteins by Proteomics methods

ZHANG Deng-lu, HAN Jin-xiang, CUI Ya-zhou, ZHOU Xiao-yan

【Abstract】