盧陸洋，秦竹，徐金庫，李新松

一株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌的分離及其代謝產(chǎn)物的研究

盧陸洋，秦竹，徐金庫，李新松

【摘要】

目的從南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei）中分離產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌，并研究其抗腫瘤細(xì)胞活性。

方法采用組織塊法從南方紅豆杉的樹根部、樹主干內(nèi)層、側(cè)枝及針葉分離純化內(nèi)生真菌，經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)，抽提發(fā)酵粗產(chǎn)物，以標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇為對照進(jìn)行薄層層析（TLC）、紫外光譜（UV）、HPLC、質(zhì)譜（MS）分析。同時將經(jīng)上述方法確認(rèn)后的內(nèi)生真菌產(chǎn)的紫杉醇作用于人宮頸癌 HeLa 細(xì)胞，采用 MTT 法分析其抗腫瘤細(xì)胞活性。

結(jié)果從南方紅豆杉主干韌皮部分離得到 1 株產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌 D62，其紫杉醇產(chǎn)量為 148.95 μg/L。對菌株 D62 的菌落和菌絲體的形態(tài)學(xué)分析表明其屬于鐮刀屬（Fusarium sp.）。將該菌株產(chǎn)紫杉醇作用于 HeLa 細(xì)胞，表現(xiàn)出明顯的致細(xì)胞凋亡作用。

結(jié)論南方紅豆杉中分離得到的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌 D62具有優(yōu)良的發(fā)酵特性。

【關(guān)鍵詞】抗腫瘤藥，植物； 真菌； 發(fā)酵； 紅豆杉屬

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, 5(3):202-207

紫杉醇（Paclitaxel，商品名 Taxol） 是復(fù)雜的二萜類衍生物，最早于 1971 年由 Wani 等[1]從短葉紅豆杉（Taxus breviifolia Nutt.）的樹皮中分離，具有獨(dú)特的催化微管蛋白迅速合成微管作用，并可與微管結(jié)合，防止微管解聚[2]。紫杉醇對卵巢癌、乳腺癌等，尤其對耐常規(guī)藥物的腫瘤有較好的療效，被美國腫瘤研究所認(rèn)為是人類未來 20 年最有效的抗癌藥物之一。

目前，紫杉醇主要從紅豆杉的樹皮中提取。由于紅豆杉生長周期長，資源缺乏，且天然紅豆杉在世界范圍內(nèi)數(shù)量很少，而樹皮中紫杉醇含量僅為干重的 0.01% ～ 0.03%，僅僅從樹皮中提取紫杉醇無法滿足市場需求，造成了紫杉醇市場價格昂貴的同時，也嚴(yán)重破壞了自然資源[3]。為此，國內(nèi)外學(xué)者不斷研究生產(chǎn)紫杉醇的其他方法，包括紫杉醇的化學(xué)全合成和半合成，紅豆杉愈傷組織培養(yǎng)和細(xì)胞懸浮培養(yǎng)等[4-6]。然而因?yàn)檫@些方法成本高、產(chǎn)率低，目前還無法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

1993 年，Stierle 等[7]首次報道短葉紅豆杉中分離出了可產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌 Taxomyces andreanae，這為生產(chǎn)紫杉醇提供了潛在新途徑。內(nèi)生真菌生長迅速，培養(yǎng)基成本相對較低，菌種易于改良，可以大幅度提高紫杉醇產(chǎn)量，同時也能保護(hù)紅豆杉資源，維持生態(tài)平衡。此后，國內(nèi)外研究者相繼報道了從不同的紅豆杉種類中分離出不同的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌[8-11]。為了拓展紅豆杉內(nèi)生真菌的種群資源，尋找發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇更有效的潛在途徑，本研究以南方紅豆杉（Taxus chinensis var. mairei）為材料，從其中分離純化內(nèi)生真菌，并通過薄層層析（TLC）、紫外光譜（UV）、HPLC、質(zhì)譜（MS）對其代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，以確定其是否為紫杉醇，同時分析紫杉醇的抗腫瘤細(xì)胞活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 南方紅豆杉采集于江蘇省紫金山，按照不同方位（向陽面和背陽面）隨機(jī)選取樹根部、樹主干內(nèi)層、側(cè)枝及針葉，裝入滅菌紙袋內(nèi)編號備用。

1.1.2 培養(yǎng)基配置 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB）[12]以及發(fā)酵培養(yǎng)基（S-7）[7]參照文獻(xiàn)配制；HeLa 細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM 培養(yǎng)基（含 10% 胎牛血清以及100 μg/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素）。

1.1.3 主要試劑和儀器 HeLa 細(xì)胞由東南大學(xué)生物材料和藥物釋放實(shí)驗(yàn)室提供；紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品購自阿拉丁試劑（中國）有限公司，純度 ＞ 99.0%（HPLC）；甲醇為色譜純，其余試劑為分析純，均購自國藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑廠。Heλios γ 紫外分光光度計為美國熱電公司產(chǎn)品；Agilent-1100 高效液相色譜儀為美國 Agilent 公司產(chǎn)品；Agilent-1100 LC/MSD 液質(zhì)聯(lián)用儀為美國 Agilent 公司產(chǎn)品；Bio-Rad Model 680 酶標(biāo)儀為美國伯樂公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 樣品預(yù)處理 用無菌水洗凈南方紅豆杉表面，無菌刀剝?nèi)ネ馄?，取?nèi)皮和韌皮部，同時剪成0.5 cm × 0.5 cm 的小塊，葉剪去外緣后切成 0.5 cm的小段，然后分別用 75% 乙醇浸泡 5 ～ 10 min 表面消毒，再用無菌水沖洗樣品 5 min 去除表面消毒劑。

1.2.2 內(nèi)生真菌分離和純化 經(jīng)過預(yù)處理的材料分別接種于 PDA 固體培養(yǎng)基上，使材料完全緊貼培養(yǎng)基，25 ℃ 培養(yǎng)，待新菌落長出后，用菌絲尖端純化法[12]挑取不同形態(tài)菌絲，接種于新鮮PDA 培養(yǎng)基上，如此反復(fù)純化多次，得到純化菌株，并移至 PDA 斜面培養(yǎng)基上，于 4 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)和產(chǎn)物提取 取上述保存的內(nèi)生菌株，轉(zhuǎn)接于 PDA 固體培養(yǎng)基上，25 ℃ 活化3 d，然后轉(zhuǎn)入 250 ml 三角瓶中（含 PDA 液體培養(yǎng)基 50 ml）作為種子培養(yǎng)基，25 ℃、150 r/min 培養(yǎng) 3 d。以 5%（v/v）接種量轉(zhuǎn)入 500 ml 三角瓶中（含 S-7 發(fā)酵培養(yǎng)基 200 ml），25 ℃、150 r/min發(fā)酵培養(yǎng) 14 d。發(fā)酵結(jié)束后真空抽濾，分別收集濾液和菌絲體。濾液用等體積的二氯甲烷萃取 3 次，合并上層有機(jī)相；菌絲體凍融后充分研磨，加入30 ml 乙酸乙酯，超聲萃取 15 min，有機(jī)相與前述有機(jī)相合并，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上 35 ℃ 去除有機(jī)溶劑，得到的萃取物溶于 1 ml 甲醇中，供檢測用。

1.2.4 TLC 分析 將紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇中配制成濃度為 1 mg/ml 的對照品。用點(diǎn)樣毛細(xì)管將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別在硅膠板 GF254（5 cm × 20 cm）上點(diǎn)樣。展層系統(tǒng)為 A，氯仿/甲醇（7∶l，v/v）；B，二氯甲烷/甲醇 （20∶1，v/v），當(dāng)前沿跑至距薄層板上端 1 cm 處時終止。254 nm 紫外燈下觀察熒光。再用 1% 香草醛的濃硫酸噴霧顯色，觀察有無紫杉醇特征性藍(lán)色斑點(diǎn)出現(xiàn)，并計算 Rf值。

1.2.5 UV 分析 層析結(jié)束后，在 254 nm 紫外燈下選取與標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇有相同 Rf值的樣品區(qū)域，將該區(qū)域硅膠沿展層方向小心刮取，用 1 ml 甲醇溶解，超聲洗脫，經(jīng)微孔濾膜過濾后得測定洗脫液。將上述標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液分別在 200 ～ 600 nm范圍內(nèi)紫外掃描，測其最大紫外吸收波長，并作對比。

1.2.6 HPLC 分析 將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別進(jìn)行HPLC 分析。色譜條件：色譜柱為 Zorbax SB-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；柱溫為 30 ℃；流動相為甲醇/水（65∶35，v/v）；紫外檢測波長 227 nm，流速 1.0 ml/min，樣品進(jìn)樣量 20 μl，標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量 5 μl。

1.2.7 MS 分析 將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別進(jìn)行 MS分析。質(zhì)譜條件：檢測模式是全范圍掃描“Scan”模式，離子極性 Pos（正離子）、離子化方式 ESI、離子相對分子質(zhì)量范圍 50 ～ 1500、干燥氣溫度350 ℃、CID 電壓 70 V。色譜柱為 SB-Aq（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇/水（70∶30，v/v），流速：0.3 ml/min，柱溫：30 ℃。

1.2.8 發(fā)酵粗提物的抗腫瘤細(xì)胞活性檢測 以HeLa 細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)用癌細(xì)胞，采用體外細(xì)胞毒性測定的 MTT 法[13]檢測內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提物是否具有抗腫瘤細(xì)胞活性。培養(yǎng)好的 HeLa 細(xì)胞用內(nèi)含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸浮液，計數(shù)后接種至 96 孔板，5 × 103個細(xì)胞/100 μl/孔，37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)。24 h 后吸棄上清液，加入含不同終濃度粗提物（待測的粗提物溶于甲醇中，1 mg/ml，用 DMEM 培養(yǎng)基依次做 1∶100，1∶200，1∶500 濃度稀釋）的培養(yǎng)基 100 μl/孔，每個濃度設(shè)置 6 個重復(fù)孔。同時以添加相同濃度標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇的培養(yǎng)基為陽性對照，以完全培養(yǎng)基為陰性對照，并且設(shè)置添加相同濃度甲醇的培養(yǎng)基，觀察甲醇對 HeLa 細(xì)胞的影響。24、48、72 h 后分別加入 5 mg/ml 的 MTT 溶液20 μl，37 ℃ 反應(yīng) 4 h 后終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入 150 μl 二甲基亞砜。置搖床上低速振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀吸光度（OD490nm）值處測量各孔的吸光值。按下列公式計算內(nèi)生真菌粗提物對 HeLa 細(xì)胞的抑制率：

抑制率 =（對照組 OD 值 － 實(shí)驗(yàn)組 OD 值）/對照組 OD 值 × 100%

1.2.9 內(nèi)生真菌的分類 根據(jù)所分離的內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，包括菌落的生長速度、菌絲體以及孢子的特征、分泌色素等，參照絲狀真菌的分類鑒定方法[14]將上述真菌菌株鑒定到適當(dāng)?shù)膶佟?/p>

2 結(jié)果

2.1 菌種成功分離

獲得了 91 株單一的絲狀真菌。其主要分離部位為韌皮部，因植物材料表面嚴(yán)格消毒并無菌操作，故上述純化菌株均可確認(rèn)為是南方紅豆杉的內(nèi)生真菌。

2.2 TLC

TLC 初步分析結(jié)果見表 1，4 株菌株的發(fā)酵提取物與標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇 Rf值相同或相似處出現(xiàn)一特異性藍(lán)色斑點(diǎn)，且 24 h 后藍(lán)色斑點(diǎn)轉(zhuǎn)灰。試驗(yàn)結(jié)果初步表明，這些菌株可能分泌紫杉醇或紫杉烷類化合物。

2.3 UV

如圖 1，標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇在 273 nm 處有最大吸收波長，而與之基本相同的是菌株 D62 的發(fā)酵純化產(chǎn)物也顯示在 273 nm 處有最大吸收波長。

表 1 菌株發(fā)酵提取物的薄層層析結(jié)果Table 1 Thin-layer chromatography analysis of taxol excreted by endophytic fungal

圖 1 菌株 D62 發(fā)酵液提取物（A）與標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇（B）的最大紫外吸收圖Figure 1 UV absorption spectrum of fungal extract (A) and authentic taxol (B)

圖 2 HPLC 檢測菌株D62 發(fā)酵液提取物（A）與標(biāo)準(zhǔn)品紫杉醇（B）圖譜Figure 2 HPLC analysis of fungal extract (A) and authentic taxol (B)

圖 3 MS 檢測菌株 D62 發(fā)酵液提取物（A）與標(biāo)準(zhǔn)品紫杉醇（B）的圖譜Figure 3 MS analysis of fungal extract (A) and authtic taxol (B)

2.4 HPLC

HPLC 分析結(jié)果顯示（圖 2），標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇的保留時間在 12.02 min，而與之相似的是菌株 D62發(fā)酵純化產(chǎn)物的保留時間在 12.09 min。由此可以進(jìn)一步判斷菌株 D62 發(fā)酵純化產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇峰為同一物質(zhì)。并可根據(jù)峰面積推算出其發(fā)酵液中紫杉醇含量為 148.95 μg/L。

2.5 MS

MS 掃描結(jié)果顯示（圖 3），菌株 D62 發(fā)酵純化產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇都出現(xiàn)了特有的準(zhǔn)分子離子峰（M + Na）+為 m/z 876.2，證明菌株 D62 發(fā)酵純化產(chǎn)物確實(shí)含有紫杉醇。

2.6 內(nèi)生真菌形態(tài)特征及分類

菌株 D62 的形態(tài)特征如圖 4，菌株初期在PDA 培養(yǎng)基上生長較緩慢，培養(yǎng) 3 d 后菌落直徑超過 2 cm，7 d 后達(dá) 5 ～ 6 cm；菌絲呈棉絮狀至絨毛狀，最初白色，后期逐漸變灰黑，菌絲老化，培養(yǎng)基反面暗綠色；菌絲有隔，分枝，透明，直徑 1.5～ 3.5 μm。根據(jù)該菌株的形態(tài)學(xué)特征，經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[14]，與鐮刀孢屬的分類特征相吻合。因此，菌株 D62 暫定為 Fusarium sp.。

2.7 體外抗腫瘤細(xì)胞活性

從圖 5 可以看出，真菌產(chǎn)紫杉醇和標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇均能高效抑制 HeLa 細(xì)胞生長，同時完全對照組和添加相同濃度甲醇的對照組中 HeLa 細(xì)胞生長良好。從圖 6 中可以看出隨著紫杉醇濃度以及作用時間增長，細(xì)胞抑制率也隨之增長。當(dāng)內(nèi)生真菌D62 產(chǎn)紫杉醇濃度為 10 μg/ml時，與 HeLa 細(xì)胞作用24、48、72 h 后，其抑制率分別到達(dá) 17.8%、 64.6%、88.6%。而同濃度標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇的抑制率分別為 24.8%、78.5%、93.4%。

圖 4 D62 菌株的形態(tài)學(xué)特征 × 400（A：菌株 D62 在PDA 培養(yǎng)基上生長的菌落；B：菌絲體形態(tài)）Figure 4 Morphological observation of the fungus D62 × 400. A: Colonies of strain D62 on PDA medium; B: Mycelia.

圖 5 不同藥物處理后的 HeLa 細(xì)胞系的生長情況 × 400（A：不添加藥物；B：添加 5 μg/ml 的甲醇；C：添加 5 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇；D：添加 5 μg/ml 的真菌產(chǎn)紫杉醇）Figure 5 The microscope observation of the HeLa cells treated with drug. A: No addition; B: Add methanol, 5 μg/ml; C: Add authentic taxol, 5 μg/ml; D: Add fungal taxol, 5 μg/ml.

圖 6 菌株 D62 產(chǎn)紫杉醇（A）與紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品（B）致HeLa 細(xì)胞的凋亡率Figure 6 Apoptosis rate of HeLa cells incubated with fungal taxol (A) compared with authentic taxol (B)

3 討論

本文從南方紅豆杉樹中分離得到了 91 株純化的內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)菌株 D62 的發(fā)酵純化產(chǎn)物含有紫杉醇，其液體發(fā)酵產(chǎn)量為 148.95 μg/L。對菌株D62 的菌落和菌絲體的形態(tài)學(xué)分析表明其屬于鐮刀屬。另外本試驗(yàn)研究結(jié)果還表明，菌株 D62 發(fā)酵所得的紫杉醇對 HeLa 細(xì)胞生長具有明顯的抑制作用，且與標(biāo)準(zhǔn)紫杉醇的抗 HeLa 細(xì)胞作用基本一致。

利用內(nèi)生真菌發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇最大的問題是內(nèi)生真菌中紫杉醇的含量低，同時內(nèi)生真菌在多次傳代后，生物特性退化，其代謝產(chǎn)物不穩(wěn)定。一般來說，微生物發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇盈虧平衡點(diǎn)為 1 mg/L。而目前報道的內(nèi)生真菌生產(chǎn)紫杉醇的初始量每升培養(yǎng)基從 24 ng ～ 276.76 μg 不等，距工業(yè)化生產(chǎn)還有一定差距[8-11]。目前已報道的內(nèi)生真菌的發(fā)酵產(chǎn)量還比較低，通過分離篩選高產(chǎn)量的菌株，優(yōu)化發(fā)酵條件，對菌株進(jìn)行誘變育種等方式有望提高其產(chǎn)量，從而實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)[15]。因此，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)紫杉醇具有潛在的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)價值。 我們下一步工作將對篩選到的菌株D62 的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，并利用生物技術(shù)方法對菌株進(jìn)行誘變選育，以期提高其紫杉醇的發(fā)酵產(chǎn)量。

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ObjectiveTo isolated from producing endophytic fungi of Taxus chinensis var. mairei, and study its anti-tumor activity.

MethodsThe hyphal tips, which grew out from the tissue of Taxus chinensis var. mairei were isolated and transferred to potato dextrose agar (PDA). Then the purified endophytic fungal strains were fermented. The presence of taxol in the fungal extract was confirmed by thin-layer chromatography (TLC), ultraviolet spectrophotometry (UV), high performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS) by comparison with taxol standard. The anti-tumor activity of the fungal taxol was detected by Methyl Thiazolyl Tetrazolium (MTT) method with HeLa cells.

ResultsStrain D62, an isolated endophytic fungus from the phloem of the Taxus chinensis var. mairei, was observed to produce taxol, when grown in semi-synthetic liquid media. The amount of taxol produced by this endophytic fungus was 148.95 μg/L determined by HPLC. The fungus was identified as a Fusarium sp. according to the morphology of the fungal culture and the characteristics of the colony. The fungal taxol extracted also showed a strong cytotoxic activity in the in vitro culture of HeLa cells tested by an apoptotic assay.

ConclusionStrain D62, a taxol-producing endophytic fungus isolated from Taxus chinensis var. mairei, can serve as a potential material for fungal fermentation to improve taxol production.

【Key words】Antineoplasstic agents, phytogenic; Fungi; Fermentation; Taxol

Author Affiliation: Biomaterials and Drug Delivery Laboratories, School of Chemistry and Chemical Engineering, Southeast University, Nanjing 211189, China

Correspongding Author:LI Xin-song, Email: lixs@seu.edu.cn www.cmbp.net.cn

Chin Med Biotechnol, 2010, 5(3):202-207

作者單位：210018 南京，東南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院生物材料和藥物釋放實(shí)驗(yàn)室

通訊作者：李新松，Email：lixs@seu.edu.cn

收稿日期：2009-12-01

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.03.008

Production of taxol by an endophytic fungus isolated from Taxus chinensis var. mairei

LU Lu-yang, QIN Zhu, XU Jin-ku, LI Xin-song

【Abstract】