黃云艷，賈春平，劉美英，金慶輝，趙建龍，趙林川

兩種納米金標(biāo)記 p53 抗體探針的制備、表征和性質(zhì)研究

黃云艷，賈春平，劉美英，金慶輝，趙建龍，趙林川

【摘要】

目的制備 IgG-Au-HRP 和 IgG-Au-DNA-HRP 兩種納米金標(biāo)記 p53 抗體探針，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特征表征和性質(zhì)研究。

方法利用納米金粒子與蛋白質(zhì)非共價(jià)吸附和與巰基修飾的寡核苷酸以 Au-S 鍵共價(jià)結(jié)合的特點(diǎn)，將辣根過(guò)氧化物酶（HRP）直接或通過(guò)寡核苷酸鏈間接標(biāo)記在納米金表面，制備兩種多功能納米金生物探針（IgG-Au-HRP 和IgG-Au-DNA-HRP 探針）；應(yīng)用透射電鏡、紫外-可見(jiàn)光光譜等對(duì)納米金探針性能進(jìn)行表征，對(duì)納米金探針表面 HRP酶活性進(jìn)行分析，并通過(guò)酶免疫標(biāo)記技術(shù)（enzyme linked immuncsorbent assay，ELISA）優(yōu)化探針制備條件和比較兩種探針標(biāo)記效率。

結(jié)果①兩種新型探針具有良好的單分散性，大小均一，粒徑約 10 nm；②p53 蛋白檢測(cè)效果對(duì) IgG-Au-HRP 和IgG-Au-DNA-HRP 探針制備條件優(yōu)化結(jié)果表明：制備IgG-Au-HRP 探針時(shí)，HRP 分子和 p53 抗體的最佳比例為10∶1；制備 IgG-Au-DNA-HRP 探針時(shí)，DNA 和 p53 抗體的最佳比例為 2.5∶1；③HRP 分子定量檢測(cè)顯示：一個(gè)IgG-Au-HRP 探針可標(biāo)記 HRP 數(shù)量約 11 個(gè)，IgG-Au-DNA-HRP 探針可標(biāo)記 HRP 數(shù)量為 20 個(gè)；④兩種探針結(jié)合 ELISA 法初步檢測(cè) p53 蛋白判定 IgG-Au-DNA-HRP探針比 IgG-Au-HRP 探針檢測(cè)蛋白靈敏度高。

結(jié)論兩種新型納米金探針制備簡(jiǎn)單，可作為一種新型探針應(yīng)用于微量蛋白的高靈敏檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定； 腫瘤抑制蛋白質(zhì) p53；辣根過(guò)氧化物酶； 金屬納米粒子； 生物傳感技術(shù)

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, 5(3):171-176

p53 蛋白是由與人類腫瘤發(fā)生相關(guān)性最高的p53 抑癌基因突變產(chǎn)生[1]。p53 基因的突變引起p53 蛋白空間構(gòu)象的改變，以及其他因素導(dǎo)致 p53蛋白不易水解，半衰期較長(zhǎng)，使之失去了抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。p53蛋白過(guò)度表達(dá)預(yù)示腫瘤患者腫瘤的侵襲力強(qiáng)、易發(fā)生轉(zhuǎn)移、預(yù)后性差，因此，p53 蛋白是個(gè)非常有價(jià)值的腫瘤預(yù)后因子。

傳統(tǒng)的 p53 蛋白檢測(cè)方法有放射免疫分析（RIA）和酶聯(lián)免疫分析（ELISA）。RIA 方法具有放射污染性，不易在臨床推廣；ELISA 檢測(cè)法因操作程序復(fù)雜，所需時(shí)間較長(zhǎng)，尤其在早期腫瘤標(biāo)志物、神經(jīng)性肽等微量蛋白的檢測(cè)上，缺乏足夠的靈敏度，限制了其在臨床上的應(yīng)用[3]。因此，對(duì)于早期癌癥的腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)方法需要進(jìn)一步改進(jìn)，以提高檢測(cè)靈敏度。

納米金顆粒具有納米材料所特有的三大效應(yīng)：表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)，日益受到人們的關(guān)注[4]。自 1971 年 Faulk 和 Taylor[5]將兔抗沙門菌抗血清與納米金結(jié)合，用直接免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)表面抗原后，納米金做為一種免疫標(biāo)記技術(shù)得到了更為迅速和廣泛的發(fā)展。最近報(bào)道的基于納米金和微型磁珠的 BCA 擴(kuò)增技術(shù)（Bio-Bar code assay）是以巰基寡核苷酸和蛋白連接納米金形成納米金生物探針，建立的高靈敏度檢測(cè)蛋白的新方法[6-10]。另外，標(biāo)有辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的抗體 IgG 標(biāo)記到納米金顆粒表面，根據(jù)電化學(xué)方法檢測(cè)血清蛋白含量，其中 HRP 作為信號(hào)擴(kuò)增作用，可以促進(jìn)不同的發(fā)光體進(jìn)行發(fā)光并產(chǎn)生可見(jiàn)的信號(hào)[11]。

結(jié)合以上研究，在本研究組前期研究基礎(chǔ)上[12]進(jìn)一步改良，制備 IgG-Au-HRP 和 IgG-Au-DNAHRP 兩種納米金標(biāo)記 p53 抗體探針。以 p53 蛋白的檢測(cè)為例，對(duì)這兩種納米金生物探針的制備技術(shù)進(jìn)行了研究，并對(duì)所制備的納米金生物探針的性能進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 p53 IgG 購(gòu)自美國(guó) Abcam 公司；巰基化 DNA 鏈 5’（SH）TTTTTTTTTTAgCTACgAgT TgAATCCTgCgTTTTTTTTTT（BIOTIN）3’ 由日本TaKaRa 公司合成；氯金酸（HAuCl4·3H2O）、檸檬酸鈉（trisodium citrate）、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）均購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich公司；實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.1.2 儀器 JEM 2100 透射電子顯微鏡為日本電子公司的產(chǎn)品；V-60 紫外-可見(jiàn)光光譜儀為日本 Jasco 公司產(chǎn)品；Wallac 1420 多功能酶標(biāo)儀為美國(guó) PerkinElmer 公司產(chǎn)品；5804R 離心機(jī)為德國(guó) Eppendorf 公司產(chǎn)品；硝酸纖維薄膜過(guò)濾器（0.22 μm）為美國(guó) Corning Incorporated 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 納米金制備 根據(jù) Frens[13]與 Horisberger和 Rosset[14]介紹的檸檬酸鈉還原方法制備 10 nm直徑的納米金。制備的溶液通過(guò) 0.22 μm 的硝酸纖維薄膜過(guò)濾器過(guò)濾除去一些電解離子和一些聚集的膠體金顆粒。實(shí)驗(yàn)所需相關(guān)玻璃器皿均經(jīng)過(guò)多次雙蒸水沖洗，硅化處理（1% 雙氯硅烷/氯仿浸泡1 h，烘干）。

1.2.2 納米金探針制備

1.2.2.1 IgG-Au-HRP 型探針的制備 圖 1A 為IgG-Au-HRP 型探針的標(biāo)記過(guò)程示意圖?？贵w和HRP 分子通過(guò)非共價(jià)結(jié)合方式吸附到納米金顆粒表面。在蛋白檢測(cè)中，被標(biāo)記在納米金表面的抗體作為識(shí)別抗體與待測(cè)抗原蛋白識(shí)別結(jié)合，從而將待測(cè)蛋白分子與作為信號(hào)分子的 HRP 分子間接偶聯(lián)在一起，通過(guò) HRP 分子氧化反應(yīng)測(cè)得光吸收值，檢測(cè)抗原蛋白分子含量。制備過(guò)程：取濃度為0.59 × 10-7mol/L 的 10 nm 納米金溶液 1 ml，加入0.2 mol/L 的 K2CO3調(diào)至 pH 為 9.0 左右；加入HRP 與抗體體積比為 10∶1，濃度均為 1 mg/ml 的混合液 66 μl，室溫孵育 1 h；加入 10%（w/v）聚乙二醇（PEG）8 000 50 μl 穩(wěn)定和鈍化膠體金；最后納米金探針用納米金重懸液（0.05 mol/L Tris pH 7.8，含 1.25% 蔗糖，0.2% BSA，0.05% PEG，0.05% PVP，0.15% Tween20）在離心半徑為 9 cm，9 000 r/min、4 ℃條件下，離心 4 ～ 5 次，除去未結(jié)合的抗體和 HRP，加入 400 μl 納米金重懸液重懸納米金探針，4 ℃ 放置備用。

1.2.2.2 IgG-Au-DNA-HRP型探針的制備 圖1B 為 IgG-Au-DNA-HRP 型探針標(biāo)記過(guò)程示意圖。首先抗體通過(guò)吸附被標(biāo)記到納米金顆粒表面，接著巰基化 DNA 鏈通過(guò) Au-S 共價(jià)結(jié)合到納米金表面，最后 HRP 分子通過(guò)與巰基化 DNA 鏈結(jié)合反應(yīng)，間接連接到納米金顆粒表面。其中 DNA 作為“橋梁”把檢測(cè)信號(hào)（HRP）連接到納米金顆粒表面。制備過(guò)程：0.59 × 10-7mol/L 的 10 nm 納米金溶液 1 ml 調(diào)節(jié) pH 值為 9.0；加入 4 μl（1 mg/ml）抗體，室溫孵育 1 h；隨后加入 10 μl 巰基化 DNA鏈（0.1 mol/L），振蕩搖勻，于 4 ℃ 放置 15 h；加入終濃度為 0.5%（w/v）PEG 8 000 穩(wěn)定探針，室溫放置 48 h 以上；多余的抗體和 DNA 探針通過(guò) 9 000 r/min、4 ℃ 離心 50 min 去除；加入 2.5 μl HRP（1 mg/ml）室溫反應(yīng) 1 h；通過(guò)納米金重懸液9 000 r/min、4 ℃ 離心 4 ～ 5 次除去未結(jié)合 HRP，沉淀物溶于納米金重懸液中，定容至 400 μl，4 ℃放置備用。

圖 1 新型納米金探針標(biāo)記過(guò)程示意圖Figure 1 Schematic of preparation of the new Au NP probes

1.2.3 納米金探針生物學(xué)特征表征

1.2.3.1 樣品透射電鏡和紫外可見(jiàn)光光譜掃描微量取樣器分別取一定量納米金和納米金探針溶液樣本，加入銅網(wǎng)中，在空氣中干燥，于透射電鏡下觀察；利用紫外可見(jiàn)光光譜進(jìn)行納米金和納米金探針光度掃描，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)（λmax）及吸光值（A 值）。

1.2.3.2 納米金上 HRP 分子的定量檢測(cè) 納米金探針表面的 HRP 為信號(hào)分子，HRP 分子的多少?zèng)Q定了檢測(cè)信號(hào)的強(qiáng)弱及檢測(cè)的靈敏度。10 μl 稀釋不同濃度的納米金探針和 10 μl 已知濃度的標(biāo)準(zhǔn) HRP 溶液稀釋成不同濃度 HRP 溶液（400、200、100、50、25、12.5、6.25 和 0 ng/ml）分別加入 50 μl TMB 溶液，在避光的條件下 37 ℃ 孵育 10 ～ 15 min，隨后加入 2 mol/L H2SO4終止其顯色反應(yīng)，于 450 nm 處檢測(cè) A450值。根據(jù)已知濃度的 HRP 分子繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線和所測(cè)得納米金探針濃度，進(jìn)行計(jì)算、確定標(biāo)記在納米金探針表面HRP 分子數(shù)量。

1.2.3.3 免疫反應(yīng) 酶聯(lián)免疫反應(yīng)（ELISA 法）檢測(cè) 100 ng p53 蛋白進(jìn)行納米金探針標(biāo)記各條件的優(yōu)化。包括有待測(cè)抗原的單克隆抗體的酶標(biāo)板與100 ng p53 蛋白反應(yīng)；分別加入同濃度的 IgG-Au-HRP 和 IgG-Au-DNA-HRP 探針于 37 ℃ 孵育30 min；加入 TMB 溶液 37 ℃ 顯色反應(yīng) 10 min； 2 mol/L H2SO4終止其顯色反應(yīng)，于多功能酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè) A450值。

2 結(jié)果

2.1 納米金生物探針的特征

圖 2 顯示的是透射電鏡掃描觀察納米金顆粒及納米金探針的外貌和單分散性的結(jié)果。制備的納米金溶膠單分散性良好，且顆粒大小較均一，平均直徑約 10 nm（圖 2A），標(biāo)有蛋白和 DNA 的納米金顆粒沒(méi)有發(fā)生聚集，且標(biāo)記后的納米金顆粒周圍有一圈清晰可見(jiàn)的“暈”環(huán)，與未標(biāo)記的納米金顆粒周圍清晰界面成鮮明對(duì)比（圖 2B，2C），是生物分子已標(biāo)記到納米金顆粒表面的佐證。用紫外可見(jiàn)光光譜掃描儀對(duì)納米金及納米金探針溶液進(jìn)行光譜掃描（圖 3），未經(jīng)修飾的納米金溶液最大吸收峰在 520 nm（圖 3a），而標(biāo)記抗體和 HRP 的納米金探針在 524 nm 有最大吸收峰（圖 3b），同時(shí)標(biāo)記抗體和 DNA、HRP 的納米金探針最大吸收峰為526 nm（圖 3c）。

2.2 探針制備條件的優(yōu)化

制備不同納米金探針進(jìn)行 100 ng p53 蛋白檢測(cè)。由圖 4A 可知，隨著 HRP 分子和抗體比例的增大其檢測(cè)蛋白的 450 nm 吸收值先增大到一定程度后又減小，可能是由于隨著抗體量的增多，相應(yīng)的 HRP 減少導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)降低，故選擇 HRP 和p53 抗體的體積比 10∶1 為最佳標(biāo)記比例。圖 4B顯示的是 IgG-Au-DNA-HRP 探針標(biāo)記時(shí)抗體和巰基化 DNA 鏈加入量的優(yōu)化。同理，巰基化 DNA與 p53 抗體體積比 2.5∶1 是標(biāo)記的最佳比例。

2.3 探針表面 HRP 分子的數(shù)量

圖 2 納米金和納米金探針 TEM 掃描圖（A：未修飾的納米金顆粒；B：IgG-Au-HRP 型探針；C：IgG-Au-DNA-HRP 型探針）Figure 2 The TEM analysis of the AuNPs and AuNP probes. A: Unmodified gold nanoparticles; B: IgG-Au-HRP probes; C: IgG-Au-DNA-HRP probes

根據(jù)已知濃度 HRP 溶液稀釋成不同濃度HRP 溶液（400、200、100、50、25、12.5、6.25 和0 ng/ml）繪制的以 HRP 濃度為橫坐標(biāo)，A450值為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線和標(biāo)記在納米金探針上的 HRP 的檢測(cè)活性濃度對(duì)比（圖 5），得知標(biāo)記在IgG-Au-HRP 探針上的 HRP 的濃度為 5.892 × 10-2g/L，并且，由納米金探針 524 nm 處吸收值得出納米金探針濃度為 0.534 × 10-7mol/L，故 HRP和納米金探針的濃度比率為 11.03，這意味著每一個(gè) 10 nm 的納米金探針上可以標(biāo)記（11 ± 1）個(gè)HRP 分子，同理在 IgG-Au-DNA-HRP 探針中，每一個(gè)納米金探針可標(biāo)記（20 ± 1）個(gè) HRP 分子。

圖 3 納米金標(biāo)記前后紫外-可見(jiàn)光譜掃描圖Figure 3 UV-vis spectra for AuNP and AuNP probes

圖 4 納米金探針標(biāo)記抗體選擇（A：HRP/抗體；B：DNA/抗體）Figure 4 The selection of gold nanoparticle labeled antibody probes. A: HRP to antibody; B: DNA to antibody.

2.4 兩種類型探針蛋白檢測(cè)效率比較

同濃度兩種類型納米金探針檢測(cè) 100 ng p53蛋白，在幾乎相近空白背景信號(hào)情況下，IgG-Au-DNA-HRP 型探針比 IgG-Au-HRP 型探針擁有更高的陽(yáng)性值（圖 6）。由 HRP 定量檢測(cè)計(jì)算，得知每一個(gè) IgG-Au-DNA-HRP 探針標(biāo)有的 HRP 個(gè)數(shù)比 IgG-Au-HRP 型探針多約 2 倍，由此可知，IgG-Au-DNA-HRP 型探針 p53 蛋白檢測(cè)靈敏度要優(yōu)于 IgG-Au-HRP 型探針。

圖 5 HRP 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Figure 5 Standard curve of HRP

圖 6 兩種探針檢測(cè)蛋白靈敏度比較Figure 6 Comparison of the sensitivity in protein detection of two AuNP probes

3 討論

納米金以其獨(dú)特的理化性質(zhì)和易于標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于分子標(biāo)記領(lǐng)域。以抗體和巰基化DNA 鏈、酶蛋白—— HRP 分子進(jìn)行標(biāo)記的新型納米金探針是一種可利用普通的酶標(biāo)儀進(jìn)行微量蛋白檢測(cè)的新型探針標(biāo)記方法，為簡(jiǎn)易微量蛋白檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)表明標(biāo)記抗體后的納米金探針表面有一層可見(jiàn)的“暈”環(huán)。納米金在 500 ～ 550 nm之間有強(qiáng)的吸收峰，這是納米金的表面等離子共振（surface plasma resonance，SPR）吸收峰[15]，對(duì)比納米金標(biāo)記 p53 抗體前后的紫外一可見(jiàn)吸收光譜，吸收曲線在 520 nm 處的吸光值降低，由此可推測(cè) p53 抗體與納米金發(fā)生了相互作用。同時(shí)，可以看到吸收曲線的最大峰值發(fā)生了 4 ～ 6 nm 左右的紅移，根據(jù)報(bào)道[16]，當(dāng)納米金與周圍吸附介質(zhì)或基質(zhì)材料相互作用會(huì)引起吸收峰發(fā)生紅移。由此可以初步判定 p53 抗體與納米金發(fā)生了相互結(jié)合并且最大吸收峰發(fā)生右移，可見(jiàn)納米金探針標(biāo)記成功。

沒(méi)有修飾蛋白的納米金在高濃度鹽溶液條件下?tīng)顟B(tài)不穩(wěn)定，當(dāng)加入高濃度鹽溶液時(shí)，納米金溶液會(huì)發(fā)生聚集，顏色會(huì)由紅變藍(lán)色，主要是溶液中殘留的負(fù)離子在納米金周圍形成負(fù)電荷層，在納米顆粒之間形成聚合力的緣故[17]。蛋白可以改變納米顆粒表面的電荷，使修飾后的納米金處于更加穩(wěn)定狀態(tài)，在高濃度鹽溶液中仍保持鮮紅狀態(tài)，不發(fā)生聚集。納米金和寡核苷酸的反應(yīng)須在高濃度的氯化鈉溶液中完成，在 IgG-Au-DNA-HRP 探針標(biāo)記中，納米金首先修飾抗體后，微粒間的穩(wěn)定性大大提高，利于 DNA 在其表面和納米金顆粒結(jié)合。

該納米金探針表面標(biāo)記抗體在檢測(cè)蛋白時(shí)作為“橋梁”，把待檢測(cè)抗原和檢測(cè)信號(hào)（HRP）連接起來(lái)，酶分子 HRP 作為檢測(cè)信號(hào)并起到信號(hào)放大作用，同時(shí)，HRP 分子通過(guò)與巰基化 DNA 鏈進(jìn)行鏈霉素-生物素反應(yīng)標(biāo)記到納米金表面，因此檢測(cè)抗體和巰基化 DNA 鏈在納米金表面的標(biāo)記比例對(duì)檢測(cè)結(jié)果有重要影響。實(shí)驗(yàn)證明 DNA 和 p53抗體的體積比 2.5∶1 為最佳納米金探針制備比例。隨著巰基化 DNA 鏈的增多，相應(yīng)的 HRP 分子標(biāo)記量增大，免疫檢測(cè)光吸收值增加，達(dá)到一個(gè)峰值后，光吸收值相應(yīng)減少，可能由于過(guò)多的巰基化DNA 鏈占據(jù)過(guò)多納米金表面位置，結(jié)果檢測(cè)抗體的標(biāo)記量相對(duì)減少，無(wú)法捕捉足量的待測(cè)抗原，最終形成的三明治結(jié)構(gòu)中，HRP 分子的總數(shù)量相對(duì)減少，導(dǎo)致檢測(cè)信號(hào)降低。同理，實(shí)驗(yàn)證明 HRP 與抗體比例為 10∶1 時(shí)為最佳制備比例。

納米金把待檢測(cè)蛋白相對(duì)應(yīng)的抗體與信號(hào)分子 HRP 偶聯(lián)在一起，既起到信號(hào)放大作用，提高免疫反應(yīng)的檢測(cè)靈敏度，還可以簡(jiǎn)化操作步驟，更易于在臨床上推廣。典型的間接夾心 ELISA 檢測(cè)步驟復(fù)雜，且一個(gè)酶標(biāo)抗體只能結(jié)合 1 ～ 2 個(gè)HRP 分子。然而，本實(shí)驗(yàn)制備的納米金探針，一個(gè)抗體可以與很多 HRP 分子相偶聯(lián)，從而實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)信號(hào)的放大，提高了檢測(cè)靈敏度[17]。該納米金探針用于蛋白檢測(cè)有以下優(yōu)點(diǎn)：納米金探針仍保留納米金顆粒的獨(dú)特物理特性；具有抗體特異性特點(diǎn)；以 HRP 為檢測(cè)信號(hào)，利用簡(jiǎn)單的顯色反應(yīng)檢測(cè)蛋白，為微量蛋白的臨床檢測(cè)打下了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1] Hainaut P, Soussi T, Shomer B, et al. Database of p53 gene somatic mutations in human tumors and cell lines: updated compilation and future prospects. Nucleic Acids Res, 1997, 25(1):151-157.

[2] Warren W, Biggs PJ, el-Baz M, et al. Mutations in the p53 gene in schistosomal bladder cancer: a study of 92 tumours from Egyptian patients and a comparison between mutational spectra from schistosomal and non-schistosomal urothelial tumours. Carcinogenesis, 1995, 16(5):1181-1189.

[3] Lu G, Liu CX, Ji R. Establishment and preliminary application of McAb-Cieia for determination of zearalenone. Acta Mycoloyica Sinica, 1996, 15(4):292-296. (in Chinese)路戈, 劉春霞, 計(jì)融. 玉米赤霉烯酮單克隆抗體酶聯(lián)免疫測(cè)定方法的建立及初步應(yīng)用. 真菌學(xué)報(bào), 1996, 15(4):292-296.

[4] Deng YP, Zhao HQ, Jiang L. Application of nanogold particles in biomimetic engineering. China Basic Sci, 2000(9):11-17. (in Chinese)鄧永沛, 趙紅秋, 江龍. 納米金顆粒在仿生工程中的應(yīng)用. 中國(guó)基礎(chǔ)科學(xué), 2000(9):11-17.

[5] Faulk WP, Taylor GM. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry, 1971, 8(11):1081-1083.

[6] Nam JM, Thaxton CS, Mirkin CA. Nanoparticle-based bio-bar codes for the ultrasensitive detection of proteins. Science, 2003, 301(5641): 1884-1886.

[7] Thaxton CS, Hill HD, Georganopoulou DG, et al. A bio-bar-code assay based upon dithiothreitol-induced oligonucleotide release. Anal Chem, 2005, 77(24):8174-8178.

[8] Stoeva SI, Lee JS, Smith JE, et al. Multiplexed detection of protein cancer markers with biobarcoded nanoparticle probes. J Am Chem Soc, 2006, 128(26):8378-8379.

[9] Nam JM, Jang KJ, Groves JT. Detection of proteins using a colorimetric bio-barcode assay. Nat Protoc, 2007, 2(6):1438-1444.

[10] Bao YP, Wei TF, Lefebvre PA, et al. Detection of protein analytes via nanoparticle-based bio bar code technology. Anal Chem, 2006, 78(6): 2055-2059.

[11] Ambrosi A, Casta?eda MT, Killard AJ, et al. Double-codified gold nanolabels for enhanced immunoanalysis. Anal Chem, 2007, 79(14): 5232-5240.

[12] Zhong XQ, Liu MY, Huang YY, et al. Novel detection method of protein with gold nanoparticle probes. Chin Med Biotechnol, 2009, 4(3):200-206. (in Chinese)鐘曉琴, 劉美英, 黃云艷, 等. 一種基于酶標(biāo)納米金探針的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法. 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2009, 4(3):200-206.

[13] Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions. Nat Phys Sci, 1973, 241:20-22.

[14] Horisberger M, Rosset J. Colloidal gold, a useful marker for transmission and scanning electron microscopy. J Histochem Cytochem, 1977, 25(4):295-305.

[15] Husein MM, Nassar NN. Nanoparticle preparation using the single microemulsions scheme. Curr Nanoscience, 2008, 4(4):370-380.

[16] Li XY, Yang ZL, Zhou HG. Studying the absorption spectrum properties of the gold nanosphere--The effect of the size on the absorption spectra of the nanoparticles. J Zhangzhou Teachers Coll (Nat Sci), 2004, 17(2):31-34. (in Chinese)李秀燕, 楊志林, 周海光. 金納米球吸收光譜特性研究-尺寸對(duì)納米粒子吸收光譜的影響. 漳州師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2004, 17(2):31-34.

[17] Li JP, Gao HL, Xiong ZG. Amperometric Immunosensor based on covalent immobilization of monoclonal carcinoembryonic antibody (CEA) on Fe3O4/Au nanocomposites. Chem J Chin Univ, 2008, 29(11):2149-2154. (in Chinese)李建平, 高會(huì)玲, 熊志剛. 磁性納米金共價(jià)固定癌胚抗原單克隆抗體的電流型免疫傳感器. 高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào), 2008, 29(11):2149-2154.

ObjectiveTwo novel p53 antibody gold nanoparticle probes (IgG-Au-HRP probes and IgG-Au-DNA-HRP probes) were synthetized, the biological characteristics of which were studied.

MethodsTwo kinds of novel multifunctional gold nanoparticle probes (IgG-Au-HRP probes and IgG-Au-DNA-HRP probes) were synthesized, the gold nanoparticles were functioned with both antibodies and Horseradish-peroxidase (HRP), which can be immobilized onto gold nanoparticles directly (IgG-Au-HRP probes) or through the thiol-terminated oligonucleotides strand (IgG-Au-DNA-HRP probes). The morphology and spectroscic properties of these probes were evaluated by transmission electron microscopy (TEM), UV-vis spectra analyses and ELISA.

Results①New gold nanoparticles probes were monodisperse, good morphology and dispersed evenly, the average diameter was 10 nm; ②Experimental parameters involved in preparation of IgG-Au-HRP and IgG-Au-DNA-HRP probes were optimized. The ideal ratio of HRP: detecting antibody p53 was 10:1 (IgG-Au-HRP), and the ratio of DNA: detecting antibody p53 was 2.5:1 (IgG-Au-DNA-HRP); ③Based on quantification of HRP immobilized on Au NP probe, the number of HRP molecules was 11 in IgG-Au-HRP probe and was 20 in IgG-Au-DNA-HRP probe; ④From initial detection through ELISA, the sensitivity in protein detection of IgG-Au-DNA-HRP probes was higher than IgG-Au-HRP probes.

ConclusionThe preparation of the new nanoparticle gold probes was simple, which can be used as a new type of probe used in high sensitivity detection of protein.

【Key words】Enzyme-Linked immunosorbent assay; Tumor suppressor protein p53; Horseradish peroxidase; Metal nanoparticles; Biosensing techniques

Author Affiliations: College of Preclinical Medicine and Biological Science, Suzhou University, Suzhou 215123, China (HUANG Yun-yan, ZHAO Lin-chuan); Shanghai Institute of Microsystem and Information Technology, Chinese Academy of Science, Shanghai 200050, China (JIA Chun-ping, LIU Mei-ying, JIN Qing-hui, ZHAO Jian-long)

Chin Med Biotechnol, 2010, 5(3):171-176

Corresponding Authors: JIA Chun-ping, Email: jiachp@mail.sim.ac.cn; ZHAO Lin-chuan, Email: sdzlc2008@126.com www.cmbp.net.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)發(fā)展研究計(jì)劃（863 計(jì)劃）（2006AA3Z334）；上海市科委納米專項(xiàng)資助項(xiàng)目（0752nm019）

作者單位：215123 蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院（黃云艷、趙林川）；200050 上海，中國(guó)科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所納米技術(shù)研究室（劉美英、賈春平、金慶輝、趙建龍）

通訊作者：賈春平，Email：jiachp@mail.sim.ac.cn；趙林川，Email：sdzlc2008@126.com

收稿日期：2009-12-01

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.03.002

Preparation and characterization of two kinds of gold nanoparticle labled p53 antibody probes

HUANG Yun-yan, JIA Chun-ping, LIU Mei-ying, JIN Qing-hui, ZHAO Jian-long, ZHAO Lin-chuan

【Abstract】