王洪志，龐小峰，王愛華

1 電子科技大學 生命科學與技術學院 生物電磁學與生物電子技術四川省重點實驗室，成都市，610054 2 西南民族大學 生命科學與技術學院 生理實驗室， 成都市，610041

電阻抗法細菌藥物敏感快速檢測裝置的研制

【作 者】王洪志1.2，龐小峰1△，王愛華2

1 電子科技大學 生命科學與技術學院 生物電磁學與生物電子技術四川省重點實驗室，成都市，610054 2 西南民族大學 生命科學與技術學院 生理實驗室， 成都市，610041

報告利用細菌在生長繁殖過程中的代謝產物可使培養(yǎng)基電阻率降低的特性， 研制一種電阻抗法細菌藥物敏感快速檢測裝置，該裝置主要由微生物電阻抗傳感器、計算機系統、信號發(fā)生器、電阻抗檢測電路、時間程序分配控制器、恒溫培養(yǎng)箱和輔助電路等組成。它可測量培養(yǎng)基電阻抗，并將細菌在培養(yǎng)期間內取得的阻抗值描記成阻抗曲線圖，利用這種阻抗曲線的形態(tài)差別判斷細菌的藥物敏感性。該檢測裝置縮短了細菌藥物敏感檢測的時間，對實現醫(yī)學臨床快速藥物敏感試驗、藥敏檢測自動化和智能化有一定的實際意義。

阻抗法；細菌藥物敏感；阻抗曲線；檢測裝置

近年來，人們感到用藥劑量越來越大，新藥的品種越來越多，但藥物療效反而不如以前。研究報告的資料證實，各種臨床常見致病菌已對現有的多種抗菌藥物產生了廣泛的耐藥性，選擇有效的抗生素和藥物治療疾病，是臨床醫(yī)學迫切需要解決的問題[1]。隨著臨床微生物學的發(fā)展，對致病菌藥物敏感性快速檢測方法的自動化、智能化正日益引起國內外微生物工作者和生物醫(yī)學工程工學者的重視?，F已有十幾種致病菌藥物敏感性快速檢測裝置問世, 如氣相色譜法、生物發(fā)光法、化學發(fā)光法、熒光免疫法、放射性同位素法、微熱量法、濁度法和電阻抗法等等。這些測量方法原理各不相同，但其共同特點是自動化程度高, 檢測時間短，可在1～10 小時內甚至幾分鐘內完成并出報告[2]。本文介紹一種電阻抗法細菌藥物敏感快速檢測裝置。

1 檢測裝置

1.1檢測裝置組成

電阻抗法細菌藥物敏感快速檢測裝置由微生物電阻抗傳感器、恒溫培養(yǎng)箱、信號發(fā)生器、電阻抗檢測電路、時間程序分配控制器、計算機系統和實驗廢棄物處理單元等組成，如圖1所示。

圖1 檢測裝置原理框圖Fig.1 Detector Block Diagram

1.2微生物電阻抗傳感器

1.2.1 微生物電阻抗傳感器結構

圖2 微生物電阻抗傳感器Fig.2 Microbial electrical impedance

將普通細菌培養(yǎng)皿改造，保留細菌培養(yǎng)功能，加裝電極，制成微生物電阻抗傳感器，如圖2所示。該傳感器由測量電極片、特制培養(yǎng)皿、膠蓋、專用培養(yǎng)基和接線柱等組成。測量電極片鑲嵌在兩根絕緣棒中，長度30 mm，直徑2.5 mm。絕緣棒固定在膠蓋上，其上端有接線柱。測量電極和膠蓋部分能耐高溫消毒。特制培養(yǎng)皿容積約25 ml，是一次性使用，使用過后銷毀。傳感器的功能要求是能進行需氧和厭氧細菌培養(yǎng)檢測。

使用時，先將液體培養(yǎng)基注入特制培養(yǎng)皿內，再挑取需要的細菌接種到液體培養(yǎng)基中，隨即將測量電極放入其中，蓋緊膠蓋。如是厭氧菌培養(yǎng)還需封閉膠蓋上的通氣孔，后傳感器插入培養(yǎng)箱插槽架中。最后將電線與膠蓋上部的接線柱相連接。

1.2.2 微生物電阻抗傳感器使用方法

① 細菌接種 按細菌接種的要求和操作規(guī)程[3]，首先將專用液體培養(yǎng)基（SM1H ）注入各傳感器的特制培養(yǎng)皿內，挑取需要檢測的菌種到專用液體培養(yǎng)基中。本實驗分別挑取了純培養(yǎng)的大腸桿菌、沙門氏菌和金黃葡萄球菌各約直徑2 mm的一個菌落，將它們分別接種到專用液體培養(yǎng)基中。

② 細菌培養(yǎng) 將測量電極放入特制培養(yǎng)皿中，蓋緊膠蓋。如是厭氧細菌培養(yǎng)，還需封閉膠蓋上的通氣孔，再將微生物電阻抗傳感器放入專用恒溫培養(yǎng)箱中。然后，將箱內各連線接口按順序分別與微生物電阻抗傳感器上部的接口相連接，在37℃環(huán)境下連續(xù)培養(yǎng)。

③ 采集數據 細菌在微生物電阻抗傳感器內培養(yǎng)期間，時間程序分配控制器每間隔5或10 min分別對每一個微生物電阻抗傳感器順序檢測采集數據一次，直至培養(yǎng)結束。

④ 傳感器用后處理 微生物電阻抗傳感器在每次使用后，特制培養(yǎng)皿連同培養(yǎng)物在實驗廢棄物箱（干熱箱）中滅菌消毀。測量電極要進行徹底的消毒殺菌后再用。

1.2.3 專用液體培養(yǎng)基的制備

篩選和配制專門適用于電阻抗測量要求的液體培養(yǎng)基?，F已通過試驗，篩選出了SM1H型和SM2H型兩種液體培養(yǎng)基。

① SM1H型液體培養(yǎng)基基礎配方

牛肉膏0.5g，蛋白胨1.0 g，氯化鈉0.5 g，蒸餾水100 mL，pH7.2～7.5。

② SM2H型液體培養(yǎng)基基礎配方

蛋白胨10g，乳糖10g，伊紅γ0.4g，美藍0.065g，磷酸氫二鉀 (K2HPO4) 2g。

1.3其它裝置

1.3.1 恒溫培養(yǎng)箱,將普通恒溫培養(yǎng)箱內部進行改造而成，內設5層傳感器插槽架，可供安放傳感器之用，每層可插30支，5層共可安放150個傳感器。在培養(yǎng)箱頂部通氣孔處，傳感器測量電極片連線由此處匯集引出，如圖3所示。

圖3 培養(yǎng)箱內傳感器和插槽架Fig.3 Incubator shelf sensors and slot

1.3.2 信號發(fā)生器，使用交流1 KHz恒流，作為測量電極的信號源。

1.3.3 時間程序分配控制器，可以分配交流信號源在規(guī)定時間按順序將所有傳感器檢測，如5 min或10 min等。

1.3.4 信號放大器，作交流檢測信號放大之用。

1.3.5 實驗廢棄物處理箱，實際是一個干熱滅菌箱。微生物電阻抗傳感器在每次使用后，特制培養(yǎng)皿連同培養(yǎng)物在實驗廢棄物處理箱中滅菌銷毀。測量電極要進行徹底的消毒殺菌后再用。

1.4檢測裝置電氣原理

電阻抗法細菌藥物敏感性檢測裝置電氣工作原理如圖4所示。用時間程序分配控制器控制多路輸入控制器的工作過程，如檢測時間，信號寬度、時間間隔和測量次數等條件。檢測時，信號發(fā)生器提供穩(wěn)定的電流、電壓和1 KHz信號，對微生物電阻抗傳感器進行間歇測量。150個傳感器安裝在5層傳感器插槽架上，同時順序接受檢測信號，所取得的培養(yǎng)基阻抗信號匯集在信號放大器進行放大，放大的信號進行A/D轉換后輸入計算機處理。通過專用軟件處理，結果以圖形顯示及打印，給出檢測報告。

圖4 檢測裝置電氣原理框圖Fig.4 Block diagram of electrical test equipment

2 檢測原理

2.1電阻抗法檢測細菌原理

用電阻抗法檢測細菌的原理是因細菌在生長繁殖過程中會將培養(yǎng)基中的糖、脂和蛋白質等營養(yǎng)物質，通過細菌的代謝活動，轉變成各種胺類、丙酮酸、無機鹽類、尿酸和各種有機酸成分等尾產物，使培養(yǎng)基中原來的化學成分發(fā)生了改變，尤其是各種鹽離子的含量增加3～12倍[4]。生物電子學認為糖、脂和蛋白質等有機成分導電性較差，而胺類、丙酮酸、各種無機鹽類和尿酸等導電性較好，這會使得培養(yǎng)基的導電性能大大的提高[5]。這意味隨著細菌的生長繁殖，其培養(yǎng)基的電阻抗值會發(fā)生變化，電阻抗值逐漸降低。

2.2電阻抗法細菌藥物敏感性檢測原理

用阻抗曲線圖判斷細菌藥物敏感性的原理，是將培養(yǎng)基分成接種細菌實驗組、接種細菌對照組和不接種細菌對照組；接種細菌對照組因在培養(yǎng)基中未滴加任何抗菌素，細菌正常生長繁殖不受影響，其培養(yǎng)基電阻抗值降得最低，反映以時間為橫坐標，以電導率值（S值）坐縱標的圖上阻抗曲線上升最高；不接種細菌對照組因是培養(yǎng)基中未接種任何細菌，培養(yǎng)基內無細菌生長繁殖，培養(yǎng)基成分不發(fā)生改變，電阻抗值在這段時間內基本沒有變化，所以其阻抗曲線基本沒有上升，近似一條平行于X軸的直線；接種細菌實驗組是滴加各種抗菌藥物于培養(yǎng)基內，抗菌藥物對細菌有殺抑作用會使電阻抗曲線形態(tài)不同于不接種細菌對照組和接種細菌對照組，它是介于它們之間的一種曲線。如果某種抗菌藥物對細菌有很好的殺抑效果，說明細菌在其培養(yǎng)基中能幾乎不能生長繁殖，其阻抗曲線應與不接種細菌對照組阻抗曲線形態(tài)相似并靠近，越靠近說明殺抑效果越好；如果抗菌藥物無效，說明細菌在培養(yǎng)基中生長繁殖不受抑制，其形成的阻抗曲線與接種細菌對照組阻抗曲線形態(tài)相似并靠近，越靠近說明殺抑效果越差；如抗菌藥物殺抑作用一般，說明細菌在其培養(yǎng)基中能部分或局部生長繁殖，其阻抗曲線是介于對照組和接種對照組之間的一種曲線。依此用這些阻抗曲線圖的差別進行細菌藥物敏感性判斷[5.6]。

3 實驗結果

3.1細菌特征阻抗曲線圖

圖5所示，是用該檢測裝置通過測量培養(yǎng)基電阻抗值的變化,描記出以時間為橫坐標，以電導率值（S值）坐縱標的大腸桿菌、沙門氏菌，金黃葡萄球菌三種細菌特征阻抗曲線圖[5]。

從圖5中可以看出，接種大腸桿菌、沙門氏菌，金黃葡萄球菌3個培養(yǎng)基在培養(yǎng)期間所形成的曲線各不相同，其電導值（S值）都明顯升高，這種升高與細菌在培養(yǎng)基內的生長繁殖有直接關系，但不同種類細菌的阻抗值所形成曲線形態(tài)是不相同的。這是因為不同種屬細菌在相同的培養(yǎng)條件下，在單位時間內細菌的適應性和生長繁殖速度以及尾產物是不相同的，所以形成了各自不相同的阻抗曲線。對照組在培養(yǎng)6 h后，曲線基本是一條平行于X軸的直線，說明其培養(yǎng)基的阻抗值在這段間內基本沒有變化，培養(yǎng)基內基本無細菌生長繁殖。在0～2 h內該曲線有上升，是由培養(yǎng)基的溫度從室溫升高至37℃時引起的。

圖5 細菌特征阻抗曲線圖Fig.5 The characteristic impedance curve of bacteria

3.2細菌藥物敏感性檢測圖

在細菌特征阻抗曲線圖的基礎上，以金黃葡萄球菌藥物敏感試驗為例，用百蟲殺、頭孢菌素、氨卞青霉素、青霉素和慶大霉素5種抗菌藥物進行藥物敏感試驗。圖6是金黃葡萄球菌藥物敏感殺抑阻抗曲線圖。

圖6 金黃葡萄球菌藥物敏感殺抑阻抗曲線圖Fig.6 Killed staphylococcus aureus sensitive to inhibition of drug resistance curve

比較5種抗菌藥物殺抑細菌阻抗曲線可以看出，在4 h加藥時間點后5種抗菌藥物的阻抗曲線在縱坐標上的阻抗值都比未滴加抗菌藥物的正常金黃葡萄球菌阻抗曲線低，但比對照組高；5種抗菌藥物形成的5條曲線形態(tài)上也有明顯差異。這說明5種抗菌藥物均有不同程度的抑制或殺滅細菌的作用，其中百蟲殺消毒劑對金黃葡萄球菌有最強的殺滅效果，曲線基本是一條直線，最靠近對照組；而另外4種藥物殺抑效果則各不相同，慶大霉素和普通青霉素對金黃葡萄球菌的殺抑效果最差。5種抗菌藥物對金黃葡萄球菌的殺抑效果排序如下。

百蟲殺＞頭孢菌素＞氨卞青霉素＞青霉素＞慶大霉素

4 討論

我們研制的藥物敏感試驗檢測裝置樣機, 可同時作10～50個細菌樣品的藥物敏感檢測試驗。幾種藥物同時作藥物敏感檢測，已作近百次, 重復性較好。同時，也可用于作細菌有無的檢測和阻抗特征曲線區(qū)別少數菌種等工作。各種細菌藥物敏感試驗都可在4～8 h內得出試驗結果。

傳統的藥物敏感性試驗需時間約24～36 h[7]，而電阻抗法進行細菌藥物敏感試驗時間可縮短至4～8 h，顯示出這種方法的優(yōu)越性；一次能檢測150個傳感器，同時可作多個人次多種抗菌藥物的藥物敏感性試驗，大大的提高了檢測效率，為醫(yī)生正確用藥和快速救治病人提供了檢測手段。

電阻抗法用于臨床細菌藥物敏感試驗是新生事物，各國都剛剛開始, 有許多試驗研究要做，還很不成熟。但用物理學方法或電子學方法替代傳統的化學方法和生物方法是生物醫(yī)學工程學的發(fā)展方向[8]。阻抗法因其裝置構成簡單, 操作方便, 便于用微機控制, 特別是因它具有可同時檢測多個樣品, 測定速度快和檢測值不受死菌影響等優(yōu)點, 所以它是大有發(fā)展前途的細菌快速自動檢測方法。該種檢測裝置對實現醫(yī)學臨床快速藥物敏感試驗，藥敏檢測自動化和智能化有一定的實際意義。

[1] 周貴民, 張軍民. 我國細菌藥物敏感監(jiān)測應注意的幾個問題[J]. 中華檢驗醫(yī)學雜志, 2004, 01(01): 44-46.

[2] 程知義, 周佳敏. 微生物快速診檢新技術[M]. 上海: 上海科學技術文獻出版社, 1984.

[3] 范秀容, 李廣武, 沈萍. 微生物學實驗[M]. 北京: 高等教育出版社,第二版. 1989.

[4] 丘冠英. 生物物理學[M]. 武漢: 武漢大學出版社, 2000.

[5] 王洪志, 王愛華. 用阻抗測量法進行微生物研究的試驗[J]. 西南民族學院(自然科學版), 1997, 24(4): 416-417.

[6] 王洪志，王愛華. 用阻抗法進行細菌耐藥性試驗[J]. 東南大學學報（自然科學版）, 2004, 34（2）:206-209.

[7] 邢玉斌, 索維江, 賈寧, 等. 細菌的消毒劑藥物敏感[J]. 微生物通報, 2006, 44(03): 184-188.

[8] 王凱, 殷涌光. SPR生物傳感器快速檢測沙門氏菌研究初探[J]. 食品科技, 2007, 32（9）:192-195.

植入式人工腎

腎功能衰竭病人主要是通過血液透析與腎移植來延長生命的，前者患者每周需要透析3次，每次3小時至5小時，耗費大量的時間與經費；后者腎的供體來源不足。美國加州大學舊金山分校日前宣布可望用植入式人工腎來取代。植入式人工腎臟中包含有數千個微型過濾器和生物反應器，能過濾血液中的毒素，模擬真實腎臟的代謝功能和水平衡功能。

為實現在植入人體的目的，研究人員計劃通特殊設計活體腎臟細胞生長的間隔，縮小設備體積，使用組織工程學的方法來培養(yǎng)腎小管細胞，以提供象健康腎臟一樣所必備的其他功能。整個過程在人體的血液壓力下即可運行，無需泵和任何電力供應。如果該技術得以實現，患者將過上正常的生活，無需服用任何免疫抑制藥物。體外模擬試驗已初步獲得成功。

（本刊訊）

Rapid Detection Device of Bacteria Drug-sensitivity using Electrical Impedance Method

【Writers】Wang Hongzhi1.2, Pang Xiaofeng1△, Wang Aihua2
1 Biological Electro Magnetic and Bioelectronic Technological Key Laboratory of Sichuan Province, College of Life science and Technology, Electron Scienti fi c and Technological University, Chengdu 610054, China 2 Physiology Laboratory, College of Life science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, China

impedance; bacterial drug sensitivity; impedance curve; detection device

】Since the bacteria metabolites in the process of growth and reproduction of can lower the resistivity characteristics of the medium, the electrical impedance method can develop a rapid detection device of bacterial drug sensitivity. The device consists of micro-organisms impedance sensors, computer systems, signal generator, resistance Anti-detection circuit, the time allocation controller, constant temperature incubator and auxiliary circuits and other components. It measures the electrical impedance of the medium, and bacteria in the culture period to obtain the impedance value of the monitor into the impedance curve. Drug sensitivity of bacteria can be determined, using this form of differential impedance curve. This detection device signi fi cantly shortened the time of bacterial drug susceptibility testing, achieving rapid drug susceptibility testing of clinical medicine, drug susceptibility testing automation and intelligence.

1671-7104(2010)04-0326-04

2010-04-27

龐小峰，E-mail: xiaofang869@yahoo.cn.com

R318.6

A

10.3969/j.isnn.1671-7104.2010.04.004

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