張英 張荔茗 黃雪梅

多重PCR檢測反復上呼吸道感染兒童病毒的研究

張英 張荔茗 黃雪梅

目的 探討多重PCR在檢測反復上呼吸道感染兒童中病毒的價值。方法 獲取急性上呼吸道感染兒童的呼吸道臨床標本，設計4組病毒套式PCR引物，對其進行基因擴增。結(jié)果 在102例急性反復呼吸道感染兒童中，66例患者至少有1種病原體陽性，其中以流感病毒A，副流感病毒，呼吸道合胞病毒最常見，但并未檢測出冠狀病毒如SARS。結(jié)論 多重PCR能快速檢測急性呼吸道感染患者中的多種病毒，可用于臨床診斷與疾病監(jiān)測。

多重PCR；上呼吸道感染；病毒

反復上呼吸道感染是兒童中最常見的疾病，病毒是最常見的感染因素。自從PCR技術(shù)問世以來，它已經(jīng)成為了難培養(yǎng)病原體如病毒檢測的理想方法。但單一的PCR反應一次只能檢測一種病原體，隨后衍生的多重PCR原理與普通PCR一樣，但因在反應體系中加入了多對引物，因此能在同一反應試管內(nèi)同時檢出多種病原體，能為臨床提供更多更準確的診斷信息[1]。本研究通過運用多重PCR對102例急性上呼吸道感染兒童標本中病毒進行了檢測，研究結(jié)果如下。

1 材料和方法

1.1 病人的選擇 本研究的102例反復上呼吸道感染的兒童均為2008年4月～2009年12月我市三甲醫(yī)院收治的門診或兒科住院患者，年齡均不超過12歲。反復急性上呼吸道感染按1987年成都會議診斷標準，即0～2歲上感次數(shù)7次/年，5～6歲6次/年，6～12歲5次/年以上；突然發(fā)病(＜36h)，并至少有以下1項癥狀或體征：咳嗽，咽喉疼痛，耳痛，聲音嘶啞，喘鳴/哮鳴音，呼吸困難或伴發(fā)熱。

1.2 多重PCR 無菌條件下獲取病人鼻咽抽吸物和鼻咽拭子雙份標本用于核酸提取。核酸提取試劑盒以及PCR反應試劑盒購自Qiagen公司，方法按照試劑盒的說明進行。本實驗共采用4組套式PCR引物用于檢測17種呼吸道病毒和非典型性細菌。第1組引物用于擴增A、B流感病毒和H1、H3、H5亞型。第2組引物用于擴增1、2、3、4型副流感病毒。第3組引物用于A、B型呼吸道合胞病毒，鼻病毒、腸道病毒的檢測。第4組引物用于擴增冠狀病毒OC43，229E，SARS-CoV，以及變性肺病毒。擴增條件按照參考文獻提供的方法進行[2]。

2 結(jié)果

在本研究當中，102例標本共檢測出66例患者至少有1種病原體陽性(64.7%，66/102)，其中鼻咽抽吸物中檢測出32例(31.4%，32/102),雖然略高于鼻咽拭子(29.4%，30/102),經(jīng)x2檢驗兩者無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。所有檢測出的病原體中，以流感病毒A，副流感病毒，呼吸道合胞病毒最常見，占43.9%(39/66)。另外9例患者存在2種病原體感染，包括：2例變性肺病毒合并腺病毒感染，2例患者副流感病毒合并呼吸道合胞病毒感染，其余5例兒童為合并其他細菌感染。1例患者同時伴有呼吸道合胞病毒、鼻病毒、腸道病毒感染。

3 討論

PCR技術(shù)是一種快速、簡便、特異的核酸分析擴增手段，近年來在臨床上應用非常廣泛。由于病毒分離培養(yǎng)難，而常規(guī)的ELISA檢測往往需要獲得雙份血清標本，或者因假陽性的問題而存在各種不足，特別是對于罕見、難培養(yǎng)的支原體、衣原體，PCR技術(shù)也許是唯一可行的方法。根據(jù)PCR技術(shù)的檢測量，可分為普通PCR(或單一PCR)及多重PCR。普通PCR僅應用一對引物，通過PCR擴增產(chǎn)生一個核酸片段，主要用于單一病原體的鑒定[3]。但在臨床上，如急性反復上呼吸道感染，通常是由多種病原菌引起的混合感染，因此建立快速、精確的檢測方法，對臨床指導用藥具有極其重要的意義。

在本研究當中，共檢測出66例病毒陽性標本，檢出率達64.7%?？赡苁潜狙芯慨斨胁±x取的差異等原因，鼻咽抽吸的陽性檢出率略高于鼻咽拭子，而統(tǒng)計學分析表明兩種不同的取材方法對檢出率無明顯差別[4]。從檢測出的病原體來看，以流感病毒A，副流感病毒，呼吸道合胞病毒最常見，同時，2種以上病毒感染也非常常見，包括變性肺病毒合并腺病毒感染、副流感病毒合并呼吸道合胞病毒感染以及并發(fā)其他細菌感染。

多重PCR的另一優(yōu)勢是大大縮短了病原體的檢測時間。通常情況下，普通PCR需要花費35min～3h，而多重PCR能在1d內(nèi)同時完成近20種病原體的檢測。因此從某種意義上講，盡快做出病原學診斷，不但對早期給予相應的治療提供了參考，減少誤診，同時也能減輕患者及家屬的焦慮情緒。但任何事物都具有兩面性，多重PCR雖然優(yōu)勢明顯，但因涉及到多條引物，如果設計不合理，在反應過程可能會降低反應的敏感性，且費用較普通PCR高[6]，因此對實驗條件要求比較苛刻。

當然，單純憑PCR結(jié)果陽性尚不能作出某病原體感染的結(jié)論，還需要結(jié)合其他診斷方法及臨床資料。盡管如此，多重PCR因其快速、高通量檢測，這在流行病學分析以及疾病監(jiān)測方面，依然具有重要意義。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2010.21.108

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