梁 義,尹 琦,陳 勇

(廣西柳州市柳鐵中心醫(yī)院皮膚科 545007)

隨著廣譜抗菌藥物、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和抗腫瘤化療藥物等的廣泛應(yīng)用,以及器官移植的廣泛開展,近年來侵襲性馬爾尼菲青霉菌感染(PSM)發(fā)病率和病死率逐年升高。肺臟是PSM最常見的感染部位[1],常規(guī)診斷方法存在許多局限性或敏感性、特異性低,或時(shí)效性差或標(biāo)本取材困難[2],亟待建立更為可靠﹑快速的診斷方法。血漿馬爾尼菲青霉菌細(xì)胞壁成分1,3-β-D-葡聚糖檢測已成為目前倍受關(guān)注的侵襲性馬爾尼菲青霉菌感染診斷方法[3]。本研究通過制作肺部馬爾尼菲青霉菌感染動物模型,為以后檢測血漿中1,3-β-D-葡聚糖水平并評價(jià)其在肺部馬爾尼菲青霉菌感染中的診斷價(jià)值,為臨床上推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 實(shí)驗(yàn)用馬爾尼菲青霉菌由本院微生物室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級健康成年SD新西蘭大白兔,重約1 000～1 500g,雌雄不限,共75只,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 將75只新西蘭大白兔隨機(jī)分成3個(gè)組,每組25只,分別為肺部馬爾尼菲青霉菌感染免疫抑制組(A組)、免疫抑制健康組(B組)、肺部馬爾尼菲青霉菌感染健康組(C組)。

1.3.2 肺部感染動物模型制作 (1)真菌感染動物模型:用生理鹽水將在37℃培養(yǎng)、生長旺盛的馬爾尼菲青霉菌配制成1×109cfu/mL混懸液,將新西蘭大白兔給予氯胺酮(100mg/kg,腹腔注射)麻醉、固定后,用自制氣管插管分別插入A組和C組新西蘭大白兔氣管內(nèi),將馬爾尼菲青霉菌混懸液分別注入A組和C組的新西蘭大白兔氣管內(nèi),按106cfu/g每次注入混懸液0.5～1.0mL,1次/天,連續(xù)3d。接種前3d開始肌內(nèi)注射環(huán)孢霉素A,給予A組和B組的每只新西蘭大白兔環(huán)孢霉素A 5.0mg/(kg?d),直至接種結(jié)束。(2)B組新西蘭大白兔只給予同量的環(huán)孢霉素A肌肉注射后,不作任何其他處理。接種完成后每天觀察各組新西蘭大白兔的精神狀態(tài)、活動、飲食及一般狀況。接種后頭3d各組新西蘭大白兔未出現(xiàn)明顯異常。第7、8天時(shí),4只A組的新西蘭大白兔出現(xiàn)精神萎靡、活動進(jìn)食減少現(xiàn)象。第9天A組的新西蘭大白兔全部發(fā)病。而B組和C組的新西蘭大白兔均未出現(xiàn)明顯異常表現(xiàn)。于接種后第9天以無菌操作采取各組新西蘭大白兔血標(biāo)本和肺組織標(biāo)本,采血方法均經(jīng)心臟穿刺取血4～5mL,經(jīng)心臟穿刺新西蘭大白兔死亡后統(tǒng)一取新西蘭大白兔右肺組織。各組血標(biāo)本均以無菌抗凝管收集,分別留取A組、B組和C組的每只新西蘭大白兔的血標(biāo)本2～3 mL送本院微生物室以葡萄糖蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基做真菌培養(yǎng)。

2 結(jié) 果

各組模型動物肺組織病理結(jié)果:(1)A組,25只新西蘭大白兔中,有25只的肺組織中發(fā)現(xiàn)馬爾尼菲青霉菌菌絲、孢子。肺組織均見程度不等的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤及壞死灶形成;并有組織細(xì)胞肉芽腫形成,肉芽腫可擴(kuò)大融合,中央壞死和白細(xì)胞反應(yīng)形成膿腫,膿腫壁由組織細(xì)胞構(gòu)成,膨脹的組織細(xì)胞內(nèi)有大量酵母繁殖。酵母圓形、橢圓形、臘腸形、馬蹄形。HE染色酵母胞膜、胞漿不著色,致使淡藍(lán)色的核周圍有一空暈。PAS染色陽性。Grocotts染色陽性,菌體內(nèi)橫隔著色深于胞膜,故長形、馬蹄形菌體可見橫隔,于橫隔處裂殖[4-5]。(2)B組和C組新西蘭大白兔的肺組織HE染色光鏡下呈現(xiàn)正常肺組織結(jié)構(gòu),未見有明顯炎癥病理改變。所有新西蘭大白兔血真菌培養(yǎng)結(jié)果均為陰性。

3 討 論

馬爾尼菲青霉菌為肺部真菌感染的致病菌,且為條件致病菌,即宿主一般要有免疫缺陷等宿主因素才能致病。本研究中肺部感染免疫抑制模型的制作,是通過給予新西蘭大白兔環(huán)孢霉素A造成宿主的免疫抑制,并通過氣管插管方法將馬爾尼菲青霉菌注入新西蘭大白兔氣管內(nèi),使其更容易被侵襲到肺部而導(dǎo)致肺組織的真菌感染,接種馬爾尼菲青霉菌后的免疫抑制新西蘭大白兔于第9天全部出現(xiàn)精神萎靡、進(jìn)食減少等癥狀,肺組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)馬爾尼菲青霉菌菌絲和孢子的侵入,并伴有相應(yīng)的炎癥病理改變,由此可確定肺部馬爾尼菲青霉菌感染模型制作成功。對于灌注菌量的選擇,本研究在參考了劉棟華等[1]、吳易等[2]、梁伶等[6]的研究數(shù)據(jù)(灌注菌量為 105cfu/g)后,根據(jù)本研究的目的和實(shí)驗(yàn)動物特點(diǎn),選擇的灌注菌量為106cfu/g,成功地制作了肺部馬爾尼菲青霉菌感染模型。證明在免疫抑制條件下,本研究選擇的灌注菌量106cfu/g,能100%(25/25)導(dǎo)致新西蘭大白兔肺部感染馬爾尼菲青霉菌。該結(jié)果從側(cè)面印證了臨床上馬爾尼菲青霉菌病主要發(fā)生于免疫抑制患者的肺部[1-2]。

關(guān)于馬爾尼菲青霉菌病動物模型的制作傳統(tǒng)方法有靜脈接種和腹腔內(nèi)接種等,而本研究中采用的氣管內(nèi)接種法較少見,氣管內(nèi)接種途徑對肺部感染的制作更有意義。氣管內(nèi)馬爾尼菲青霉菌接種法可以成功模仿肺部馬爾尼菲青霉菌感染模型,展現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)性馬爾尼菲青霉菌病的自然演變過程,為馬爾尼菲青霉菌病基礎(chǔ)研究的進(jìn)展奠定了基礎(chǔ),同時(shí)對更加深入地研究馬爾尼菲青霉菌病的預(yù)防、診斷和治療具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

[1]劉棟華,譚升順,梁伶,等.經(jīng)皮膚損傷感染馬爾尼菲青霉菌致病力動物實(shí)驗(yàn)研究[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2006,20(6):324.

[2]吳易,梁伶,李菊裳.廣西銀星竹鼠與人馬爾尼菲青霉病關(guān)系的研究[J].中國皮膚性病學(xué)雜志,2004,18(4):196.

[3]Yoshida M,Roth RI,Grunfeld C,et al.Soluble 1,3-β-D-glucan purified fromCandida albicans:biologic effects and distribution in blood and organs in rabbits[J].Lab Clin Med,2000,128(1):103.

[4]黃長武,李興祿,黃藝,等.馬爾尼菲青霉菌的鑒定[J].微生物學(xué)雜志,2006,26(1):61.

[5]陳姝,婁世鋒,黃長武,等.馬爾尼菲青霉菌病1例報(bào)告并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)[J].重慶醫(yī)學(xué),2005,34(4):637.

[6]梁伶,成先桂,劉棟華,等.馬爾尼菲青霉菌野生株和臨床分離株致病力研究[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào),2008,24(3):240.