張國海,梁麗英綜述,許瑞安,2審校

(華僑大學(xué):1.分子藥物學(xué)研究所,泉州362021;2.分子藥物教育部工程研究中心,泉州362021)

RNA干擾抗丙型肝炎病毒的研究進(jìn)展

張國海1,梁麗英1綜述,許瑞安1,2審校

(華僑大學(xué):1.分子藥物學(xué)研究所,泉州362021;2.分子藥物教育部工程研究中心,泉州362021)

丙型肝炎病毒;siRNA;microRNA;RNA干擾;聯(lián)合治療

丙型肝炎病毒(HCV)感染嚴(yán)重危害全人類健康,是主要的公共衛(wèi)生問題之一。據(jù)估計全世界 HCV陽性率為3%,大約有1.7億的感染者[1]。令人遺憾的是,到目前為止,市場上仍然沒有安全、有效的疫苗或抗體來防止 HCV感染。目前慢性 HCV感染的標(biāo)準(zhǔn)療法是聯(lián)合使用聚乙二醇α-干擾素和利巴韋林(ribavirin)。然而,這種標(biāo)準(zhǔn)療法的成功卻取決于病毒的基因型和治療之初病毒的載量,僅有約50%的患者會產(chǎn)生持續(xù)的病毒學(xué)應(yīng)答,因而不能徹底根除病毒。此外,高昂的價格和嚴(yán)重的不良反應(yīng)也限制了這種標(biāo)準(zhǔn)療法的廣泛使用。開發(fā)新型的、更加安全有效的抗病毒治療方法具有時空緊迫性和重要現(xiàn)實意義。

充分了解病毒感染、復(fù)制機(jī)理,以及在此過程中與宿主細(xì)胞相關(guān)因子的相互作用是開發(fā)新型治療方法的先決條件,不但可以認(rèn)識發(fā)病全過程,而且可以從中發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)和途徑。近年來在探索 HCV病毒基因組學(xué)和病毒感染、復(fù)制機(jī)理方面取得了重大突破,研究表明基于siRNA和micro RNA的干擾治療有望成為抗病毒治療的新型治療方法。本文就RNA干擾在抗病毒治療中取得的最新進(jìn)展作一綜述。

1 基于siRNA的抗病毒分子治療

1.1 RNA干擾的作用機(jī)制 RNA干擾 (RNAi)又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默,是在m RNA水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的一種特有方式,最初發(fā)現(xiàn)于1998年。當(dāng)時,Fire和M ello等發(fā)現(xiàn)把反義核糖核酸和正義核糖核酸的混合物導(dǎo)入后,其發(fā)揮的抑制效應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于單獨(dú)導(dǎo)入反義核糖核酸或正義核糖核酸的抑制效應(yīng)。后來的研究表明是被切割成22～25 nt小片段干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)特異性的降解了m RNA,導(dǎo)致基因沉默的效應(yīng)。這種能特異性誘導(dǎo)基因沉默的核酸片段既可經(jīng)由化學(xué)合成 siRNA直接導(dǎo)入細(xì)胞,也可由表達(dá)雙鏈 RNA(dsRNA)載體間接導(dǎo)入?；瘜W(xué)合成的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞后能直接發(fā)揮基因沉默效應(yīng),而由載體導(dǎo)入的長雙鏈RNA或者短的發(fā)卡RNA(shRNA)則需一種具有RNA酶Ⅲ活性的內(nèi)切酶“Dicer”的切割下形成具有活性的siRNA。隨后siRNA與核酶復(fù)合物相結(jié)合形成 RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體 (RISC),與此同時,進(jìn)入復(fù)合物的雙鏈siRNA也隨著RISC的激活而被解成單鏈。其中只有一條鏈被參入復(fù)合體中,作為引導(dǎo)序列通過堿基互補(bǔ)的原則識別同源性的m RNA,與復(fù)合體結(jié)合的m RNA被核酸“Dicer”切割成21～25 nt的片段,從而特異性地抑制靶基因表達(dá)。siRNA還可以在 RNA依賴性 RNA聚合酶 (RdRp)的作用下大量擴(kuò)增,新合成的 dsRNA再經(jīng)“Dicer”酶切割,形成新的 siRNA,再作用于靶向m RNA,進(jìn)而產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng),終使靶向m RNA全部降解,達(dá)到抑制相應(yīng)基因的表達(dá)的目的[2]。

1.2 病毒靶向性干擾治療 作為一種新技術(shù),越來越多的研究表明RNA干擾可用于 HCV抗病毒治療。RNA干擾是通過特異性的降解同源性的m RNA,從而達(dá)到在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)。HCV的基因組是一條單鏈的RNA,它既可作為轉(zhuǎn)錄的模板,也可作為中間體負(fù)鏈復(fù)制的模板,是最佳的干擾對象[3]。尤其是位于 5′非編碼區(qū)的內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES),序列的保守性以及在翻譯過程中的重要作用[4]使其成為RNA干擾最理想的目標(biāo)。Ilves等[5]將靶向于IRES的發(fā)卡RNA(shRNA)轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)細(xì)胞和老鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)依賴于HCV IRES的基因表達(dá)受到明顯的抑制。Kanda等[6]采用載體將靶向于IRES IIId亞基和 IIIe亞基之間部分的發(fā)卡RNA(psh-274)導(dǎo)入到持續(xù)感染1a型 HCV(H77)或2a型 HCV(JFH1)的 Huh-7.5細(xì)胞中,病毒的復(fù)制受到明顯的抑制,且沒有引起免疫反應(yīng)。Meng等[7]利用細(xì)胞穿膜肽 H IV Tat蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)靶向于5′非編碼區(qū)頸環(huán)結(jié)構(gòu)的 siRNA,在 Huh-7細(xì)胞中,能顯著抑制 HCV的復(fù)制。這說明對 IRES特異靶向的RNA干擾能夠有效地進(jìn)行抗 HCV病毒治療,尤其是載體介導(dǎo)的shRNA較之于 siRNA,能夠更加長期有效地抑制 HCV復(fù)制,其安全性更高。盡管特異靶向于 IRES的RNA干擾非常有效抑制HCV病毒復(fù)制,卻不能從源頭上清除病毒。Gamble等[8]采用靶向于 IRES的反義DNA與人工構(gòu)建的核糖核酸酶結(jié)合,發(fā)現(xiàn)這些藥物在感染 HCV的 Huh-7細(xì)胞中,不但可抑制 HCV的復(fù)制,而且利用人工構(gòu)建的核糖核酸酶通過在HCV基因組的某個位點(diǎn)進(jìn)行切割抑制 HCV的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而大大提高了抗病毒效果。

除此之外,HCV病毒核心以及非結(jié)構(gòu)區(qū)域NS3、NS4B、NS5A和NS5B也常被選擇為RNA干擾用于病毒靶向性分子治療的重要靶點(diǎn)。特別是序列保守性最高的NS5B,常常是人們研究的熱點(diǎn)。

HCV RNA依賴的RNA聚合酶 (NS5B)對正鏈、負(fù)鏈的合成起著決定性作用。先前就有研究證實了靶向NS5B進(jìn)行抗病毒分子治療的可行性[9]。2004年 Takigawa等[10]用重組的慢病毒來表達(dá)靶向于NS5B的 shRNA,導(dǎo)入到感染1b型HCV細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)病毒的復(fù)制受到極大的抑制,此外,合成的靶向于NS3的siRNA也對1b型 HCV的復(fù)制起到明顯的抑制作用,這種抑制效應(yīng)呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系[10]。這不僅說明了靶向于NS5B的RNA干擾可用于抗病毒分子治療,同時也預(yù)示著由病毒載體介導(dǎo)的靶向于NS3的發(fā)卡RNA也將成為抗1b型HCV感染的重要治療手段。然而由于病毒基因組序列的高突變性,使這種依賴于高度序列匹配性的分子治療常常在治療幾次后逐漸失去了治療效果[11]。與此同時,研究發(fā)現(xiàn)位于NS5B編碼區(qū)的莖-環(huán)結(jié)構(gòu) (stem-loop)作為順式復(fù)制元件在HCV復(fù)制過程中發(fā)揮著重要作用。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)用與NS5B編碼區(qū)莖環(huán)結(jié)構(gòu)高度相似的小RNA分子作為誘餌可競爭性地與調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合,通過抑制病毒組中某些重要基因的表達(dá),進(jìn)而抑制病毒的復(fù)制。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),由腺病毒介導(dǎo)的能夠精確編碼莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的 RNA(SL RNA)在 Huh-7細(xì)胞中可顯著封閉 HCV的復(fù)制,特別是來自2a型 HCV的SL RNA還能夠抑制1b型 HCV的復(fù)制,呈現(xiàn)出廣泛的抗病毒效果[12]。

1.3 宿主細(xì)胞靶向性干擾治療 除了病毒基因組外,宿主細(xì)胞所表達(dá)的與病毒感染相關(guān)的細(xì)胞因子也可以作為分子治療的重要靶點(diǎn)。研究表明諸如CD81、糖胺聚糖、清道夫受體B族 (SR-B I)、低密度脂蛋白受體、樹突狀細(xì)胞表面的特異性細(xì)胞間黏附因子3結(jié)合非整合素分子 (DC-SIGN)以及人類緊密連接分子occludin等細(xì)胞相關(guān)因子在 HCV進(jìn)入宿主細(xì)胞的不同階段發(fā)揮著重要作用[13-14]。研究還發(fā)現(xiàn)F-box富含亮氨酸重復(fù)蛋白2(FBL-2)、囊泡相關(guān)膜蛋白相關(guān)蛋白A(VAPA)和B(VAP-B)、FK506結(jié)合蛋白8以及熱休克蛋白等細(xì)胞因子在病毒的復(fù)制過程中發(fā)揮著重要作用。與病毒基因組相比,這些潛在的治療靶點(diǎn)有一個顯著的優(yōu)勢就是突變率較低,所以,靶向于這些位點(diǎn)的分子治療更易于逃脫由突變引起的抗性,進(jìn)行持久的治療。

CD81是表達(dá)在絕大多數(shù)人類細(xì)胞表面的一種跨膜非糖基化蛋白,緣于和 HCV E2蛋白結(jié)合而被認(rèn)為是 HCV進(jìn)入細(xì)胞的主要受體。Koutsoudakis等[15]用RNA干擾的方法調(diào)節(jié)CD81在 Huh-7細(xì)胞表面的表達(dá),結(jié)果顯示 CD81的數(shù)量在HCV感染過程中發(fā)揮著重要作用。同時細(xì)胞感染 HCV的敏感性也依賴于CD81的數(shù)量,在低量表達(dá)CD81時,HCV的感染明顯受到限制。Meuleman等[16]用CD81的抗體來處理人源化的uPA-SCID大鼠,發(fā)現(xiàn)能夠抵抗各種 HCV病毒菌株的攻擊,而對已經(jīng)感染 HCV的大鼠來說卻沒有影響。這些充分說明細(xì)胞表面的CD81是 HCV進(jìn)入宿主細(xì)胞的關(guān)鍵決定因子。此外,在其他細(xì)胞相關(guān)因子中,清道夫受體B族 (SR-B I)也常為研究熱點(diǎn)。研究顯示通過RNA干擾的方法下調(diào)90%SR-BI在 Huh-7細(xì)胞表面的表達(dá),可抑制30%～90%HCV的感染,這種抑制率通常是由 HCV的基因型決定的[17]。

RNA干擾還能與干擾素聯(lián)合進(jìn)行抗病毒治療。RNA干擾通過直接抑制病毒的進(jìn)入、復(fù)制而發(fā)揮抗病毒效果;干擾素則是通過激活體內(nèi)引起抗病毒反應(yīng)的基因而間接發(fā)揮作用。抗病毒機(jī)制的互補(bǔ)性,使二者聯(lián)合用于抗病毒治療成為可能。Pan等[18]用慢病毒介導(dǎo)RNA干擾與干擾素α聯(lián)合進(jìn)行抗病毒治療,結(jié)果顯示干擾素治療不會影響病毒載體的轉(zhuǎn)染效率,也不會影響RNA干擾對目標(biāo)基因的沉默,而且表現(xiàn)出協(xié)同治療效果。因此,RNA干擾的分子治療與干擾素聯(lián)合治療必將成為更加安全有效的抗HCV感染的治療方法。

2 基于microRNA的抗病毒分子治療

2.1 microRNA的作用機(jī)制 microRNA(miRNA)主要是通過5′端的前2～8個核苷酸種子序列(seed sequence)識別m RNA 3′端非翻譯區(qū) (3′U TR)來實現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。根據(jù)匹配完美程度的不同,miRNA調(diào)節(jié)基因的表達(dá)主要通過以下2種途徑:(1)不完全匹配,翻譯被抑制而不影響m RNA的穩(wěn)定性;(2)完全匹配,m RNA被切割進(jìn)而下調(diào)基因表達(dá)。此外,miRNA還可以通過指導(dǎo)其靶向基因的 m RNA快速脫腺苷化,進(jìn)而導(dǎo)致 m RNA的快速衰減和表達(dá)水平的降低[19]。

2.2 miRNA與 HCV的復(fù)制和翻譯 來至宿主細(xì)胞的miRNA,特別是肝臟特異性的 miRNA:miRNA-122在 HCV的復(fù)制和翻譯過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。Jopling等[20]研究顯示miRNA-122通過靶向于 HCV基因組 5′NCR能夠促進(jìn)HCV的復(fù)制,他們發(fā)現(xiàn) HCV只能在表達(dá) miRNA-122的Huh-7細(xì)胞中復(fù)制,而不能在不表達(dá)miRNA-122的 Hep G2細(xì)胞中復(fù)制。研究進(jìn)一步顯示miRNA-122在 HCV基因組中的結(jié)合位點(diǎn)對于 HCV的復(fù)制調(diào)節(jié)有著非常重要的作用[21]。實驗表明當(dāng)把miRNA-122的結(jié)合位點(diǎn)插入到基因組的3′NCR,m RNA的表達(dá)會明顯下調(diào),而 miRNA-122與位于5′NCR的結(jié)合位點(diǎn)相互作用時,病毒的復(fù)制明顯增加[21]。

此外,miRNA-122還可以通過下調(diào)血紅素加氧酶1(HO-1)間接地促進(jìn) HCV的復(fù)制[22],因為 HO-1能夠抑制 HCV的復(fù)制[23]。與此同時,HCV RNA的翻譯也與 miRNA-122相關(guān)。封閉miRNA-122后,HCV的翻譯明顯減少,而在肝細(xì)胞中重新加入 miRNA-122后則能顯著促進(jìn) HCV RNA的翻譯[24]。進(jìn)一步研究顯示 miRNA-122是通過增強(qiáng)核糖體與RNA在翻譯起始階段的相互作用來促進(jìn) HCV RNA的翻譯[24]。

在其他宿主-miRNAs中,與 HCV基因組有相似序列的miR-199a＊也與 HCV的復(fù)制有關(guān)。M urakami等[25]研究發(fā)現(xiàn),在感染 HCV-1b或-2a型的細(xì)胞中過量表達(dá) miR-199a＊能抑制 HCV的復(fù)制,而通過反義寡核苷酸封閉miR-199a＊后,病毒的復(fù)制明顯加速。由此可見,miR-199a＊可作為 HCV復(fù)制的抑制劑而被用于抗病毒分子治療。

2.3 基于miRNA的抗病毒治療 研究表明抑制miRNA-122的功能往往能夠得到良好的抗病毒治療效果。Shan等[22]通過在感染 HCV的 Huh-7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-122拮抗劑可使HCV減少84%?，F(xiàn)在,用于沉默miRNA-122拮抗劑主要是反義寡核苷酸 (ASO)的修飾物。據(jù)報道,2′-甲氧乙基-磷酸酰(MOE)修飾物能夠在肝臟內(nèi)顯著抑制 miRNA-122的活力,鎖核酸 (LNA)修飾的ASO作為一種改進(jìn)策略能夠更好地封閉miRNA-122的功能。與miRNA-122恰恰相反,miR-199a＊則表現(xiàn)出抑制 HCV復(fù)制的調(diào)節(jié)效應(yīng),在靶細(xì)胞中過量表達(dá)miR-199a＊應(yīng)該是一種比較合理的抗病毒治療方法。作為調(diào)節(jié)分子,miRNA確切的生理功能尚未完全搞清楚,但作為一種高效、安全、特異性的抗病毒治療方法,miRNA在不久的將來一定能夠得到廣泛的應(yīng)用。

3 結(jié)果與展望

探索HCV生活周期以及其與宿主細(xì)胞相關(guān)因子之間的相互作用開闊新藥研發(fā)的視野,人們發(fā)現(xiàn)了許多可用于抗病毒分子治療的新靶點(diǎn)。尤其是RNA干擾技術(shù)在基因沉默和靶標(biāo)篩選領(lǐng)域的應(yīng)用,能夠在 HCV感染不同時期不同階段進(jìn)行特異性干擾,由此揭示了許多病毒-宿主相互作用的新機(jī)制,提供了更多潛在的治療靶點(diǎn)。

盡管人們在小分子調(diào)節(jié)物研究方面取得了長足的進(jìn)展,基于siRNA和miRNA的干擾治療作為一種新型抗病毒臨床治療方法還有一段相當(dāng)漫長的道路,尤其是miRNA的干擾治療。首先,必須詳盡地闡明miRNA具體調(diào)節(jié)機(jī)制以及其在生命周期中的生理功能,進(jìn)而揭示更多潛在的治療靶點(diǎn)以及其用藥的安全性、可靠性、準(zhǔn)確性。其次,HCV的高突變性常常使干擾治療因病毒產(chǎn)生抗性而在多次給藥后失去治療效果,因此,篩選到一個或幾個高度保守的治療靶點(diǎn)乃是抗病毒治療取得成功的關(guān)鍵。相信隨著研究的不斷深入,RNA干擾作為一種新型抗病毒治療方法一定能展示出其誘人的 HCV臨床治療效果。

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