陳麗萍,張麗靜,傅華

(農(nóng)業(yè)部草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,甘肅 蘭州730020)

鐵是幾乎所有生物體所必需的元素。鐵含量在地殼中居第4位,但在生物體中的含量則很低。這與Fe3+易形成難溶的化合物導(dǎo)致生物對(duì)鐵的吸收和利用程度降低有關(guān)。雖然土壤中含有大量的鐵,但在干旱和半干旱的石灰性土壤上生長(zhǎng)的雙子葉植物和非禾本科單子葉植物卻經(jīng)常表現(xiàn)出缺鐵癥狀,鐵營(yíng)養(yǎng)失調(diào)成為限制植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的重要因素之一[1]。植物缺鐵,可引起葉綠素合成受阻,從而導(dǎo)致葉片黃化,光合作用降低,最終造成產(chǎn)量和品質(zhì)的重大損失,因此,改善植物貯存鐵的能力,提高植物的鐵營(yíng)養(yǎng)成分,是解決這個(gè)問(wèn)題的有效途徑[2]。鐵缺乏時(shí)也會(huì)影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育,甚至導(dǎo)致一些缺乏鐵的綜合癥,如毛皮動(dòng)物等對(duì)鐵缺乏特別敏感,尤其是新生仔獸,易患原發(fā)性缺鐵病,導(dǎo)致缺鐵性貧血[3]。而且對(duì)人類(lèi)來(lái)說(shuō),鐵缺乏是當(dāng)今世界最為嚴(yán)重的營(yíng)養(yǎng)缺乏癥之一,也是引致貧血的主要原因之一[4],所以提高植物體內(nèi)鐵含量,可為植物自身解除許多由缺鐵引起的病癥,也可為動(dòng)物和人類(lèi)帶來(lái)福音。

鐵蛋白(ferritin)是一種專(zhuān)門(mén)存儲(chǔ)鐵的蛋白質(zhì),它廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物體內(nèi),既可以?xún)?chǔ)存大量的可被植物利用的鐵,又能抵抗環(huán)境脅迫[5]。植物鐵蛋白儲(chǔ)存鐵的能力高于其他蛋白[6],且鐵蛋白由特殊酶亞基形成,無(wú)需導(dǎo)入任何其他基因去誘導(dǎo)產(chǎn)生翻譯產(chǎn)物[7]。它是一類(lèi)多聚體蛋白,在細(xì)胞內(nèi)具有調(diào)控鐵生物功能的作用,主要在種子形成、葉片衰老或環(huán)境鐵過(guò)量時(shí)積累鐵,在種子萌發(fā)或質(zhì)體綠化等過(guò)程中釋放鐵,從而調(diào)節(jié)植物對(duì)鐵的吸收和釋放,維持鐵的動(dòng)態(tài)平衡,具有鐵儲(chǔ)存和避免鐵毒害的雙重功能[8,9]。在植物體中作為一種脅迫反應(yīng)蛋白[10],當(dāng)植物受到寒冷、干旱、強(qiáng)光照、重金屬離子等外界環(huán)境的脅迫時(shí),植物受到損傷,體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)有鐵蛋白的存在[11];在鐵供應(yīng)過(guò)量的情況下,植物體內(nèi)其含量是鐵正常供應(yīng)的40～50倍[12]。

近年來(lái),鐵蛋白基因作為提高生物體內(nèi)鐵含量,以抵抗外界環(huán)境脅迫、預(yù)防生物體缺鐵性病癥的發(fā)生而備受關(guān)注。自1963年Hyde等[13]第一次報(bào)道鐵蛋白以來(lái),植物鐵蛋白在許多植物中得到證實(shí),如豌豆(Pisum sativum)、大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays)、紫花苜蓿(Medicagosativa)等[14-17]。植物體內(nèi)有多種鐵蛋白基因,一些是組成性表達(dá),而另一些則受多種因素誘導(dǎo),如脫落酸(ABA)、鐵離子等[18]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)成為生物遺傳改良的有效途徑,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi),提高植物特別是糧食作物、果樹(shù)等中的鐵含量及抗重金屬脅迫能力等的研究也取得了突破性的進(jìn)展[19-21],不僅可以滿足人類(lèi)對(duì)鐵的需求,緩解或防御由于鐵缺乏而引起的一系列疾病,而且能提高植物對(duì)環(huán)境的耐受性,在生物治療中具有重要意義。本研究對(duì)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及鐵蛋白基因的克隆、表達(dá)和遺傳轉(zhuǎn)化研究等進(jìn)行了系統(tǒng)總結(jié),旨在為今后進(jìn)一步的深入研究提供參考。

1 鐵蛋白的結(jié)構(gòu)及其分布

1.1 鐵蛋白的結(jié)構(gòu)

作為一種鐵結(jié)合和貯存蛋白,鐵蛋白是一類(lèi)多聚體蛋白。動(dòng)物和植物的鐵蛋白起源于共同的祖先,是一個(gè)高度保守的蛋白[6],然而它們的基因結(jié)構(gòu)截然不同。雖然鐵蛋白在動(dòng)物、植物和微生物中基因的內(nèi)含子個(gè)數(shù)和所在位置是嚴(yán)格保守的,但是它們中的這些參數(shù)是不同的。動(dòng)物鐵蛋白中,內(nèi)含子的位置和蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)域相關(guān)[22,23],而植物鐵蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)域與內(nèi)含子/外顯子邊界沒(méi)有明顯的關(guān)系。植物鐵蛋白與動(dòng)物鐵蛋白的同源性為39%～49%,但和細(xì)菌鐵蛋白沒(méi)有明顯的同源性[5]。

植物鐵蛋白是由24個(gè)同源或異源亞基所結(jié)合成的1個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合體,每個(gè)亞基包括1個(gè)由4股長(zhǎng)螺旋組成的束、第5個(gè)短的螺旋和1個(gè)長(zhǎng)的突出環(huán),形成1個(gè)中空的蛋白外殼,直徑為12～13 nm,殼內(nèi)含1個(gè)復(fù)合體狀的無(wú)機(jī)鐵核,由細(xì)胞中過(guò)量鐵聚合形成,內(nèi)徑7～8 nm。每分子鐵蛋白能以可溶、無(wú)毒和生物體可利用的形式儲(chǔ)存0～4 500個(gè)鐵原子不等[6]。所有鐵蛋白是由1個(gè)球形蛋白質(zhì)外籠圍繞水合鐵氧化物而組成,鐵原子能夠在單一鐵蛋白這種鐵-蛋白復(fù)合物中濃縮[24]。鐵蛋白外殼的亞基以4重、3重和2重對(duì)稱(chēng)的形式相互排列[25]。在4重與3重軸線上具有離子通道,其中3重軸線附近通道是由親水殘基組成,可結(jié)合金屬離子如Cd2+、Zn2+、Tb3+或Ca2+等。3重通道是鐵的主要通道和Fe2+氧化作用位點(diǎn),鐵離子通過(guò)此通道進(jìn)入核中,在植物和哺乳動(dòng)物鐵蛋白中非常保守。4重對(duì)稱(chēng)軸亞單位之間的離子通道比3重軸線上的要窄一些,也是親水性的,但此結(jié)構(gòu)在動(dòng)物鐵蛋白中卻是疏水性的,因此認(rèn)為此結(jié)構(gòu)是動(dòng)物和植物鐵蛋白的主要區(qū)別之一[14]。

1.2 植物鐵蛋白的分布

最早通過(guò)電子顯微鏡技術(shù),僅在質(zhì)體的基質(zhì)中檢測(cè)到鐵蛋白的存在。盡管在葉綠體中也有鐵蛋白,但主要還是分布在低光合活性的非綠色質(zhì)體如前質(zhì)體、白色質(zhì)體、有色體、造粉體以及種子、幼苗、根的頂部[26]和豆科植物年幼的根瘤等特異組織中[15],而有光合活性的葉綠體中卻只有少量分布。另外,在植物導(dǎo)管細(xì)胞、維管形成層、生殖細(xì)胞和衰老的細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有鐵蛋白的存在[11]。

葉霞等[27]以轉(zhuǎn)菜豆鐵蛋白基因的嘎拉蘋(píng)果(Malus domestica)4個(gè)株系為試管苗材料,發(fā)現(xiàn)內(nèi)源鐵蛋白和外源鐵蛋白基因mRNA的含量均在試管苗的根部表達(dá)量最高,莖次之,葉片中最低,進(jìn)一步在分子水平上證實(shí)了鐵蛋白的分布規(guī)律。

當(dāng)處于脅迫條件下時(shí),鐵蛋白的分布會(huì)表現(xiàn)出異常現(xiàn)象。例如,體外培養(yǎng)的大豆細(xì)胞中,在質(zhì)體的外面也發(fā)現(xiàn)有鐵蛋白的存在。Roswitha等[28]用豌豆突變體dgl和brz發(fā)現(xiàn)鐵過(guò)量時(shí),鐵蛋白主要存在于突變體基部葉片的葉綠體中,以及細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜與細(xì)胞壁的空間。可能是由于過(guò)量鐵脅迫下,破壞了質(zhì)膜的完整性,引起鄰近壞死細(xì)胞中的鐵蛋白從衰退的葉綠體中流出所造成的。用硝酸鹽培養(yǎng)或者處于黑暗中的菜豆(Phaseolus vulgaris)和豌豆,在其細(xì)胞質(zhì)和沒(méi)被感染的組織間隙的造粉體,以及薄壁組織細(xì)胞中,均發(fā)現(xiàn)鐵蛋白的存在[29]。這可能是鐵蛋白作為一種脅迫反應(yīng)蛋白,在脅迫條件下產(chǎn)生的一種反應(yīng)。

2 鐵蛋白的功能

2.1 調(diào)控鐵生物功能、維持鐵平衡

生物體內(nèi)鐵的氧化還原反應(yīng)涉及電子傳遞過(guò)程,參與重要的生化反應(yīng)如光合作用和呼吸作用[30-32],鐵還是多種酶的輔助因子,參加了許多基本的反應(yīng)如DNA合成、植物固N(yùn)作用及植物激素合成[17],因此,缺鐵會(huì)造成嚴(yán)重的營(yíng)養(yǎng)紊亂,從而影響植物的生理代謝[33]。鐵與H2O2反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基,對(duì)植物產(chǎn)生巨大的毒性而損害生物有機(jī)體,控制細(xì)胞中自由Fe2+對(duì)植物防御由氧化脅迫帶來(lái)的損害非常重要[34]。鐵蛋白具有強(qiáng)大的貯鐵功能,將高毒性的Fe2+轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的Fe3+螯合物形式,并通過(guò)控制細(xì)胞中游離Fe2+濃度防御氧化脅迫對(duì)植物帶來(lái)的損害保持植物體內(nèi)鐵的平衡[35],為依賴(lài)于鐵的生理生化過(guò)程起暫時(shí)性的鐵緩沖作用。

2.2 在植物發(fā)育過(guò)程中的作用

植物鐵蛋白在植物體種子形成、葉片衰老或環(huán)境中鐵的過(guò)量積累方面有著重要功能,它可以在種子萌發(fā)或質(zhì)體綠化過(guò)程中釋放鐵,從而調(diào)節(jié)植物對(duì)鐵的吸收和釋放[30]。Lobreaux和Briat[32]1991年研究發(fā)現(xiàn)在豌豆種子中含有大量的鐵,在鐵蛋白中貯存的鐵占種子總鐵含量的92%,在種子生長(zhǎng)發(fā)育階段對(duì)鐵的吸收大量增加,免疫鑒定豌豆成熟種子中也存在鐵蛋白,保存的干種子中仍然存在。而種子發(fā)芽時(shí),鐵蛋白開(kāi)始降解,產(chǎn)生的鐵被用于種苗的生長(zhǎng)需要,這些都說(shuō)明鐵蛋白中鐵含量在植物發(fā)育過(guò)程中起重要的作用[36]。在處于發(fā)育階段的玉米葉片中,鐵蛋白存在于最幼嫩的葉段和含有衰老細(xì)胞的頂端,而富含成熟葉綠體和烯醇丙酮酸磷酸羧基酶的葉片中心部分則不存在鐵蛋白[37]?？赡苁侨~片鐵蛋白的含量與葉綠體的分化相關(guān),是鐵蛋白在植物生長(zhǎng)過(guò)程中的一種合成調(diào)控的途徑。

2.3 鐵蛋白與非生物脅迫

鐵蛋白的積累受各種環(huán)境信號(hào)的誘導(dǎo)。在寒冷、干旱、機(jī)械損傷、衰老、強(qiáng)光照等各種脅迫和重金屬、鐵過(guò)量,煙堿、H2O2、脫落酸、乙烯等化學(xué)物質(zhì)處理的條件下都發(fā)現(xiàn)植物中鐵蛋白基因的轉(zhuǎn)錄量增加數(shù)倍,并有大量的鐵蛋白存在,另外,抗壞血酸也影響或參與植物鐵蛋白的合成[20,32]。當(dāng)植物處于不利的環(huán)境下時(shí),氧化脅迫即占主要地位,抗氧化作用的防御能力減弱,由鐵介導(dǎo)的自由基的產(chǎn)生增強(qiáng),導(dǎo)致代謝失調(diào)、脂肪過(guò)氧化、蛋白質(zhì)分解和DNA損傷[10]。由于鐵蛋白可容納大量鐵,并以穩(wěn)定的形式儲(chǔ)存,所以對(duì)植物抵抗氧化脅迫以及提高植物自身的耐受性等方面有重要作用。

2.4 鐵蛋白與生物脅迫

植物中大量積累鐵蛋白,還可以對(duì)一些真菌的感染、病毒引起的壞死等表現(xiàn)出抗性,保護(hù)細(xì)胞免受因各種環(huán)境脅迫而導(dǎo)致的細(xì)胞氧化性損傷[17]。在有病害的植物組織如病毒感染和腫瘤等中,都發(fā)現(xiàn)有鐵蛋白的積累。如當(dāng)孢囊線蟲(chóng)(Heterodere glycines)浸染使根瘤的發(fā)育和功能受損后,大豆根部即有鐵蛋白的積累。此外,病毒感染和腫瘤也促使鐵蛋白積累[33]。鐵蛋白通過(guò)螯合被感染組織和裂解的組織中過(guò)量的鐵,可以避免鐵毒害,同時(shí)也能阻止病原體擴(kuò)散到其他組織,而大豆根部被線蟲(chóng)感染而引起的鐵蛋白合成,也可能是大豆結(jié)瘤過(guò)程被抑制所致[38]。

2.5 抗氧化功能

所有的鐵蛋白都可以在有氧條件下與溶液中的二價(jià)鐵離子反應(yīng),鐵離子螯合在內(nèi)部的空心結(jié)構(gòu)中,抑制鐵氧化反應(yīng),從而保護(hù)細(xì)胞不受鐵過(guò)量引起的氧化損害;而且亞鐵氧化中心能利用Fenton反應(yīng)的反應(yīng)物阻止自由基的產(chǎn)生,所以認(rèn)為鐵蛋白具有抗氧化功能[39]。

在正常的生長(zhǎng)條件下,植物鐵蛋白天然積累在一些低光合活性的組織中,它們主要在植物的發(fā)育過(guò)程和植物對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)性中起作用。在逆境脅迫條件下,植物光合作用中產(chǎn)生的氧自由基及金屬離子(主要是鐵離子)催化的Fenton反應(yīng)是氧自由基的主要來(lái)源,植物鐵蛋白通過(guò)貯藏過(guò)量的鐵,降低植物體細(xì)胞內(nèi)自由鐵離子濃度,從而減少氧自由基的產(chǎn)生,降低氧自由基帶來(lái)的損害[1]。

3 植物鐵蛋白基因的克隆、表達(dá)調(diào)控及轉(zhuǎn)化

3.1 植物鐵蛋白基因的克隆

Hyde等[13]于1963年第1次報(bào)道鐵蛋白以來(lái),植物鐵蛋白的研究取得了迅速發(fā)展,目前國(guó)內(nèi)外已分別從多種植物中克隆出鐵蛋白基因的完整cDNA序列[40-45](表1)。

3.2 植物鐵蛋白基因的表達(dá)調(diào)控

鐵蛋白在動(dòng)物體中定位于胞質(zhì)中,而在植物體定位在質(zhì)體中[30]。在單子葉和雙子葉植物中已經(jīng)克隆到一些編碼鐵蛋白的cDNA序列。Van Wuytswinkel和Briat[46]認(rèn)為植物鐵蛋白亞基首先合成一種前體物質(zhì),其N(xiāo)-端具有超過(guò)70個(gè)氨基酸殘基的獨(dú)特序列。它由兩部分組成,第一部分約為40個(gè)氨基酸殘基的運(yùn)輸肽(transit peptide,TP),負(fù)責(zé)質(zhì)體定位,并在進(jìn)入細(xì)胞器后被剪切掉了;另一部分為突出肽(extension peptide,EP)序列,是植物特有的序列,約有30個(gè)氨基酸殘基,位于成熟鐵蛋白N-端,可能是體外蛋白質(zhì)穩(wěn)定性調(diào)控的一個(gè)重要決定因素。植物鐵蛋白的突出肽,含有一段α-螺旋,位于蛋白質(zhì)外殼的外表面,靠近可能參與鐵蛋白和其環(huán)境之間進(jìn)行鐵交換的通道。在體外鐵交換的過(guò)程中,這個(gè)突出肽是自由基裂解的位點(diǎn),并且在體內(nèi)可能導(dǎo)致鐵蛋白的降解。突變體分析確認(rèn)突出肽在維持鐵蛋白的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性中有作用[47]。

表1 植物中已注冊(cè)的鐵蛋白基因[40-45]Table 1 Gene of ferritin in plant registered in GeneBank

動(dòng)物細(xì)胞中,對(duì)鐵發(fā)生反應(yīng)的鐵蛋白調(diào)控主要發(fā)生在翻譯水平上[48],而植物鐵蛋白基因的調(diào)控多數(shù)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平(或轉(zhuǎn)錄后水平)[47]。Wei和Elizabeth[48]通過(guò)啟動(dòng)子刪除,發(fā)現(xiàn)在大豆葉中鐵蛋白啟動(dòng)子上游序列-304～-218 bp的86 bp是非常必需的,稱(chēng)之為鐵調(diào)控元件(iron regulatory element,IRE),控制由鐵介導(dǎo)的鐵蛋白基因去阻遏作用。且IRE和其他任何已知啟動(dòng)子或者IRE之間沒(méi)有序列同源性,對(duì)環(huán)境刺激顯示出很強(qiáng)的專(zhuān)一性,只有鐵離子對(duì)鐵蛋白表達(dá)具有影響,鹽脅迫、干旱和H2O2都不起作用。Wicks和Entsch[49]在二倍體豇豆的葉片中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)編碼鐵蛋白的基因,每個(gè)基因都有特定的氨基酸序列并編碼一個(gè)蛋白質(zhì)亞基。關(guān)于鐵蛋白的表達(dá)調(diào)控問(wèn)題,已有研究表明,鐵在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上直接調(diào)節(jié)著鐵蛋白的合成[50]。植物中部分調(diào)節(jié)作用是通過(guò)傳導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)的,例如,在玉米中,這種調(diào)控有2條不同的途徑:一是植物激素ABA參與控制基因的表達(dá),二是通過(guò)鐵和還原信號(hào)來(lái)調(diào)控,在低鐵濃度下并有氧化劑如H2O2的參與,并受抗氧化劑的抑制[51,52]。

植物鐵蛋白在細(xì)胞內(nèi)由一個(gè)小的基因家族編碼合成[53]。Jean-Michel等[16]報(bào)道擬南芥的4種鐵蛋白基因,其中AtFer1和AtFer3的mRNA含量在鐵誘導(dǎo)下迅速增加,而AtFer2對(duì)鐵誘導(dǎo)無(wú)任何反應(yīng),是由于在AtFer1的5′-UTR區(qū)有15 bp的cis調(diào)控元件。AtFer2是種子中僅有的一種鐵蛋白,其他3種在營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá),而在種子中未見(jiàn)表達(dá)。Fobis等[18]克隆出了玉米鐵蛋白的基因ZmFer1和ZmFer2,2個(gè)基因均由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成,且位置相同,但兩者3′端非翻譯區(qū)和轉(zhuǎn)錄起始區(qū)及啟動(dòng)子序列有差異,而且也分別受不同的途徑調(diào)控。鐵誘導(dǎo)鐵蛋白mRNA的積累是短暫的,在葉中較多,而在根中受鐵的影響,則較葉片小。其他一些因素如外源激素和環(huán)境脅迫等也誘導(dǎo)鐵蛋白基因的表達(dá)。而Goto等[54]認(rèn)為,由于鐵蛋白基因是以基因家族的形式存在,則可能存在一類(lèi)獨(dú)特的鐵蛋白,此種蛋白除了能夠結(jié)合鐵以外,還可以較為容易地結(jié)合其他重金屬元素。用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi),可以培育出能耐重金屬脅迫的植株,這為利用轉(zhuǎn)鐵蛋白基因植物凈化土壤和水,從而整治環(huán)境污染提供了可能。

3.3 植物鐵蛋白基因的遺傳轉(zhuǎn)化

Goto等[54-56]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo),將大豆鐵蛋白cDNA分別轉(zhuǎn)入水稻、萵苣(Lactuca sativa)、煙草中發(fā)現(xiàn):轉(zhuǎn)入水稻后,在水稻特異性種子存儲(chǔ)蛋白谷蛋白啟動(dòng)子GluB-1控制下,只在谷粒中富集鐵,其他部位中的鐵含量則與正常植株沒(méi)多大差異,且發(fā)現(xiàn)含鐵量是對(duì)照的1.2～1.7倍。據(jù)此,他們認(rèn)為,這與GluB-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)鐵蛋白的表達(dá)模式有關(guān)。并估計(jì)這可以滿足30%～50%成年人每天對(duì)鐵的需求;由35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)入萵苣后,轉(zhuǎn)基因植物的生長(zhǎng)速度也比野生型的快許多,其鮮重比對(duì)照高出27%～42%,且發(fā)現(xiàn)鐵含量明顯提高;而通過(guò)CaMV35S啟動(dòng)子將大豆鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入煙草,其營(yíng)養(yǎng)組織中鐵含量提高30%～40%。

為了提高水稻種子中的鐵含量和增強(qiáng)鐵的生物利用效率,Lucca等[57]也將菜豆鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入水稻,同時(shí)將曲霉菌(Aspergillus f umigatus)抗熱植酸酶引入水稻胚乳,且使富含半胱氨酸的內(nèi)源金屬硫蛋白類(lèi)似蛋白(metallothionein-like protein)過(guò)量表達(dá),發(fā)現(xiàn)水稻種子中鐵含量提高了2倍,鐵吸收的抑制劑植酸也很容易被降解,并且過(guò)量的半胱氨酸還能迅速結(jié)合鐵離子,提高鐵的吸收。Georgia等[58]將從大豆中分離的cDNA序列導(dǎo)入水稻和小麥后,再用玉米組成型啟動(dòng)子泛素-1表達(dá),電感耦合氬等離子體光譜法(inductively coupled argon plasma spectrometry,ICAP)分析表明,只是在轉(zhuǎn)基因植物的營(yíng)養(yǎng)組織中鐵水平有提高。水稻葉中比小麥的高一些,其中轉(zhuǎn)基因小麥葉中鐵蛋白含量提高50%,而轉(zhuǎn)基因水稻葉中則可以高達(dá)2倍。但是在2種植物的種子中都和野生型植株中的鐵含量相差不大。徐曉暉等[19]將豌豆鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入到水稻中,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻的種子和葉片組織中鐵含量比非轉(zhuǎn)基因株系的鐵含量均有所提高,其中部分株系種子中鐵含量比未轉(zhuǎn)基因株系提高了2.3倍。

Van wuytswinkel等[50]用CaMV35S啟動(dòng)子將大豆鐵蛋白基因?qū)霟煵莺?發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因煙草中鐵蛋白過(guò)量表達(dá),根中鐵還原酶活性提高2～5倍,葉片中鐵含量增加2～3倍。同時(shí)伴隨鐵吸收的提高,植物對(duì)鐵的儲(chǔ)存能力也相應(yīng)增加,對(duì)由除草劑百草枯引起的氧化脅迫的抗性也增強(qiáng)[31]。Deak等[17]將紫花苜蓿鐵蛋白基因?qū)霟煵?獲得的轉(zhuǎn)基因煙草具有抵抗由氧化劑如百草枯等引起的氧化脅迫作用的能力,同時(shí)還具有抗病毒如煙草壞死病毒(tobacco necrosis virus)、三出交鏈孢(Alternaria alteoate)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的抗性。轉(zhuǎn)基因煙草植株由于葉片中積累了鐵蛋白,在過(guò)量鐵或百草枯處理引起的自由基毒害時(shí),還能維持光合作用功能,并對(duì)病毒引起的壞死和真菌的感染表現(xiàn)出耐性,蛋白質(zhì)通過(guò)截獲細(xì)胞中鐵,而阻止鐵參與Fenton反應(yīng),從而保護(hù)細(xì)胞免受因環(huán)境脅迫導(dǎo)致的細(xì)胞氧化性損傷。

蔬菜也是人類(lèi)重要的食品,提高蔬菜中的鐵含量對(duì)防御鐵營(yíng)養(yǎng)缺乏癥和提高小麥、水稻籽實(shí)的含鐵量一樣具有重要意義。菠菜(Spinaciaoleracea)以含鐵量豐富而備受歡迎,但其草酸的含量非常高,草酸和鈣結(jié)合可以引起腎結(jié)石,抑制鐵的吸收[59],所以發(fā)現(xiàn)一種新的含鐵量豐富的蔬菜十分必要。2002年,日本科學(xué)家成功地將大豆的鐵蛋白基因轉(zhuǎn)入萵苣(又稱(chēng)生菜)細(xì)胞中,培育開(kāi)發(fā)了可預(yù)防貧血癥的轉(zhuǎn)基因生菜,其鐵含量比一般生菜品種高出約1倍,達(dá)370～380 μg/g,這種轉(zhuǎn)基因生菜增強(qiáng)了葉子貯存鐵分子的能力,有利于吸收鐵元素[60]。

隨著近年來(lái)的研究,植物鐵蛋白轉(zhuǎn)基因研究取得了一定的進(jìn)展,Beard等[61]于1996年用鐵結(jié)合蛋白和大豆等食物治療鼠的鐵缺乏癥,結(jié)果認(rèn)為使用孟德?tīng)柡蜕锛夹g(shù)途徑提高大豆和其他種子中鐵結(jié)合蛋白的表達(dá)和種子鐵的其他可溶性成分將有助于全球性缺鐵問(wèn)題的有效解決。Murray Kolb等[62]證明用鐵蛋白轉(zhuǎn)基因的水稻飼養(yǎng)小鼠產(chǎn)生的功效與用FeSO4喂養(yǎng)具有相同的功效,兩者都可防治貧血,說(shuō)明采用生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)外源鐵蛋白基因在植物中表達(dá),提高自然種子中鐵結(jié)合蛋白的含量,是一條可持續(xù)解決或緩解全球鐵營(yíng)養(yǎng)缺乏的途徑。

4 結(jié)語(yǔ)

植物中鐵蛋白是植物貯存鐵的主要形式,而且是生物體獲取鐵的主要來(lái)源,而提高生物體中的含鐵量,對(duì)加強(qiáng)鐵的補(bǔ)給及維持鐵平衡有重要意義。鐵蛋白作為貯存鐵原子、調(diào)控鐵生物功能、維持鐵平衡以及作為一種重要的脅迫反應(yīng)蛋白,具有抗氧化功能,在植物發(fā)育中起重要作用。

目前,對(duì)于鐵蛋白在植物生理中所起的作用仍然知之不多,很多有關(guān)鐵蛋白在植物發(fā)育過(guò)程中的作用關(guān)系仍有待于深入研究。對(duì)植物不同發(fā)育階段鐵蛋白家族的各類(lèi)成員進(jìn)行表達(dá)分析,是研究和確定這些蛋白在植物生理學(xué)中所起作用的必要手段。另外,鐵的儲(chǔ)存機(jī)制和利用鐵蛋白基因表達(dá)清除氧化脅迫的機(jī)制,仍然不十分清楚。鐵蛋白結(jié)合鐵的操縱機(jī)制也許能提供一種阻止氧化傷害,增強(qiáng)植物對(duì)脅迫耐受性,減輕病害引起損失的新方法。值得引起注意的是:外源轉(zhuǎn)鐵蛋白和植物體內(nèi)源鐵蛋白是否可以形成異源多聚體,這種異源多聚體是否具有功能,尚需進(jìn)一步研究[57]。

抗逆基因工程主要集中在逆境條件下表達(dá)的某些基因和抗逆代謝過(guò)程中某些酶的研究,其分離、克隆和轉(zhuǎn)化一直是國(guó)內(nèi)外科學(xué)家研究的熱點(diǎn),植物抗逆性是十分復(fù)雜的性狀,一般由多基因調(diào)控[63,64]。逆境會(huì)引起植物基因表達(dá)發(fā)生改變,關(guān)閉一些正常表達(dá)的基因,啟動(dòng)一些與逆境相適應(yīng)的基因,目前,對(duì)某些逆境誘導(dǎo)蛋白的生化功能缺乏了解[65]。因此,植物鐵蛋白作為一種脅迫反應(yīng)蛋白,需要更深入的研究其逆境條件下的生理生化特性,并期待可以通過(guò)最新的基因工程、作物育種技術(shù),培育新的抗性作物等,進(jìn)一步證實(shí)鐵蛋白生理功能及其關(guān)系,加強(qiáng)對(duì)植物鐵蛋白的研究、應(yīng)用及推廣。

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