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        流式細(xì)胞儀分選純化人脂肪干細(xì)胞體外成骨活性的實(shí)驗(yàn)研究

        2010-03-27 03:37:47李俊憲孫恒赟袁捷趙明衍韋敏
        組織工程與重建外科雜志 2010年6期
        關(guān)鍵詞:骨組織成骨定量

        李俊憲 孫恒赟 袁捷 趙明衍 韋敏

        流式細(xì)胞儀分選純化人脂肪干細(xì)胞體外成骨活性的實(shí)驗(yàn)研究

        李俊憲 孫恒赟 袁捷 趙明衍 韋敏

        目的利用流式細(xì)胞儀分選人脂肪干細(xì)胞(Human adipose-derived stem cells,hADSCs)并檢測(cè)其體外成骨活性。方法分離hADSCs,通過流式細(xì)胞儀以CD105作為表面標(biāo)志進(jìn)行分選,所得細(xì)胞成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),以CD105-細(xì)胞、未分選細(xì)胞作為對(duì)照。2周后進(jìn)行堿性磷酸酶(AKP)和骨鈣蛋白(OCN)定量PCR和Western-blot檢測(cè)。結(jié)果流式細(xì)胞分選所得CD105+hADSCs細(xì)胞約占單核細(xì)胞的50%。定量PCR和Western-blot檢測(cè)均顯示分選hADSCs成骨誘導(dǎo)后,AKP和OCN的表達(dá)均顯著高于CD105-細(xì)胞組及未分選細(xì)胞組(P<0.05)。結(jié)論誘導(dǎo)分選純化后的hADSCs有較好的成骨活性,可作為骨組織工程的種子細(xì)胞。

        脂肪干細(xì)胞 堿性磷酸酶 骨鈣蛋白

        目前,組織工程技術(shù)在骨缺損修復(fù)中已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)具有能大量擴(kuò)增,誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)可穩(wěn)定向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并且獲取時(shí)對(duì)機(jī)體損傷小等特點(diǎn),被認(rèn)為是修復(fù)骨缺損較理想的種子細(xì)胞[1]。

        近年來的研究發(fā)現(xiàn),脂肪干細(xì)胞(ADSCs)同樣可以在體外大量擴(kuò)增,具有多向分化潛能,且獲取容易,獲取量大,患者極易接受,已成為當(dāng)前種子細(xì)胞研究的新熱點(diǎn)[2]。ADSCs作為種子細(xì)胞可修復(fù)鼠顱骨、腭骨缺損[3-4];ADSCs中成骨分化細(xì)胞相對(duì)不純,影響了修復(fù)長(zhǎng)骨缺損效果[5]。所以,我們需要進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行純化。有文獻(xiàn)報(bào)道通過免疫磁珠分選出CD105+細(xì)胞,其增殖活性較強(qiáng),且植入體內(nèi)可良好成骨[6]。因此,本研究旨在采用CD105作為表面標(biāo)志流式細(xì)胞分選ADSCs,并體外誘導(dǎo)后檢測(cè)其成骨活性表達(dá)情況,為進(jìn)一步構(gòu)建可承力組織工程骨提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        人腹部脂肪顆粒來自20~30歲行脂肪抽吸術(shù)女性(n=6);地塞米松、β-磷酸甘油鈉和2-磷酸抗壞血酸(Sigma公司)。 培養(yǎng)皿、離心管(Falcon公司)。超聲勻漿機(jī)(Sonics&Materials公司)。DU-640紫外分光光度計(jì)及流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司)。CD105熒光標(biāo)記抗體(BD公司)。定量PCR檢測(cè)相關(guān)試劑(Invitrogen和Promega公司),熒光定量PCR儀為Applied Biosystems 7000 Real Time PCR System。Western-blot檢測(cè)相關(guān)抗體(SANT CRUZE公司)。電泳儀、垂直電泳槽、半干轉(zhuǎn)膜儀(BIO-RAD公司)。凝膠成像儀為TANON GIS-2008。

        1.2 實(shí)驗(yàn)方法

        人腹部脂肪顆粒獲取后以PBS清洗,0.1%膠原酶消化分離出單核細(xì)胞,以4×104cells/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿中,加入DMEM培養(yǎng)液,置 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)4~5 d后,0.25%胰蛋白酶消化,制備成單細(xì)胞懸液,300 g離心 5 min,去上清,加入含4%FBS的PBS,加入CD105抗體,4℃30 min,再離心去上清,用含4%FBS的PBS洗2遍,流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞分選,分選出CD105+hADSCs。CD105+hADSCs和CD105-hADSCs,以及未分選的hADSCs均以4×104cells/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿中,加含有地塞米松 (10 nmol/L)、β磷酸甘油鈉(2.16 g/L)和2-磷酸抗壞血酸(37.5 mg/L)的DMEM成骨條件培養(yǎng)液,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),培養(yǎng)2周后進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。

        1.2.2 定量PCR檢測(cè)

        分別取上述3組細(xì)胞(n=6),以0.25%胰蛋白酶消化,制備成單細(xì)胞懸液,對(duì)AKP和OCN表達(dá)情況進(jìn)行定量PCR檢測(cè)。AKP引物:上游序列 5-GGAAGGAGGCAGAATTGACCA-3;下游序列5-GCCATACAGGATGGCAGTGAA-3。OCN引物:上游序列5-AAAGGTGCAGCCTTTGTGTCC-3;下游序列5-ACTCGTCACAGTCCGGATTGAG-3。

        首先抽提總RNA,隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),所用總RNA量為2 μg,反應(yīng)總體積為20 μL體系。在65℃水浴處理5 min,室溫放置10 min,高速(高于5 000 g)離心5 sec。隨后按下列順序在1.5 mL離心管中加入下列反應(yīng)物 (加入之后總體積為20 μL):RNA酶抑制劑(50 U/μL)0.5 μL,5×buffer(Promega)4 μL,dNTP MIX(10 mM/each)2 μL,DTT 2 μL,MMLV(200 U/μL)1 μL。水浴37℃下反應(yīng)1 h,90℃處理5~10 min,冰浴5 min,高速離心5 sec。

        隨后進(jìn)行熒光定量PCR,為20 μL體系置入定量PCR儀反應(yīng),并預(yù)制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

        1.2.3 Western-blot檢測(cè)

        分別在上述3組細(xì)胞 (n=6)中加入PBS溶液200 μL,同時(shí)加入適當(dāng)濃度的蛋白抑制劑PMSF,冰上超聲波處理至組織完全分散,離心,然后測(cè)定蛋白含量。將樣品稀釋至相同總蛋白含量,取150 μL樣品加入5×SDS上樣buffer 20 μL,95℃處理10 min。每上樣孔加樣30 μL。隨后按下述步驟對(duì)AKP和OCN表達(dá)情況進(jìn)行Western-blot檢測(cè)。

        首先進(jìn)行SDS-PAGE電泳,待跑出分離膠后再進(jìn)行 Western-Blot。小心將膠放入 100 mL陰極buffer,平衡15 min;用尺子量膠的大小,剪同樣大小的一片PVDF膜,用甲醇(100%)浸泡15 sec,再用雙蒸水浸泡2 min,取出用陽極bufferII平衡10 min;隨后以半干法轉(zhuǎn)膜:按順序放膠、膜和濾紙,插上電源,1.2 mA/cm2轉(zhuǎn)膜1 h;轉(zhuǎn)膜完成后,將膜與膠及濾紙小心剝離,將膜放入甲醇中10 sec,用鑷子取出置于濾紙上,待甲醇蒸干(約15 min);用麗春紅溶液檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效率,再用去離子水洗去麗春紅;將膜在一抗中孵育2 h或4℃過夜 (一抗溶于封閉液,1∶200稀釋);用TTBS洗3次,每次輕搖 10 min;在二抗(1∶2 000,用封閉液稀釋)中孵育1 h;用TTBS洗3次,每次輕搖10 min;用DBA溶液顯色;當(dāng)顯色達(dá)到需要時(shí),用水洗膜以終止反應(yīng);膜用TANON GIS-2008凝膠成像儀拍照并用天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用平均密度×凈面積進(jìn)行比較 (即各組蛋白電泳條帶平均密度×凈面積/各自對(duì)應(yīng) β-actin蛋白電泳條帶平均密度×凈面所得比值)。

        素養(yǎng)考查分析:該題以立體幾何為知識(shí)載體,考查學(xué)生對(duì)“面面垂直”的判定定理、直線與平面所成角等幾何學(xué)科知識(shí)的掌握,要求學(xué)生根據(jù)平面圖形進(jìn)行空間想象,結(jié)合已知條件進(jìn)行邏輯推理,書寫完整的幾何證明過程,并進(jìn)行相關(guān)計(jì)算.

        1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,所測(cè)數(shù)據(jù)采用方差分析,組間采用Student-Newman-kewls方法進(jìn)行比較。P<0.05認(rèn)為有顯著性差別,統(tǒng)計(jì)軟件包為SAS Ver.6.12。

        2 結(jié)果

        2.1 流式細(xì)胞儀分選

        流式細(xì)胞儀以CD105作為表面標(biāo)志陽性,分選出具有成骨分化潛能的hADSCs,其比例約占單核細(xì)胞的50%,進(jìn)一步流式細(xì)胞儀驗(yàn)證其CD105+純度可達(dá)80%,體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后生長(zhǎng)良好,形成鈣結(jié)節(jié),較未分選細(xì)胞組好(圖1)。

        圖1 流式細(xì)胞儀分選

        圖3 Real-time PCR各組擴(kuò)增平均拷貝數(shù)

        2.3 Western-blot檢測(cè)

        AKP和OCN的比值均為CD105+hADSCs組最高 (分別為3.21±0.25和3.82±0.52),CD105-hADSCs組最低 (分別為0.47±0.13和0.90±0.24),未分選hADSCs組(分別為1.42±0.15和2.13±0.43)介于兩者之間,CCD105+hADSCs組與其他兩對(duì)照組間AKP和OCN蛋白表達(dá)均有顯著性差異(P<0.05)(圖4)。

        2.2 定量PCR檢測(cè)

        AKP和OCN表達(dá)均是CD105+hADSCs組最高,CD105-hADSCs組最低,未分選hADSCs組介于兩者之間,CD105+hADSCs組與其他兩對(duì)照組間均有顯著性差異(P<0.05)(圖2,3)。

        圖4 Western-blot檢測(cè)結(jié)果

        圖2 Real-time PCR所有樣品擴(kuò)增曲線

        3 討論

        BMSCs作為骨組織工程的種子細(xì)胞,其體外成骨活性已獲肯定。我們的前期研究已采用BMSCs復(fù)合珊瑚及磷酸三鈣構(gòu)建骨組織,成功修復(fù)了羊股骨節(jié)段缺損和犬下頜骨節(jié)段缺損[7-9]。但是,人體的骨髓量有限,而且骨髓還是造血干細(xì)胞的來源之一,過量抽取骨髓可能對(duì)人體健康產(chǎn)生影響[10]。為此,我們還需尋找一種來源更為廣泛、獲取量更多且更易獲取的種子細(xì)胞。

        ADSCs是近來的研究熱點(diǎn),但有報(bào)道稱ADSCs復(fù)合纖維膠修復(fù)兔部分脛骨缺損效果明顯差于BMSCs和骨膜細(xì)胞組,并認(rèn)為BMSCs和骨膜中的間充質(zhì)干細(xì)胞成骨活性更穩(wěn)定均一,而ADSCs中成骨分化細(xì)胞相對(duì)不純,影響了長(zhǎng)骨缺損的修復(fù)效果[5]。同樣,我們?cè)谝宰泽wADSCs復(fù)合珊瑚修復(fù)犬標(biāo)準(zhǔn)顱骨缺損時(shí),也發(fā)現(xiàn)缺損修復(fù)面積差別較大 (76%~90%),ADSCs中成骨種子細(xì)胞不純,使成骨速率無法配合材料降解可能是原因之一[11]。當(dāng)然,通過基因轉(zhuǎn)染成骨蛋白(BMPs)可使ADSCs穩(wěn)定表達(dá)成骨活性,并修復(fù)骨缺損[12-13],但轉(zhuǎn)基因載體(尤其是常用效率較高的腺病毒載體)對(duì)機(jī)體健康影響的爭(zhēng)議較大,所以轉(zhuǎn)基因細(xì)胞修飾與臨床應(yīng)用仍有一定距離。

        Zuk等[10]認(rèn)為,ADSCs中包含多能干細(xì)胞和專向干細(xì)胞,這提示我們可考慮如何分選出ADSCs中具有成骨傾向的干細(xì)胞(包括多能干細(xì)胞,成骨專向干細(xì)胞)來作為骨組織工程的種子細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道,通過免疫磁珠分選出 CD105+BMSCs細(xì)胞,其增殖活性較強(qiáng),且植入體內(nèi)后成骨良好[6]。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中采用 CD105作為表面標(biāo)志流式細(xì)胞分選出CD105+hADSCs,其比例約占單核細(xì)胞的50%左右,而進(jìn)一步流式細(xì)胞儀驗(yàn)證其CD105+純度可達(dá)80%,經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后,通過定量檢測(cè)AKP和OCN的表達(dá),證實(shí)其體外成骨活性明顯強(qiáng)于CD105-hADSCs和未分選hADSCs,為進(jìn)一步構(gòu)建組織工程骨修復(fù)承重部位的骨缺損提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

        由于采用流式細(xì)胞分選對(duì)細(xì)胞損傷相對(duì)較大,我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)過程中有部分細(xì)胞破碎。因此,如果需要構(gòu)建大塊的骨組織,細(xì)胞量可能尚有不足。下一步實(shí)驗(yàn)可考慮采用免疫磁珠分選的方法,在保持分選純度無明顯下降的情況下提升細(xì)胞的活力,以滿足大塊骨組織構(gòu)建的需要。

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        Osteogenesis Ability of Purified hADSCs Through Flow Cytometry Sorting in Vitro

        LI Junxian1, SUN Hengyun2,YUAN Jie3,ZHAO Minyan3,WEI Min3

        1 Department of Oral and Maxillofacial Surgery,Shanxi Province People′s Hospital,Shanxi 030012,China;2 Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China;3 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:YUAN Jie.

        Objective To explore the osteogenesis ability of purified hADSCs through flow cytometry sorting in vitro. Methods hADSCs were isolated and separated through flow cytometry using CD105 as surface marker.These cells were cultured in osteogenic-induced medium,CD105-hADSCs and non-seperated hADSCs were served as control groups.The cells were examined for alkaline phosphatase(AKP)and osteocalcin(OCN)by real-time PCR and western-blot after 2 weeks culture.Results The percentage of CD105+hADSCs in monocytes was about 50%through flow cytometry sorting.Real-time PCR and western-blot both revealed the AKP and OCN activity of CD105+hADSCs were significantly higher than CD105-hADSCs and non-seperated hADSCs after 2 weeks osteogenic-induction(P<0.05).Conclusion The hADSCs purified have good osteogenesis ability and could be the seeding cells for bone engineering.

        Adipose-derived stem cells; Alkaline phosphatase; Osteocalcin

        Q813.1+1

        A

        1673-0364(2010)06-0311-04

        2010年9月9日,

        2010年10月23日)

        10.3969/j.issn.1673-0364.2010.06.003

        上海市教育委員會(huì)自然科學(xué)類科研創(chuàng)新項(xiàng)目(08YZ49)

        030012山西省太原市 山西省人民醫(yī)院口腔外科(李俊憲);200011上海市 上海組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 (孫恒赟);200011上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科(袁捷,趙明衍,韋敏)。

        袁捷。

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