黃洪勇，王金寶，李恒芬，錢(qián)東麗#，師天元，郭新勝（.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，新鄉(xiāng)市45300；.河南省生物精神病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新鄉(xiāng)市 45300）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為抑郁癥的發(fā)病與遺傳因素、神經(jīng)遞質(zhì)、軀體、心理和性別等因素有關(guān)[1，2]。米氮平（Mirtazapine，MTZ）為全球首個(gè)去甲腎上腺素能和特異性5-羥色胺能抑制劑，具有獨(dú)特的雙重抗抑郁藥理學(xué)特性，有起效快、療效確切、耐受性好、無(wú)抗膽堿能作用等優(yōu)點(diǎn)，目前己廣泛應(yīng)用于臨床[3，4]。國(guó)外曾以監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)米氮平的血藥濃度來(lái)指導(dǎo)臨床用藥、預(yù)警不良反應(yīng)和規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)[5]。本試驗(yàn)建立了反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測(cè)定人血漿中米氮平的濃度，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相色譜儀系統(tǒng)，包括G1311A自動(dòng)調(diào)配泵、G1316A可調(diào)柱溫恒溫箱、G1322A在線(xiàn)脫氣、色譜化學(xué)工作站（美國(guó)Agilent公司）；XT-120A電子分析天平（瑞士Precisa公司）；LXJ-Ⅱ離心沉淀機(jī)（上海醫(yī)分儀器制造有限公司）。

1.2 試藥

米氮平對(duì)照品（無(wú)錫華裕生物制藥有限公司，批號(hào):080428，含量:99.6%）；內(nèi)標(biāo):氯氮平對(duì)照品（美國(guó)Sigma公司，批號(hào):010K1204）；甲醇為色譜純，正丁胺、乙酸乙酯、乙醚為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱:美國(guó)Diamonsil?（250 mm×4.6 mm，5 μm）C18反相柱；柱溫:25 ℃；流動(dòng)相:甲醇-0.3%正丁胺溶液（80∶20）；流速:1.0 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng):292 nm；進(jìn)樣量:20 μL。 在該色譜條件下，色譜峰與血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)峰很好分離，無(wú)干擾峰出現(xiàn)，米氮平和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間分別為6.59、8.07 min，主峰米氮平的有效塔板數(shù)應(yīng)在9 500以上，分離度7.3，拖尾因子1.04。高效液相色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的制備

取米氮平對(duì)照品約10 mg，準(zhǔn)確稱(chēng)定，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，即得。于冰箱4℃保存?zhèn)溆茫R用前用甲醇稀釋成所需濃度。另同法制備出濃度為10 μg·mL－1氯氮平的甲醇溶液為內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 血漿樣品處理

取400 μL含藥血漿加至10 mL具塞錐形玻璃離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，渦旋振蕩1 min，加入提取劑乙酸乙酯-乙醚（1∶1）1 mL，渦旋振蕩提取2 min，4 000 r·min－1離心10 min，取上層提取液置于一干燥具塞尖底試管中，再加入1 mL上述提取劑，同法操作。振蕩混合2次提取液，40℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶后，4 000 r·min－1離心10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線(xiàn)性關(guān)系考察:取空白血漿300 μL共8份，分別加入不同濃度的米氮平對(duì)照品溶液100 μL，使血漿中藥物濃度分別為0.1、0.2、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、20.0 μg·mL－1，振蕩混勻，然后按“2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜。以米氮平血藥濃度（X）對(duì)米氮平峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y＝0.267X+0.031（r＝0.999 9，n＝8），結(jié)果表明，米氮平血藥濃度在0.1～20.0 μg·mL－1范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好。當(dāng)信噪比（S/N）＝3時(shí)，最低檢測(cè)限為0.05 μg·mL－1。

2.4.2 方法回收率及精密度試驗(yàn):取空白血漿3份，分別制備成濃度各為1.0、4.0、16.0 μg·mL－1的米氮平血漿對(duì)照品溶液，然后按“2.3”項(xiàng)下方法處理。每種濃度日內(nèi)平行測(cè)定5次，3種濃度隔日測(cè)定1次，各5次。分別計(jì)算日內(nèi)、日間精密度，并根據(jù)同一天內(nèi)低、中、高3種濃度血漿對(duì)照品測(cè)定結(jié)果計(jì)算相對(duì)回收率；另制備濃度各為1.0、4.0、16.0 μg·mL－1對(duì)照品溶液并分別進(jìn)樣5次，以此為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算米氮平的絕對(duì)回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision test（n＝5）

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn):各制備低、中、高（1.0、4.0、16.0 μg·mL－1）3種濃度的米氮平血漿樣品，于－20℃冰箱保存，分別在0、5、10、15、20 d時(shí)取出于37.5℃水浴融化后，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，測(cè)定濃度。結(jié)果濃度變化的RSD＝4.85%，表明米氮平在血漿中至少放置20 d穩(wěn)定。

2.4.4 患者血樣含量測(cè)定:取患者上肢靜脈血5 mL，取出血漿，平行處理3份（編號(hào):MTZ-1、MTZ-2、MTZ-3），避光低溫保存至測(cè)定。患者的血樣測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 患者的血樣測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of the determination of plasma sample of patients（n＝3）

由表2可以看出，RP-HPLC法測(cè)定血漿中米氮平的濃度，重復(fù)性比較好，RSD值均＜2%。

3 討論

筆者曾結(jié)合文獻(xiàn)[6，7]，系統(tǒng)比較了乙醚與乙酸乙酯的提取效率，發(fā)現(xiàn)二者相差不大，但乙酸乙酯作為提取劑非常不易揮散，氮?dú)獯蹈奢^難。本試驗(yàn)選用了復(fù)合提取劑，既保持了較高的提取效率，又減少了工作量。

抑郁癥患者在藥物治療上大多聯(lián)用了一些情緒穩(wěn)定劑（如卡馬西平）、鎮(zhèn)靜劑（如地西泮），因此，這些物質(zhì)不易作為內(nèi)標(biāo)的首選。本試驗(yàn)選用了抑郁癥患者不常聯(lián)用的氯氮平作為內(nèi)標(biāo)，避免了患者血樣本身對(duì)分析過(guò)程的影響，擴(kuò)大了方法現(xiàn)實(shí)應(yīng)用中的范圍。

在有關(guān)米氮平含量的體內(nèi)分析方法中，熒光檢測(cè)法和毛細(xì)管電泳法樣品前處理復(fù)雜[8，9]、液相色譜-單四極桿質(zhì)譜法儀器昂貴[10]、其他高效液相色譜法則分析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)[6]，均遠(yuǎn)不能適應(yīng)人體內(nèi)米氮平的快速、準(zhǔn)確分析。本試驗(yàn)采用的RP-HPLC法具有樣品前處理簡(jiǎn)單、分析儀器普及率高、簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，適用于米氮平的臨床藥動(dòng)學(xué)研究和不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

（致謝:本研究在河南省生物精神病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院）完成）

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