郝 杰，張長(zhǎng)虹，曹學(xué)麗*

(北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京市植物資源研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048)

七種谷物麩皮中的酚酸類成分分析

郝 杰，張長(zhǎng)虹，曹學(xué)麗*

(北京工商大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京市植物資源研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048)

利用反相高效液相色譜法(RP-HPLC)測(cè)定7種不同種類及品種的谷物麩皮中8種酚酸類成分的含量，并利用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)的方法對(duì)不同種類谷物、各類酚酸及總酚酸含量間的差異性進(jìn)行分析。分析結(jié)果表明：所分析谷物種類所含酚酸的含量順序?yàn)橛衩祝拘←湥臼w麥＞燕麥，谷物麩皮中酚酸主要以束縛型酚酸形式存在，且肉桂酸類酚酸含量明顯大于苯甲酸類酚酸，游離型及可溶共價(jià)結(jié)合型酚酸中4-羥基苯甲酸、香草酸含量較高；而在束縛型酚酸中阿魏酸的含量在各類谷物中均最高，玉米品種中可達(dá)到6527.86μg/g麩皮。

谷物麩皮；酚酸；高效液相色譜

酚酸是酚類物質(zhì)中的一類，約占植物源食品中酚類化合物的1/3，多為苯甲酸和肉桂酸的羥化衍生物，許多研究結(jié)果證明其具有良好的保健功能[1]。植物源酚酸主要以游離和束縛的形式存在，束縛的酚酸通常以酯鍵、醚鍵與許多化合物連接在一起[2]。常見的酚酸分為羥化肉桂酸和羥化苯甲酸。羥化肉桂酸衍生物主要有香豆酸、咖啡酸和阿魏酸，它們通常與奎尼酸或葡萄糖酯化存在于食物中，羥化肉桂酸中羧烯基團(tuán)(—CH=CH—COOH)的存在是其具有顯著抗氧化性的關(guān)鍵所在[3]；而羥化的苯甲酸衍生物中最常見的有對(duì)羥基苯甲酸、香草酸和原兒茶酸，主要以配糖物的形式存在食物中[4]。

麩皮是谷物加工的主要副產(chǎn)物，僅小麥麩皮來說，我國(guó)每年出產(chǎn)的小麥麥麩在2000萬噸以上，目前主要用作飼料，經(jīng)濟(jì)利用價(jià)值低[5]。以往的研究中，人們多把注意力放在對(duì)谷物麩皮中游離型酚酸的研究，而麩皮中的游離型酚酸相對(duì)于蔬菜水果來說，含量是極少的，因此只著重研究水果蔬菜中的酚酸物質(zhì)，而忽略了谷物麩皮的價(jià)值。近年來，國(guó)外陸續(xù)有人發(fā)現(xiàn)谷物麩皮中含有大量具有強(qiáng)抗氧化活性的植物活性物質(zhì)，包括有酚酸、類胡蘿卜素、木酚素、V E等[6]。谷物麩皮中的酚酸絕大多數(shù)以束縛型酚酸的形式存在，這些酚酸與細(xì)胞壁相結(jié)合，因此主要作用于下消化道，經(jīng)酶解釋放出生物活性物質(zhì)，可以預(yù)防結(jié)腸癌等慢性疾病[7]。因此，谷物麩皮的利用價(jià)值急劇上升，美國(guó)膳食營(yíng)養(yǎng)學(xué)家也把谷物麩皮放在膳食營(yíng)養(yǎng)金字塔的最底端，提倡全谷物食品的攝入量應(yīng)達(dá)到每天3次，每次約100g[6]。

國(guó)外學(xué)者也開始對(duì)谷物麩皮中的酚酸進(jìn)行分品種的研究[8-11]。Oufnac等研究了在不同溶劑條件(甲醇、丙

酮、正己烷)下以及采用微波輔助提取法時(shí)，小麥麩皮中酚類化合物的提取率及抗氧化活性的不同。結(jié)果表明，采用甲醇溶劑和微波輔助時(shí)提取率要高于其他溶劑，達(dá)到467.5μg/g麩皮。Zhou等對(duì)稻米中的酚酸的分布進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在未去殼的糙米中，阿魏酸含量達(dá)到255～362μg/g谷物，香豆酸70～152μg/g谷物，均遠(yuǎn)大于去殼之后的精制米。在總酚酸含量中束縛型酚酸占總量的80%～90%。Sylvester等通過對(duì)硬質(zhì)小麥的抗氧化性研究表明，小麥麩皮中存在的酚酸類成分，包括羥基苯甲酸、龍膽酸、咖啡酸、香草酸、綠原酸、丁香酸、香豆酸和阿魏酸，是其抗氧化活性的關(guān)鍵。

本實(shí)驗(yàn)選取4個(gè)種類(小麥、玉米、蕎麥、燕麥) 7個(gè)品種的麩皮樣品，將其中的酚酸成分按其存在形式分為游離型、可溶共價(jià)結(jié)合型、束縛型3部分，利用高效液相色譜對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，并用數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)方法對(duì)不同種類、不同品種、不同酚酸之間的含量差異進(jìn)行分析比較，尋找酚酸物質(zhì)在谷物麩皮中的存在規(guī)律，對(duì)麩皮的資源開發(fā)進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥樣品主要品種：魯麥13號(hào)(產(chǎn)地山東泰安縣)；中優(yōu)206(產(chǎn)地山西太谷縣)；京9843(北京通州區(qū))。玉米主要品種：魯?shù)?81(產(chǎn)地山東泰安縣)；鑫豐甜糯80(產(chǎn)地山西太谷縣)。定96-1甜蕎(產(chǎn)地吉林鎮(zhèn)賚縣)。壩莜九號(hào)：由河北高寒作物研究所提供。

4-羥基苯甲酸(4-hydroxybenzoic acid)、4-羥基苯乙酸(4-hydroxyphenylacetic acid)、4-羥基苯甲醛(4-hydroxybenzaldehyde)、香草酸(vanillic acid)、丁香酸(syringic acid)、香豆酸(coumanic acid)、阿魏酸(ferulic acid)、肉桂酸(cinnamic acid)(純度均大于95%) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；正己烷、無水乙醚、乙酸(均為分析純)；甲醇(色譜純) 美國(guó)Fisher Scientific公司；超純水(電導(dǎo)率18mΩ/cm) 自制。

1.2 儀器與設(shè)備

1100高效液相色譜系統(tǒng)[配有四元梯度泵、在線脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列紫外檢測(cè)器和Chemstation Rev A.09.01(1206)色譜工作站] 美國(guó)安捷倫科技有限公司；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-B9循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酚酸的提取

1.3.1.1 樣品的預(yù)處理

所有7種麩皮樣品分別經(jīng)粉碎后，取顆粒直徑為250～380μm之間的部分，以料液比1:20(m/V)正己烷脫脂，攪拌1 h，抽濾后殘?jiān)覝叵玛幐伞?/p>

1.3.1.2 游離型酚酸提取方法

取0.5g脫脂麩皮用20mL 80%的甲醇浸提，室溫條件下攪拌3次，各次分別為1.5、1、0.5h。濾液混合濃縮至10mL，用HCl溶液調(diào)至pH2，用10mL的乙醚萃取3次，有機(jī)相混合后用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干，用2mL的色譜純的甲醇復(fù)溶，得到游離型酚酸(FPA)，濾渣于60℃條件下真空干燥。

1.3.1.3 可溶共價(jià)結(jié)合型酚酸提取方法

上述萃取后的水相用2mol/L的NaOH溶液調(diào)至pH7，用5mL 2mol/L的NaOH溶液堿解4h，用6mol/L的鹽酸調(diào)pH2，用10mL乙醚萃取3次，有機(jī)相用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干后，用2mL甲醇復(fù)溶，得到堿解可溶共價(jià)結(jié)合型酚酸(BHPA)，水相用5mL 6mol/L的HCl溶液在沸水中酸解30min，冷卻后用10mL乙醚萃取3次，有機(jī)相用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干后，用2mL甲醇復(fù)溶，得到酸解可溶共價(jià)結(jié)合型酚酸(AHPA)。

1.3.1.4 束縛型酚酸提取方法

真空干燥后濾渣稱重，取50mg，用4mL 2mol/L的NaOH溶液堿解18h，于室溫條件下4000r/min離心15min，上清液調(diào)pH2，用無水乙醚萃取3次，有機(jī)相混合后用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干后，用2mL甲醇復(fù)溶，得到堿解束縛型酚酸(BBPA)。殘?jiān)?mL 6mol/L的HCl溶液于沸水中酸解1h，冷卻后室溫條件下4000r/min離心15min，上清液用10mL乙醚萃取3次，有機(jī)相混合用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸干后，用2mL甲醇復(fù)溶，得到酸解束縛型酚酸(ABPA)。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Luna 5u phenyl-hexyl(250mm ×4.6mm，5μm)配有Phenomenex SecurityGuard KL0-4282 (4.0mm×2.0mm，5μm)；柱溫30℃；流動(dòng)相：B為含有體積分?jǐn)?shù)2%乙酸的水，C為甲醇；洗脫程序：0～25min，C為5%～30%；25～35min，C為30%～50%；35～45min，C為50%～100%；45～55min，C為100%；55～60min，C為100%～5%；60～70min，C為5%；進(jìn)樣量10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；進(jìn)樣前樣品均用0.45μm微孔濾膜過濾。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確配制一定質(zhì)量濃度(表1中最高檢測(cè)質(zhì)量濃度)8種酚酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品，并分別梯度稀釋到1/2、1/5、1/10、1/20、1/50、1/100，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，進(jìn)樣量10μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以測(cè)定得到的峰面積為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，分別繪制8種酚酸樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有樣品從粗樣提取開始做3組平行實(shí)驗(yàn)。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件的單因素方差分析(one-way ANOVA)和Turkey多重比較法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(α＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品工作曲線的繪制

圖1 標(biāo)準(zhǔn)混合樣品液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed 8 PA standards

將所購得標(biāo)準(zhǔn)樣品按一定質(zhì)量濃度溶于甲醇中，制得8種標(biāo)準(zhǔn)樣品的混合標(biāo)樣，使用前述方法進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，確定其保留時(shí)間及分離效果。所得標(biāo)準(zhǔn)樣品的液相色譜圖如圖1所示。將8種標(biāo)準(zhǔn)樣品按一定稀釋倍數(shù)稀釋，繪制工作曲線，所得到工作曲線的檢測(cè)范圍及相關(guān)系數(shù)列于表1中。

表1 8種標(biāo)準(zhǔn)樣品的檢測(cè)范圍及相關(guān)性系數(shù)Table 1 Linear concentration ranges and correlation coefficients of 8 PAs

表2 7種谷物麩皮游離型酚酸含量Table 2 Contents of free species of 8 PAs in different varieties of cereal branμg/g麩皮

表3 7種谷物麩皮可溶共價(jià)結(jié)合型酚酸含量Table 3 Contents of soluble covalent species of 8 PAs in different varieties of cereal bran μg/g麩皮

2.2 谷物麩皮中游離型酚酸含量的比較

由表2可知，從酚酸種類上來看，香草酸在禾本科植物的游離型酚酸中均有存在(蕎麥為蓼科)，阿魏酸

在除鑫豐甜糯80之外的每一品種中均有分布。丁香酸在小麥品種的游離型部分中普遍存在，而在玉米品種中香豆酸的分布要大于其他品種谷物。4-羥基苯乙酸在7中谷物的FPA部分中均沒有分布。對(duì)于雜糧中燕麥，其游離型部分的酚酸成分比較復(fù)雜，除4-羥基苯乙酸之外均有存在。而蕎麥中只有4-羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸。

另外，從所測(cè)得的酚酸含量上看，小麥及燕麥品種中，香草酸、阿魏酸的含量均大于其余酚酸，是其FPA部分的主要酚酸。蕎麥中阿魏酸為主。而玉米中生長(zhǎng)于較濕潤(rùn)山東地區(qū)的魯?shù)?81中阿魏酸及肉桂酸的含量均高于生長(zhǎng)于干燥地區(qū)的鑫豐甜糯80，說明生長(zhǎng)地域的環(huán)境因素對(duì)其酚酸的含量及種類分布可能有影響。

2.3 可溶共價(jià)結(jié)合型酚酸的比較

可溶共價(jià)結(jié)合型酚酸包括BHPA及AHPA兩部分。由表3可知，一方面，從種類上，與FPA部分測(cè)定的結(jié)果相同，4-羥基苯乙酸除在魯麥13號(hào)及中優(yōu)206小麥中微量存在之外，在各類谷物中均沒有分布。而香草酸同樣在禾本科植物中存在。而丁香酸在玉米可溶共價(jià)結(jié)合型中也有分布，并非只存在于小麥中。從堿解與酸解的部分上來看，4-羥基苯甲酸在玉米樣品中只存在于酸解AHPA部分；4-羥基苯甲醛分布于禾本科植物的BHPA部分；香豆酸只分布于BHPA部分，酸解部分中沒有分布。

另一方面，酚酸含量上，香草酸在酸解AHPA的分布遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于堿解BHPA部分，例如在中優(yōu)206小麥中，AHPA中香草酸含量為587.23μg/g麩皮，而在BHPA中，只有18.66μg/g麩皮。香草酸是小麥、玉米、燕麥等禾本科品種可溶共價(jià)結(jié)合部分中含量最高的酚酸種類，兩部分總和可達(dá)到97.02～605.89μg/g麩皮，而蓼科的蕎麥中以4-羥基苯甲酸為主，但含量不高。4-羥基苯甲酸、丁香酸、阿魏酸、肉桂酸雖在各品種均有較廣分布，但含量均不高，分別為4-羥基苯甲酸18.96～69.11μg/g麩皮、丁香酸21.35～36.13μg/g麩皮、阿魏酸19.72～93.90μg/g麩皮、肉桂酸3.87～19.77μg/g麩皮。這使得在游離型酚酸中，苯甲酸衍生物的含量大于肉桂酸衍生物。

2.4 谷物麩皮中束縛型酚酸含量的比較

表4為束縛型酚酸的測(cè)定結(jié)果。從總體來看，束縛型部分中酚酸的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于游離型和可溶共價(jià)結(jié)合型部分。禾本科谷物阿魏酸的含量相當(dāng)高，達(dá)到961.1～6527.86μg/g麩皮，小麥品種中阿魏酸含量1160.60～2038.12μg/g麩皮，而在玉米品種中阿魏酸含量高達(dá)6159.48～6527.86μg/g麩皮。同時(shí)，阿魏酸主要存在于堿解的BBPA部分。在玉米品種中，香草酸及香豆酸依然有較高含量，分別為333.21～1488.72μg/g麩皮及432.41～452.99μg/g麩皮。肉桂酸在各品種中均有檢出，這與可溶共價(jià)結(jié)合型的情況相同，含量48.43～307.79μg/g麩皮。

在束縛型酚酸中，肉桂酸衍生物的含量高于苯甲酸衍生物。含量最高的5種酚酸為阿魏酸1160.60～2038.12 μg/g麩皮、香草酸57.62～1488.72μg/g麩皮、香豆酸94.40～452.99μg/g麩皮、4-羥基苯甲酸67.14～392.09 μg/g麩皮、肉桂酸48.43～307.79μg/g麩皮。

2.5 總酚酸含量的對(duì)比

從圖2可以看出，不同品種的谷物麩皮酚酸含量差異顯著。含量在1316.37～9378.98μg/g麩皮。魯?shù)?81玉米中酚酸含量達(dá)到9378.98μg/g麩皮，而在定96-1甜蕎中只有1316.37μg/g麩皮?？傮w來說，各品種酚酸含量大小順序?yàn)橛衩祝拘←湥狙帑湥臼w麥。束縛型酚酸的含量在總酚酸含量中顯著高于其他部分，達(dá)到71.54%～95.63%。

表4 7種谷物麩皮束縛型酚酸含量Table 4 Contents of bound species of 8 PAs in different varieties of cereal branμg/g麩皮

圖2 7種谷物樣品的各部分酚酸總含量的比較Fig.2 Comparisons of total contents of 3 respective species of 8 PAs in different varieties of cereal bran

3 結(jié)論與討論

在對(duì)谷物麩皮中酚酸含量的測(cè)定中，測(cè)得所含酚酸含量由高到低的順序?yàn)橛衩?、小麥、燕麥、蕎麥；且束縛型酚酸是谷物麩皮中酚酸的主要存在形式；阿魏酸的含量顯著高于其他酚酸。這與Adom等[12]及Verma等[13]得到研究的到的結(jié)論相同。而在實(shí)驗(yàn)組中，同一品種的不同樣品之間表現(xiàn)出含量差異，這可能與實(shí)驗(yàn)材料的生長(zhǎng)環(huán)境因素，成熟度有關(guān)。

同時(shí)從不同部位的酚酸含量上，堿解的部分要明顯高于酸解部分，但是在某些樣品中酸解時(shí)能夠釋放堿解時(shí)所不能得到的酚酸，例如小麥樣品酸解可溶共價(jià)結(jié)合型部分中的香草酸。這說明，在具體實(shí)驗(yàn)過程中，需要根據(jù)所需酚酸種類的不同，來對(duì)酸解步驟進(jìn)行取舍。

此外，在對(duì)谷物麩皮中酚酸的釋放量上，本實(shí)驗(yàn)得到小麥麩皮中的阿魏酸含量(1160.60～2038.12μg/g麩皮)要略低于王萍等[14](3080μg/g麩皮)及王金等[15](2580 μg/g麩皮)測(cè)定的值；玉米麩皮中的阿魏酸含量(6159.48～6527.86μg/g麩皮)也低于羅艷鈴等[16](14892μg/g麩皮)的報(bào)道結(jié)果。這可能與處理方法、樣品種類、成熟度、干燥方式等有關(guān)。

[1]張東明. 酚酸化學(xué)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2009.

[2]XU G H, YE X Q, CHEN J C, et al. Effect of heat treatment on the phenolic compounds and antioxidant capacity of citrus peel extract[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55: 330-335.

[3]KIM K H, TSTO R, CUI S W, e t al. Pheonlic acid profiles and antioxidant activities of wheat bran extract and the effect of hydrolysis conditions[J]. Food Chemistry, 2006, 95: 466-473.

[4]HERRMANN K. Occurrence and content of hydroxycinnamic and hydroxybenzoic acid compounds in foods[J]. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1989, 28: 315-347.

[5]王旭峰, 何計(jì)國(guó), 陶純潔, 等. 小麥麩皮的功能成分及加工利用現(xiàn)狀[J]. 糧食與食品工業(yè), 2006, 13(1): 19-22.

[6]LIU Ruihai. Whole grain phytochemicals and health[J]. Journal of Cereal Science, 2007, 46: 207-219.

[7]SHAHIDI F, NACZK M. Phenolics in food and nutraceuticals[M]. 2nd ed. NewYork: CRC Press, 2003.

[8]OUFNAC D S, XU Zhimin, SUN Ting, et al. Extraction of antioxidant from wheat bran using conventional solvent and microwave-assisted method[J]. Cereal Chemistry, 2007, 82(2): 125-129.

[9]ZHOU Zhongkai, ROBARDS K, HELLIWELL S, et al. The distribution of phenolic acids in rice[J]. Food Chemistry, 2004, 87: 401-406.

[10]ONYENEHO S N, HETTIARACHCHY N S. Antioxidant activity of durum wheat bran[J]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1992, 40: 1496-1500.

[11]PETERSON D M. Oat antioxidants[J]. Journal of Cereal Science, 2001, 39(1): 115-129.

[12]ADOM K K, SORRELLS M E, LIU Ruihai. Phytochemical profiles and antioxidant activity of wheat varieties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003, 51: 7825-7834.

[13]VERMA B, HUCL P, CHIBBAR R N. Phenolic content and antioxidant properties of bran in 51 wheat culitvars[J]. Cereal Chem, 2008, 85 (4): 544-549.

[14]王萍, 葛麗花, 宋林平. 小麥麩皮阿魏酸的制備[J]. 糧油加工與食品機(jī)械, 2006(5): 68-70.

[15]王金, 吳向陽, 陳榮華, 等. 堿解小麥麥麩制備阿魏酸的工藝條件研究[J]. 食品科技, 2008(4): 107-109.

[16]羅艷玲, 歐仕益. 堿解玉米皮制備阿魏酸的研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2007, 7(5): 97-101.

RP-HPLC Analysis of Phenolic Acids in Different Varieties of Cereal Bran

HAO Jie，ZHANG Chang-hong，CAO Xue-li*
(Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, College of Chemical and Environmental Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

Eight phenolic acids (PAs) in different varieties of cereal bran including 3 wheat cultivars, 2 corn cultivars, 1 oat cultivar and 1 buckwheat cultivar were determined by the developed RP-HPLC method. Meanwhile, the differences in the contents of each PA and total PAs among the cereal bran materials were statistically analyzed. Results showed that the total PA contents in different varieties of cereal bran decreased in the following order: corn＞wheat＞buckwheat＞oat. Bound PAs were the predominant PAs in the 4 varieties of cereal bran, of which, cinnamic acid exhibited a much higher content than benzoic acid. Of free and soluble covalent PAs, 4-hydroxybenzoic and vanilla acids both exhibited a higher content. Of bound PAs, the highest content of ferulic acid was observed in all the varieties of cereal bran and reached up to 6527.86 μ g/g corn bran.

cereal bran；phenolic acid；reversed-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC)

O625.54

A

1002-6630(2010)10-0263-05

2009-08-05

郝杰(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锓蛛x工程。E-mail：crab_susu@yahoo.com.cn

*通信作者：曹學(xué)麗(1967—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)樯锓蛛x技術(shù)。E-mail：caoxl@th.btbu.edu.cn