徐懷德，秦盛華

(西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

超聲波輔助提取光皮木瓜多糖及其體外抗氧化性研究

徐懷德，秦盛華

(西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

通過單因素以及正交試驗研究超聲波輔助提取光皮木瓜多糖的最佳工藝及其體外抗氧化性。結(jié)果表明：超聲波輔助提取光皮木瓜多糖的最佳提取條件為料液比1:45(g/mL)、提取溫度80℃、提取時間40min，超聲波功率600W，在此條件下多糖的提取率為12.072%。光皮木瓜多糖對NO2、DPPH·以及·OH清除作用明顯，具有較好的還原力，表明光皮木瓜多糖有較好的抗氧化活性。

光皮木瓜；多糖；超聲波輔助提?。惑w外抗氧化

Abstract：The optimal conditions for the ultrasonic-assisted extraction of polysaccharides from Chaenomeles sinensis (Thouin)Koehne fruits were determined by single factor and orthogonal array design methods. Besides, the in vitro antioxidant activity of the extracted polysaccharides was evaluated. Results showed that the optimal values of extraction conditions leading to a maximum polysaccharide yield of 12.072% were as follows: ultrasonic power 600 W, material/liquid ratio 1:45 (g/mL), and extraction temperature 80 ℃ for an extraction duration of 40 min. The fact that Chaenomeles sinensis (Thouin) Koehne fruit polysaccharides exhibited strong scavenging effects against nitrate, DPPH· and hydroxyl free radicals and excellent reducing power, demonstrates good in vitro antioxidant activity of the polysaccharides.

Key words：Chaenomeles sinensis (Thouin) Koehne；polysaccharides；ultrasonic-assisted extraction；antioxidant activity in vitro

光皮木瓜[Chaenomeles Sinensis (Thouin) Koehne ]系薔薇科木瓜屬植物，別名冥楂。原產(chǎn)我國，距今已有2500多年的栽培歷史。由于其果實肉厚清脆，味甘酸芳，營養(yǎng)豐富，是多種食品的重要原料。另外，光皮木瓜含有豐富的有機酸、多糖、氨基酸、甾體類化合物、黃酮、三萜及其苷類等化合物[1-4]，具有抗炎、抗病菌、抗衰老、抗腫瘤等功效，是醫(yī)藥工業(yè)的重要原料[5]。我國有大面積的木瓜種植，資源豐富，僅2008年陜西省白河縣光皮木瓜種植面積達7133hm2，年產(chǎn)量可達到11萬t多。

多糖具有廣泛的生物活性，從各種植物中都可以提取分離出多糖，近年來對植物多糖已有廣泛報道[6-8]。超聲波輔助提取多糖的過程是一種物理破碎過程，它利用空化和機械振動作用瞬間使細胞壁結(jié)構(gòu)破裂，提高了多糖的提取率，同時還能產(chǎn)生乳化、熱效應等，加速了植物有效成分的擴散。目前超聲波輔助提取技術(shù)已成功應用于龍眼多糖[9]、海帶多糖[10]、相思菇多糖[11]等的提取上。本實驗利用超聲波法輔助提取光皮木瓜多糖，并對其體外抗氧化活性進行研究，為光皮木瓜多糖的進一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

光皮木瓜采自西北農(nóng)林科技大學校園內(nèi)。

蒽酮 上?；瘜W試劑采購供應站；濃硫酸、無水乙醚、丙酮 西安化學試劑廠；無水乙醇 西安三浦精細化工廠；木瓜蛋白酶(酶活力100萬U/g) 上海藍季科技發(fā)展有限公司；正丁醇、抗壞血酸、三羥甲基氨基甲烷和葡萄糖 天津市博迪化工有限公司；氯仿 天津市耀華化學試劑有限責任公司；二苯代苦味?；杂苫?DPPH·) Sigma公司；鐵氰化鉀 天津市東麗區(qū)天大化學試劑廠；三氯化鐵 天津市雙船化學試劑廠。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DZF-OB電熱恒溫干燥箱、ZK- 828型電熱真空干燥箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；FW100型高速萬能粉碎機、DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；T-203電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；KQ600DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；B95型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；UV-1700紫外分光光度計 日本島津公司；KDC-40低速離心機 科大創(chuàng)新股份中佳分公司；RotavaporR-200型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、V-500真空泵 瑞士Buchi公司。

1.3 光皮木瓜多糖的提取方法

1.3.1 光皮木瓜預處理

光皮木瓜果實剖開去籽后切成厚約2～5mm的果片，置于60℃烘箱內(nèi)烘干，粉碎后過40目篩備用。將光皮木瓜粉末置于圓底燒瓶中，石油醚回流脫去表面脂肪，回流兩次，每次3h，抽濾，棄去溶劑，濾渣風干，濾渣即為經(jīng)過預處理的光皮木瓜粉末。

1.3.2 光皮木瓜多糖的提取

稱取適量預處理后的光皮木瓜粉末，按一定的料液比(光皮木瓜粉末:水，g/mL)、提取溫度、提取時間、超聲波功率在超聲波中輔助提取數(shù)次，冷卻后減壓過濾，去除濾渣，合并濾液。

1.3.3 光皮木瓜粗多糖制備

將合并的濾液減壓濃縮至一定體積，加入4倍量的95%乙醇，放置于4℃冰箱中，醇沉24h，4000r/min離心，棄去上清液，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，真空干燥后得粗多糖樣品粉末。

1.3.4 脫蛋白

采用木瓜蛋白酶-Sevag法。將上述粗多糖樣品粉末加水復溶，向其中加入木瓜蛋白酶，使其質(zhì)量濃度為0.1g/100mL，60℃酶解3h，再向其中加入Sevag試劑(氯仿:正丁醇的體積比1:4)，混合物劇烈振蕩20min后離心，小心取出上層多糖溶液，棄去下層有機相和中間層蛋白質(zhì)沉淀，重復多次直至無蛋白質(zhì)沉淀為止。為了避免pH值的調(diào)節(jié)影響多糖的生理活性，酶解過程不調(diào)pH值。

將脫蛋白后的多糖溶液按照1.3.3節(jié)中的方法沉淀多糖，得到光皮木瓜多糖。

1.4 光皮木瓜多糖提取率測定

1.4.1 多糖含量的測定

采用蒽酮-硫酸比色法測定[12]。

蒽酮-硫酸溶液的配制：精密稱取0.200g蒽酮，緩慢加入濃硫酸完全溶解后轉(zhuǎn)移至100mL棕色容量瓶中定容，得2.000mg/mL蒽酮-硫酸溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

標準曲線的制備：精密稱取105℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖對照品10mg，加100mL蒸餾水溶解，定容，制成0.1mg/mL葡萄糖標準溶液。分別吸取此溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL帶塞試管中，蒸餾水定容至2mL處，加入5mL現(xiàn)配的蒽酮-硫酸溶液，充分搖勻放置10min，于620nm波長處測定吸光度。用最小二乘法得到線性回歸方程：y=40.583x+0.0041，r=0.9996。

1.4.2 多糖提取率計算公式

1.5 超聲波法提取光皮木瓜多糖最佳工藝條件優(yōu)化

首先確定提取次數(shù)，再選取料液比、提取溫度、提取時間、超聲波功率作為影響光皮木瓜多糖提取率的研究對象。對每個因素進行6個水平單因素試驗，在單因素試驗基礎(chǔ)上進行正交試驗，選擇最佳提取工藝條件，并對正交試驗得出的最優(yōu)工藝進行驗證試驗。

1.6 光皮木瓜多糖的體外抗氧化性能的測定

將1.3.4節(jié)中的光皮木瓜多糖配制成不同濃度的多糖溶液，研究其體外抗氧化能力。

1.6.1 DPPH·清除能力測定[13]

取不同質(zhì)量濃度的樣品提取液4mL，加入1mL用無水乙醇配制的DPPH·溶液，并使DPPH·終濃度為0.8mmol/L。用力振搖混勻后置暗室中靜置30min，于517nm波長處測定吸光度。按下式計算DPPH·清除率。

式中：Ax為加入樣品溶液和DPPH·后的吸光度；Ax0為樣品溶液本底的吸光度；A0為DPPH·和蒸餾水的吸光度。

1.6.2 亞硝基清除能力測定

分別吸取5mg/L的NaNO2標準液2.0mL于25mL比色管中，分別加入3mL樣品提取液，常溫下反應30min，然后分別加入0.4%對氨基苯磺酸溶液1.0mL，搖勻靜置5min，再分別加入0.2%鹽酸萘乙二胺溶液0.5mL，用水稀釋至刻度，搖勻靜置15min后于538nm波長處測定吸光度。按下式計算亞硝基清除率。

式中：A＇0為不加提取液時NaNO2吸光度；A＇x為加入提取液后NaNO2的吸光度；A＇x0為不加NaNO2時樣品的吸光度。

1.6.3 羥自由基清除率測定[14-15]

利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉· OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510nm波長處有最大吸收。反應體系中含8.8mmol/L H2O21mL、9mmol/L FeSO41mL、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液1mL、不同濃度的樣品溶液1mL。最后加H2O2啟動反應，37℃反應0.5h，以蒸餾水為參比，在510nm波長處測定各濃度的吸光度。考慮到樣品本身的吸光度，以9mmol/L FeSO41mL、9mmol/L水楊酸-乙醇溶液1mL、不同濃度的樣品溶液1mL和1mL蒸餾水作為樣品的本底吸收值。按下式計算·OH清除率。

式中：A＂0為空白對照液的吸光度；A＂x為加入樣品溶液后的吸光度；A＂x0為不加顯色劑H2O2樣品溶液本底的吸光度。

1.6.4 還原能力測定[16]

取不同質(zhì)量濃度的樣品提取液1mL，加入0.2mol/L pH6.6的磷酸緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各2.5mL并混合均勻，混合液50℃保溫20min后，加入2.5mL 10%三氯乙酸終止反應。吸取此溶液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL 0.1% FeCl3，混合均勻，30min后于700nm波長處測定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波法輔助提取光皮木瓜多糖提取次數(shù)的確定

稱取3g光皮木瓜粉末，以料液比1:45、提取溫度70℃、超聲波功率600W、提取時間30min，重復操作4次，測定不同提取次數(shù)對多糖提取率的影響，結(jié)果見表1。

表1 浸提次數(shù)對多糖提取率的影響Table 1 Effect of extraction times on polysaccharide yield

由表1可以看出，超聲波提取光皮木瓜多糖提取一次基本就可以將絕大部分多糖提取出來，綜合考慮產(chǎn)率、能耗等因素，以后試驗均提取一次。

2.2 超聲波輔助提取光皮木瓜多糖單因素試驗

2.2.1 超聲波功率對光皮木瓜多糖提取率的影響

分別精確稱取1g光皮木瓜粉末，以1:40的料液比加入蒸餾水，置于溫度70℃，功率分別為300、360、420、480、540、600W的超聲波清洗器中，提取30min，過濾，取上清液測定多糖含量，比較不同的超聲波功率對多糖提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 超聲波功率對光皮木瓜多糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on polysaccharide yield

由圖1可知，隨著超聲波輸出功率的增加，光皮木瓜多糖的提取率升高。超聲波可以提高光皮木瓜多糖的提取率，當超聲波輸出功率大于540W時，多糖提取率增加不顯著，故選擇超聲波提取功率為540W。

2.2.2 料液比對光皮木瓜多糖提取率的影響

圖2 料液比對光皮木瓜多糖提取率的影響Fig.2 Effect of material/liquid ratio on polysaccharide yield

分別精確稱取1g光皮木瓜粉末，采用料液比分別為1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45，置于溫度70℃、功率540W的超聲波清洗器中，提取30min，過濾，取上清液測定多糖含量，比較不同的料液比對多糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，光皮木瓜多糖的提取率在相同的提取條件下隨料液比的增加而逐漸增大，由數(shù)據(jù)分析可知，料液比為1:40、1:45時光皮木瓜多糖提取率之間無較大差異，而明顯高于料液比1:35時光皮木瓜多糖的提取率，由于提取液在后續(xù)工序中需經(jīng)濃縮，綜合考慮原料和效能，宜選擇料液比1:40。

2.2.3 提取溫度對光皮木瓜多糖提取率的影響

分別精確稱取1g光皮木瓜粉末，以1:40的料液比加入蒸餾水，置于功率540W，溫度分別為30、40、50、60、70、80℃的超聲波清洗器中，提取30min，過濾，取上清液測定多糖含量，比較不同的提取溫度對多糖提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 提取溫度對光皮木瓜多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on polysaccharide yield

由圖3可知，在30～80℃溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，多糖提取率呈上升趨勢，溫度達到70℃時，多糖提取率與80℃無顯著差異，考慮到能耗，故選擇70℃作為提取溫度。

2.2.4 提取時間對光皮木瓜多糖提取率的影響

圖4 提取時間對光皮木瓜多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on polysaccharide yield

分別精密稱取1g光皮木瓜粉末，以1:40的料液比加入蒸餾水，置于功率540W，溫度70℃的超聲波清洗器中，分別提取10、20、30、40、50、60min，過濾，取上清液測定多糖含量，比較不同的超聲波輔助提取時間對多糖提取率的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，多糖提取率在40min之前增加較為顯著，隨后上升緩慢，進一步延長超聲波輔助提取時間至60min，多糖提取率增加不顯著。超聲波輔助提取40min時光皮木瓜多糖提取率顯著高于30min，略低于50min，為縮短工時、減少能耗，多糖提取時間以40min為宜。

2.3 超聲波輔助提取光皮木瓜多糖正交試驗結(jié)果分析

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal array design matrix and corresponding experimental values of polysaccharide yield

由表2可知，影響超聲波輔助提取光皮木瓜多糖提取率的因素主次順序為提取溫度＞料液比＞提取時間＞功率，最佳工藝為料液比1:45、提取溫度80℃、提取時間40min、超聲波功率600W。進行3次驗證實驗，結(jié)果如表3所示，多糖的提取率平均為12.072%，說明最佳工藝條件具有良好的重現(xiàn)性。

表3 驗證實驗結(jié)果(n=3)Table 3 Results of 3 replicate validation experiments for optimized extraction conditions (n=3)

2.4 光皮木瓜多糖的體外抗氧化結(jié)果

2.4.1 光皮木瓜多糖對DPPH·清除作用

圖5 光皮木瓜多糖及VC對DPPH·的清除效果Fig.5 Comparison of DPPH· free radical scavenging capacity between Chaenomeles sinensis (Thouin) Koehne fruit polysaccharides and VC

由圖5可以看出，在質(zhì)量濃度0.1～0.5mg/mL范圍內(nèi)光皮木瓜多糖和VC對DPPH·清除率迅速增加，之后隨著質(zhì)量濃度增加基本上沒有變化。在質(zhì)量濃度小于1.0mg/mL時，光皮木瓜多糖對DPPH·清除率小于VC，而后則大于VC。多糖質(zhì)量濃度為8mg/mL時，光皮木瓜多糖對DPPH·清除率可達到74.68%，高于同質(zhì)量濃度下VC的DPPH·清除率。

2.4.2 光皮木瓜多糖對NO2－清除作用

圖6 光皮木瓜多糖及VC對亞硝基的清除效果Fig.6 Comparison of nitrate free radical scavenging capacity between Chaenomeles sinensis (Thouin) Koehne fruit polysaccharides and VC

由圖6可以看出，VC在質(zhì)量濃度0.1～1.0mg/mL時對NO2－清除率增加較快。在低質(zhì)量濃度條件下，光皮木瓜多糖對NO2－的清除作用較弱，但隨著質(zhì)量濃度的增大，光皮木瓜多糖對NO2－清除作用也明顯增強。在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，光皮木瓜多糖對NO2－的最大清除率為75.02%。

2.4.3 光皮木瓜多糖對·OH清除作用

·OH是已知的最強氧化劑，幾乎能和所有的細胞成分發(fā)生反應，且反應速度很快。利用Fenton反應產(chǎn)生·OH，水楊酸法檢測羥基及物質(zhì)清除·OH的能力。在此法中，·OH進攻水楊酸分子的苯環(huán)，產(chǎn)生能用分光光度法測量的羥基化合物2,3-二羥基苯甲酸，于是，可用該產(chǎn)物生成的多少來描述羥基的量及待測物質(zhì)清除·OH的能力。

圖7 光皮木瓜多糖及VC對·OH的清除效果Fig.7 Comparison of hydroxyl radical scavenging capacity between Chaenomeles sinensis (Thouin) Koehne fruit polysaccharides and VC

由圖7可以看出，在實驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度升高，VC在質(zhì)量濃度0.1～0.5mg/mL時對·OH清除率增加較快，最大清除率接近100%。光皮木瓜多糖對·OH清除率呈上升趨勢，但清除率明顯低于VC，最大清除率可達68.37%。

2.4.4 光皮木瓜多糖的還原能力

具有還原力的物質(zhì)是通過提供氫原子來破壞自由基反應鏈，從而達到抗氧化的目的[17]。根據(jù)1.6.4節(jié)的測定方法，在波長700nm處測定的吸光度越大，則表明樣品的還原能力越強。

圖8 光皮木瓜多糖及VC的還原能力Fig.8 Comparison of reducing power between Chaenomeles sinensis (Thouin) Koehne fruit polysaccharides and VC

由圖8可知，在質(zhì)量濃度0.1～0.5mg/mL范圍內(nèi)，光皮木瓜多糖的還原力增加迅速，隨后趨于穩(wěn)定，但其還原能力明顯低于VC。

3 討論與結(jié)論

超聲波輔助提取光皮木瓜多糖影響因素的主次順序為提取溫度＞料液比＞提取時間＞功率，最佳提取條件為料液比1:45、提取溫度80℃、提取時間40min，超聲波功率600W。在此條件下，進行3 次重復驗證實驗的平均提取率為12.072%。在實際生產(chǎn)中，每4kg鮮木瓜可以得到1kg木瓜干，可以計算出，每1kg鮮光皮木瓜果實能夠得到30.18g木瓜多糖。

光皮木瓜多糖的體外抗氧化實驗結(jié)果表明，光皮木瓜多糖對NO2－、DPPH·以及·OH清除作用明顯，具有較好的還原力。且隨著質(zhì)量濃度的升高而升高。光皮木瓜多糖與VC的體外抗氧化活性比較結(jié)果表明，光皮木瓜多糖的體外抗氧化活性低于VC。多糖結(jié)構(gòu)中的醇羥基可與產(chǎn)生·OH等自由基所必需的金屬離子(如Fe2+、Cu2+等)絡(luò)合，使自由基的產(chǎn)生受到抑制，進而影響脂質(zhì)過氧化的啟動，最終抑制活性氧的產(chǎn)生[18-19]，多糖可以捕捉脂質(zhì)過氧化鏈式反應中產(chǎn)生的活性氧，減少脂質(zhì)過氧化反應鏈長度，阻斷或減緩脂質(zhì)過氧化的進行。對于·OH而言，多糖碳氫鏈上的氫原子可以與其結(jié)合成水，達到清除·OH的目的，而多糖的碳原子則因此成為碳自由基，并進一步氧化形成過氧自由基，最后分解成對機體無害的產(chǎn)物；對于O2·，多糖可與其發(fā)生氧化反應，達到清除的目的[20-23]。

光皮木瓜多糖的抗氧化性可能是其增強機體免疫力、降血糖、抗腫瘤、抗衰老等其他功能特性的作用機理之一，但是目前對于其抗氧化性能的研究還停留在表面階段，有待進一步的深入研究，為光皮木瓜的開發(fā)利用和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支持。

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Ultrasonic-assisted Extraction and in vitro Antioxidant Activity Evaluation of Polysaccharides from Chaenomeles sinensis (Thouin) Koehne

XU Huai-de，QIN Sheng-hua
(College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China)

O636.1

A

1002-6630(2010)10-0106-06

2009-07-16

陜西省陜南突破發(fā)展基金項目(2006ZKC(二)-04-34)

徐懷德(1964—)，男，副教授，主要從事軟飲料、果品蔬菜貯藏與加工和天然產(chǎn)物提取研究。E-mail：xuhuaide@sohu.com