劉珊珊，周 正，周 巍，張子德，馬俊蓮,*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050051)

酸度計(jì)法快速檢測(cè)牛奶中殘留的β-內(nèi)酰胺酶

劉珊珊1，周 正2，周 巍2，張子德1，馬俊蓮1,*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050051)

為了快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)牛奶制品中殘留的β-內(nèi)酰胺酶的含量，利用β-內(nèi)酰胺酶分解青霉素產(chǎn)酸使牛奶pH值下降的原理，對(duì)人工添加了β-內(nèi)酰胺酶的牛奶制品與青霉素反應(yīng)后pH值的下降規(guī)律進(jìn)行研究。得到牛奶中殘留的β-內(nèi)酰胺酶與青霉素反應(yīng)的較適宜條件，從而獲得快速檢測(cè)牛奶制品中殘留的β-內(nèi)酰胺酶的方法。結(jié)果確定牛奶制品中殘留的β-內(nèi)酰胺酶與青霉素反應(yīng)的適宜條件為溫度33℃、底物質(zhì)量濃度10mg/mL，檢測(cè)時(shí)間僅為60min。此方法對(duì)液態(tài)純牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的最低檢出限為8.92U/mL。

p H值；β-內(nèi)酰胺酶；牛奶；青霉素；檢測(cè)

隨著國(guó)家對(duì)食品安全問題的關(guān)注和部分乳制品企業(yè)無抗奶目標(biāo)的提出，抗生素殘留問題成為影響乳制品安全的重要因素之一[1]。目前，青霉素作為β-內(nèi)酰胺類藥物是治療牛乳腺炎的首選藥物，是牛奶中最常見的殘留抗生素[2]。由于國(guó)內(nèi)多數(shù)乳品企業(yè)對(duì)抗生素殘留超標(biāo)的牛乳采取降價(jià)收購(gòu)的原則，出于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng)，一些不法奶站為了謀求自己的經(jīng)濟(jì)利益，人為使用一些生物制劑降解牛乳中殘留的抗生素，生產(chǎn)人造“無抗奶”。

經(jīng)初步判斷，市售解抗劑的主要成分是β-內(nèi)酰胺酶，它是由革蘭氏陽性細(xì)菌產(chǎn)生和分泌的，可選擇性分解牛奶中殘留的β-內(nèi)酰胺類抗生素[3]。β-內(nèi)酰胺酶為我國(guó)不允許使用的食品添加劑，該酶的使用掩蓋了牛奶中實(shí)際含有的抗生素。β-內(nèi)酰胺酶能夠使青霉素內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)破壞而失去活性，導(dǎo)致青霉素、頭孢菌素等抗生素類藥物耐藥性增高，從而大大降低了人們抵抗傳染病的能力，給消費(fèi)者的身體健康帶來危害[4]。因此，確立針對(duì)這種人造“無抗奶”的相應(yīng)檢測(cè)方法、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，從源頭上監(jiān)測(cè)、把控原奶質(zhì)量具有十分重要的意義。目前，β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)方法有間接高效液相色譜法、碘量法，微生物方法[5]和免疫學(xué)方法，這些方法存在處理過程相對(duì)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，不同牛奶樣品實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象差別較大，檢出限高等缺點(diǎn)。本研究擬建立采用酸度計(jì)檢測(cè)牛奶制品中β-內(nèi)酰胺酶殘留量的便捷方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

青霉素對(duì)照品(92.7%)、β-內(nèi)酰胺酶[446萬U/(mL· h)] 中國(guó)藥品生物制品檢定所；無抗奶粉(oxid，按1: 7的質(zhì)量配比還原成液態(tài)牛奶) 市購(gòu)。

Senven-Multi型pH計(jì) 美國(guó)Mettler Toledo公司；恒溫水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠；MS 3 Basic振蕩器 德國(guó)IKA公司。

1.2 方法

本實(shí)驗(yàn)的原理是在β-內(nèi)酰胺酶的作用下，青霉素被水解生成青霉噻唑酸。該酸是一種強(qiáng)酸，可電離產(chǎn)生H+，使牛奶的pH值下降。根據(jù)穩(wěn)態(tài)處理米氏方程：v＝K[E][S]/(Km+[S])[6]，式中，v為反應(yīng)速率、K為反應(yīng)速率常數(shù)、[E]為酶濃度、[S]為底物質(zhì)量濃度、Km為米氏常數(shù)。當(dāng)酶促反應(yīng)的底物質(zhì)量濃度足夠大，即[S]趨向于正無窮時(shí)，反應(yīng)速率與酶的濃度成正比，此時(shí)米氏方程變?yōu)関＝K[E][7]，這樣就可以利用酸度的變化確定酶催化過程中不同時(shí)間段的反應(yīng)速率，得到酸度變化與酶濃度的關(guān)系，從而測(cè)定酶的殘留量。

1.2.1 β-內(nèi)酰胺酶與青霉素底物在牛奶中反應(yīng)條件的確定

1.2.1.1 適宜的反應(yīng)溫度的確定

取10mL液態(tài)牛奶加入到離心管中，每管加入β-內(nèi)酰胺酶貯備液使其在奶中的終濃度為100U/mL，振蕩混合均勻，置于10～50℃恒溫水浴鍋中，每個(gè)溫度設(shè)一個(gè)空白對(duì)照。將等量青霉素同時(shí)加入到空白管和試驗(yàn)管中，使其終質(zhì)量濃度為5mg/mL，振蕩混合均勻。使酶與青霉素充分反應(yīng)，pH值不再發(fā)生變化后，計(jì)算出ΔpHr=ΔpHβ－ΔpH0，即相對(duì)pH變化值等于加入β-內(nèi)酰胺酶后的pH值變化減去空白管的pH值變化。每個(gè)溫度做3個(gè)重復(fù)，取ΔpHr的平均值，通過ΔpHr的大小篩選出適宜的反應(yīng)溫度。

1.2.1.2 適宜的反應(yīng)底物質(zhì)量濃度的確定

取10mL液態(tài)牛奶加入到離心管中，每管加入β-內(nèi)酰胺酶貯備液使其在奶中的終濃度為100U/mL，振蕩混合均勻，將奶樣置于較適宜反應(yīng)溫度的恒溫水浴鍋中，分別加入不同量的青霉素儲(chǔ)備液使其終質(zhì)量濃度從1mg/mL到15mg/mL，使酶與青霉素充分反應(yīng)，pH值不再發(fā)生變化后，測(cè)其ΔpHr。每個(gè)底物質(zhì)量濃度重復(fù)3次，取ΔpHr的平均值，篩選出較適宜的反應(yīng)底物質(zhì)量濃度。

1.2.1.3 反應(yīng)時(shí)間的確定

取10mL液態(tài)牛奶加入到離心管中，每管加入β-內(nèi)酰胺酶貯備液使其在奶中的終質(zhì)量濃度為100U/mL，振蕩混合均勻，將奶樣置于較適宜反應(yīng)溫度的恒溫水浴鍋中，每管加入適宜質(zhì)量濃度的青霉素儲(chǔ)備液，使酶與青霉素充分反應(yīng)，pH值不再發(fā)生變化后，測(cè)其ΔpHr，重復(fù)3次，取平均值篩選出較適宜的反應(yīng)時(shí)間。

1.2.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定最低檢出限

取10mL液態(tài)牛奶加入到離心管中，每管加入青霉素貯備液使其在奶中的終質(zhì)量濃度為10mg/mL，振蕩混合均勻，將奶樣置于較適宜反應(yīng)溫度的恒溫水浴鍋中，分別加入不同量的β-內(nèi)酰胺酶貯備液使其終濃度從5U/ mL到140U/mL，使酶與青霉素充分反應(yīng)，pH值不再發(fā)生變化后，測(cè)其ΔpHr。每個(gè)酶濃度重復(fù)3次取ΔpHr的平均值。得到ΔpHr與β-內(nèi)酰胺酶濃度的變化關(guān)系，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，曲線最低點(diǎn)附近做重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取平均值得到實(shí)驗(yàn)最低檢出限。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛奶中β-內(nèi)酰胺酶催化青霉素水解反應(yīng)條件的確定

2.1.1 反應(yīng)溫度的確定

圖1 溫度對(duì)酶促反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of temperature on β-lactamase decomposition of penicillin

按照1.2.1.1節(jié)的方法，得到ΔpHr隨溫度的變化曲線見圖1。酶在33℃時(shí)催化青霉素的活性最高。在10～33℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，牛奶中β-內(nèi)酰胺酶與青霉素反應(yīng)的速率逐漸增大，即β-內(nèi)酰胺酶催化青霉素水解的能力逐漸增強(qiáng)。超過33℃后，由于β-內(nèi)酰胺酶部分失活使其催化能力下降，以及青霉素在較高溫度時(shí)自身水解產(chǎn)酸的影響，ΔpHr值減小。經(jīng)過不同溫度對(duì)β-內(nèi)酰胺酶活力影響的比較，以33℃為適宜的反應(yīng)溫度。

2.1.2 反應(yīng)底物青霉素質(zhì)量濃度的確定

圖2 底物青霉素質(zhì)量濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of penicillin final concentration on itsβ-lactamase decomposition

圖2為β-內(nèi)酰胺酶終濃度為100U/mL時(shí)，33℃條件下，ΔpHr值隨底物青霉素質(zhì)量濃度變化的曲線。由圖2可知，ΔpHr值隨著青霉素質(zhì)量濃度的增大而增大，當(dāng)青霉素質(zhì)量濃度達(dá)到10mg/mL時(shí)，ΔpHr的值最大，即反應(yīng)速率最大。繼續(xù)增大青霉素質(zhì)量濃度，ΔpHr值保持基本不變。根據(jù)Michaelis-Menten原理，當(dāng)?shù)孜餄舛茸銐虼髸r(shí)，酶的催化速率與底物濃度無關(guān)。結(jié)果表明，當(dāng)酶濃度在100U/mL以內(nèi)，溫度在33℃、底物青霉素質(zhì)量濃度為10mg/mL時(shí)即為足夠大。

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間的確定

圖3 pH值隨時(shí)間的變化Fig.3 pH change during β-lactamase decomposition of penicillin observed at 10 mg/mL penicillin final concentration and 33 ℃

圖3 為33℃條件下，β-內(nèi)酰胺酶終濃度為100U/mL，底物青霉素質(zhì)量濃度為10mg/mL時(shí)，牛奶中β-內(nèi)酰胺酶催化青霉素水解體系pH值變化與時(shí)間的關(guān)系圖。由圖3可知，當(dāng)青霉素加入到含有β-內(nèi)酰胺酶的牛奶中后，pH值隨時(shí)間逐漸下降，表明青霉素被牛奶中的酶水解成青霉噻唑酸。當(dāng)反應(yīng)60min后，pH值不再下降，保持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，表明反應(yīng)已經(jīng)達(dá)到平衡。因此，選擇實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間為60min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和最低檢出限的確定

圖4 不同β-內(nèi)酰胺酶濃度作用下ΔpHr的變化值Fig.4 Standard curve forβ-lactamase determination by the method

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，方程式為Y=0.0021X－0.0174，R2=0.9856。式中：Y為ΔpHr；X為β-內(nèi)酰胺酶濃度；R為相關(guān)系數(shù)。得到理論最低檢出限為8.29U/mL。

理論檢出限附近取點(diǎn)相同條件下測(cè)定體系的ΔpHr值，每點(diǎn)做3個(gè)平行取平均值，結(jié)果見表1。

表1 理論檢出限附近點(diǎn)酶濃度的ΔpHr值Table 1 Average values (3 replicates) of ΔpHrvalues corresponding to βlactamase concentrations close to the theoretical limit of detection

由于pH計(jì)本身校準(zhǔn)后pH值有±0.005的誤差，所以ΔpHr在±0.005范圍內(nèi)的檢測(cè)值屬于實(shí)驗(yàn)誤差，則由表1可得此方法的實(shí)驗(yàn)實(shí)際檢出限為8.92U/mL。

3 結(jié) 論

由于分解牛奶中抗生素的β-內(nèi)酰胺酶是個(gè)復(fù)雜的酶系[8]，難以用色譜法直接進(jìn)行準(zhǔn)確地檢測(cè)分析，目前最多的用于牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)有微生物培養(yǎng)法和碘量法。其中微生物培養(yǎng)法檢出限較低，但是培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，無法快速檢測(cè)。碘量法則檢出限相對(duì)較高，且易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。免疫學(xué)方法特異性較強(qiáng)，檢出結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確，但只能定性確定樣品中是否含有β-內(nèi)酰胺酶而不能確定殘留量。

馬潔等[9]利用此原理研究牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)，用磷酸鹽緩沖液代替牛奶進(jìn)行酶促反應(yīng)適宜條件的確定實(shí)驗(yàn)，得到檢出限為15U/mL。本研究利用相同原理，但以市售純牛奶為基本反應(yīng)體系，酶促反應(yīng)的較適宜條件，再利用得到的適宜條件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到牛奶中β-內(nèi)酰胺酶的理論最低檢出限為8.29U/mL，實(shí)驗(yàn)實(shí)際檢出限為8.92U/mL，不僅消除了體系不同產(chǎn)生的誤差，更降低了檢出限。由于pH計(jì)靈敏度較高，易受到聲波、溫度、水質(zhì)、振動(dòng)等外界環(huán)境的干擾，為了排除這些干擾因素，在實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)把不加β-內(nèi)酞胺酶的空白樣與加了β-內(nèi)酞胺酶的樣品同時(shí)測(cè)量，本實(shí)驗(yàn)將pH計(jì)的兩個(gè)電極接到同一個(gè)pH計(jì)的兩個(gè)檢測(cè)模塊上進(jìn)行測(cè)量，減少了系統(tǒng)誤差。平行和重復(fù)實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)盡量使外界環(huán)境因素相同，特別是溫度，應(yīng)保證每次pH計(jì)的顯示溫度與實(shí)驗(yàn)設(shè)定溫度相同時(shí)再讀數(shù)，以降低實(shí)驗(yàn)誤差。

[1]ANONYMOUS. Pasteurized milk ordinance[EB/OL]. (2007-12-06)[2009-09-25]. http://www.cfsan.fda.gov/～ear/pmo03toc.html.

[2]李權(quán)超, 王曉光. 長(zhǎng)春市生鮮牛乳中抗生素殘留調(diào)查報(bào)告[J]. 肉品衛(wèi)生, 1991, 29(3): 67-70.

[3]DAHLM K, RICHARDSONT, BRADLEY L, Jr. Use of microbial beta-lactamase to destroy penicillin added to milk[J]. Dairy Sci, 1985, 68(8): 1910-1916.

[4]鄭穎. TEM-116型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶對(duì)牛奶中抗生素的清除[J]. 中國(guó)抗生素雜志, 2008, 33(2): 122-124.

[5]崔生輝, 李景云, 馬越. “生鮮牛乳抗生素分解劑”的鑒定與檢測(cè)[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志, 2007, 19(2): 113-116.

[6]MICHAELIS L, MENTEN M. Die kinetik der invertinwirkung[J]. Biochem, 1913, 49: 333-369.

[7]BRIGGS G E, HALDANE J B. A note on the kinetics of enzyme action [J]. Biochem, 1925, 19: 339-339.

[8]呂媛, 李家泰, 單愛蓮. β-內(nèi)酰胺酶抑制劑與β-內(nèi)酰胺酶類抗生素聯(lián)合應(yīng)用的抗菌作用評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志, 1998, 14(1): 53-57.

[9]馬潔, 李孝君. 利用酸度計(jì)檢測(cè)奶制品中殘留的β-內(nèi)酰胺酶[J]. 化學(xué)通報(bào), 2009, 72(4): 370-373.

Use of An Acid Meter for the Rapid Determination of β-Lactamase Residue in Milk

LIU Shan-shan1，ZHOU Zheng2，ZHOU Wei2，ZHANG Zi-de1，MA Jun-lian1,*
(1. College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China；2. Hebei Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research, Shijiazhuang 050051, China)

The principle that β-lactamase selectively decomposes β-lactam antibiotics like penicillin into acids leading to pH decline was considered to present a rapid and accurate method for the determination of β-lactamase residue in milk. β-Lactamase at a constant final concentration of 100 U/mL and penicillin were artificially added to antibiotic free milk and left to react for a certain period of time at an appropriate temperature. The optimal penicillin final concentration and reaction time and temperature were determined to be 10 mg/mL, 60 min and 33 ℃, respectively. The developed method exhibited a limit of detection of 8.92 U/mL.

pH value；β-lactamase；milk；penicillin；determination

Q5；TS207.3

A

1002-6630(2010)10-0216-03

2009-10-26

河北省科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(09227114D)

劉珊珊(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯運(yùn)原理與技術(shù)。E-mail：qhdlss1985@sina.com

*通信作者：馬俊蓮(1965—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品采后生物技術(shù)。E-mail：zhangzde@heinfo.net