王李寶，凌 云，劉綠葉，沈 輝，萬(wàn)夕和

(江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007)

水產(chǎn)品金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)結(jié)果不確定度的評(píng)定

王李寶，凌 云，劉綠葉，沈 輝，萬(wàn)夕和

(江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007)

目的：評(píng)定水產(chǎn)品金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)結(jié)果的不確定度。方法：采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)日常檢驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行不確定度評(píng)定。結(jié)果：擴(kuò)展不確定度為0.1，適合于每一個(gè)水產(chǎn)品樣本的檢測(cè)結(jié)果。結(jié)論：利用日常檢驗(yàn)數(shù)據(jù)評(píng)定金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)結(jié)果的不確定度是可行的。

水產(chǎn)品；金黃色葡萄球菌；不確定度評(píng)定

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種引起人類(lèi)和動(dòng)物化膿感染的重要致病菌，也是造成人類(lèi)食物中毒的常見(jiàn)致病菌之一[1-2]。為了確保金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，嘗試將其檢驗(yàn)結(jié)果不確定度的評(píng)定引入到日常的檢驗(yàn)工作中。而測(cè)量不確定度是衡量測(cè)試結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的重要參數(shù)。測(cè)量結(jié)果不確定度評(píng)定是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量體系的重要組成部分，是測(cè)量實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理的重要內(nèi)容，也是ISO/IEC17025的要求。尤其當(dāng)不確定度影響到與規(guī)范限度的符合性時(shí)，測(cè)量不確定度的信息顯得特別重要[3-4]。檢驗(yàn)結(jié)果的可用性很大程度上取決于測(cè)量結(jié)果不確定度的大小。所以，檢驗(yàn)結(jié)果不確定度的評(píng)定對(duì)實(shí)驗(yàn)方法的可靠性有科學(xué)的指導(dǎo)意義[5-6]。

本研究采用GB/T 4789.37—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)：金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)》中的第一法[7]對(duì)本實(shí)驗(yàn)室抽檢的南通地區(qū)2007～2009年的水產(chǎn)品(干紫菜)金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢驗(yàn)，找出影響輸入量的各種因素，計(jì)算各種不確定度分量，計(jì)算合成不確定度和擴(kuò)展不確定度，從而對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的質(zhì)量給出定量的說(shuō)明，以確定檢驗(yàn)結(jié)果的可信程度，進(jìn)而掌握類(lèi)似檢驗(yàn)方法的測(cè)量不確定度的評(píng)定程序。

1 評(píng)定方法的選擇

假設(shè)檢驗(yàn)樣品是均勻的，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)由相同人員在同一檢驗(yàn)環(huán)境按同一檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)。鑒于檢驗(yàn)過(guò)程對(duì)樣品進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)虼藢?duì)檢出金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)結(jié)果取對(duì)數(shù)，再用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(A類(lèi))評(píng)定此類(lèi)樣品的金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果的不確定度。

2 檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)流程

2.1 試劑與儀器

本研究中所采用的培養(yǎng)基均采購(gòu)于北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，所用主要儀器有恒溫培養(yǎng)箱和電子天平等，均符合GB/T 4789.37—2008計(jì)數(shù)中試劑和儀器的要求。

2.2 樣品中金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)

根據(jù)GB/T4789.37—2008計(jì)數(shù)中第一法進(jìn)行檢驗(yàn)。

2.3 結(jié)果計(jì)算

根據(jù)GB/T 4789.37—2008中第一法的計(jì)算方法。

3 不確定度分量的主要來(lái)源及分析

檢驗(yàn)結(jié)果的不確定度來(lái)源如圖1所示。

圖1 檢驗(yàn)結(jié)果的不確定度來(lái)源Fig.1 Analysis of source of measurement uncertainty in the enumeration of Staphylococcus aureus in aquatic products

4 不確定度的評(píng)定

4.1 樣品稱(chēng)量過(guò)程產(chǎn)生的不確定度

本實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格依照GB/T 4789.1—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)：總則》[8]規(guī)定，在無(wú)菌條件下將樣品充分混勻后隨機(jī)取樣，均質(zhì)袋拍擊速度和拍擊時(shí)間嚴(yán)格按照GB/T 4789.37—2008中規(guī)定執(zhí)行。

GB/T 4789.37—2008要求準(zhǔn)確稱(chēng)量25g被測(cè)樣品，本實(shí)驗(yàn)室采用精度為0.01g的電子天平，根據(jù)JJG1036—2008《中華人民共和國(guó)計(jì)量檢定規(guī)程：電子天平》規(guī)定[9]，該準(zhǔn)確級(jí)(Ⅱ)的天平在0～500g稱(chēng)量范圍的MPE為±0.5g，天平線性MPE為矩形分布，天平稱(chēng)量引入的不確定度為：

4.2 樣品稀釋過(guò)程中儀器所產(chǎn)生的不確定度

樣品稀釋采用1mL移液器和10mL移液管進(jìn)行梯度稀釋。JJG646—2006《中華人民共和國(guó)計(jì)量檢定規(guī)程移液器檢定規(guī)程》[10]規(guī)定：1000μL可調(diào)移液器吸取1mL時(shí)容量允差為±1.0%，取矩形分布；JJG196—2006《中華人民共和國(guó)計(jì)量檢定規(guī)程常用玻璃量器》[11]規(guī)定：20℃時(shí)10mL移液管(A級(jí))的容量允差為±0.05mL，取矩形分布。因此，由可調(diào)移液器及吸管導(dǎo)致的不確定度分別為：

因此，樣品稀釋過(guò)程中所產(chǎn)生的不確定度為：

本實(shí)驗(yàn)是在20℃的條件下進(jìn)行的，因此，容量瓶和溶液溫度與校準(zhǔn)時(shí)溫度不同引起的不確定度為零。當(dāng)溫度不為20℃時(shí)，必須考慮溫度對(duì)體積的影響。

4.3 樣品重復(fù)性檢驗(yàn)的不確定度

在相同條件下，對(duì)同一份金黃色葡萄球菌污染的樣品進(jìn)行了10次獨(dú)立檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果為1.25×102、1.3 ×102、1.25×102、1.3×102、1.4×102、1.25×102、1.25×102、1.25×102、1.25×102、1.25×102CFU/g。為了計(jì)算不確定度的方便將上述結(jié)果均取對(duì)數(shù)，相應(yīng)結(jié)果為2.10、2.11、2.10、2.11、2.15、2.10、2.10、2.10、2.10和2.10。金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)結(jié)果的對(duì)數(shù)算術(shù)平均值為：

4.4 培養(yǎng)基儲(chǔ)存條件產(chǎn)生的不確定度

表1 BP培養(yǎng)基在不同貯存條件下對(duì)金黃色葡萄球菌檢測(cè)結(jié)果的影響Table 1 Effect of storage conditions of Barid-Parker culture medium on the enumeration of Staphylococcus aureus

即使由同一廠家生產(chǎn)的Barid-Parker培養(yǎng)基因儲(chǔ)存條件和時(shí)間不同，導(dǎo)致金黃色葡萄球菌的檢出率不同[12]。本實(shí)驗(yàn)室按照GB/T 4789.37—2008附錄A.2規(guī)定配制Barid-Parker培養(yǎng)基，在48h內(nèi)對(duì)同一金黃色葡萄球菌污染樣品使用不同貯存條件下(室溫和冰柜貯存)的Barid-Parker培養(yǎng)基平板進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。

室溫(18～22℃)條件下，金黃色葡萄球菌檢出率算術(shù)平均值為：

4.5 肉眼讀數(shù)的偏差產(chǎn)生的不確定度

對(duì)于平板上超過(guò)150個(gè)菌落，本實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員通常采用兩種計(jì)數(shù)方式：一、直接計(jì)數(shù)，即逐個(gè)點(diǎn)數(shù)平板上的可疑菌落數(shù)，二、將平板等分四等分，點(diǎn)數(shù)其中一個(gè)區(qū)域的可疑菌落數(shù)，再乘以4倍得菌落總數(shù)。本實(shí)驗(yàn)室采用受金黃色葡萄球菌污染的不同樣品進(jìn)行了20次檢驗(yàn)，采用上述兩種讀數(shù)方法，檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同方法的金黃色葡萄球菌檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results of enumeration of Staphylococcus aureus obtained by different colony counting methods

20次不同計(jì)數(shù)方式，等分計(jì)數(shù)結(jié)果/直接計(jì)數(shù)結(jié)果的平均值為：

4.6 血漿凝固酶陽(yáng)性比例產(chǎn)生的不確定度

由于可疑菌落需要進(jìn)行血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)來(lái)最終判定金黃色葡萄球菌的比例，故血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)也可產(chǎn)生不確定度。根據(jù)2008年至2009年本實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)計(jì)，共計(jì)完成血漿凝固酶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)135次，其中1次陽(yáng)性率為80%，其余驗(yàn)證結(jié)果陽(yáng)性率均為100%，則135次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)金黃色葡萄球菌陽(yáng)性率平均值為：

單次檢驗(yàn)的不確定度為：

所以，由血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)引入的不確定度為：

4.7 樣品的合成不確定度

4.8 擴(kuò)展不確定度

在沒(méi)有特殊要求的情況下，按一般慣例，測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度包含因子k取2，則相對(duì)擴(kuò)展不確定度為：

4.9 結(jié)果報(bào)告

當(dāng)檢驗(yàn)結(jié)果以對(duì)數(shù)的平均值表示時(shí)，其取值區(qū)間分布于±0.21。當(dāng)檢測(cè)結(jié)果以平均值表示時(shí)，相對(duì)于對(duì)數(shù)值的取值再取反對(duì)數(shù)得其取值區(qū)間分布。

5 結(jié) 論

采用GB/T 4789.37—2008中第一法檢驗(yàn)水產(chǎn)品中金黃色葡萄球菌，在檢出金黃色葡萄球菌樣品的檢驗(yàn)結(jié)果中，其對(duì)應(yīng)的計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)數(shù)值的擴(kuò)展不確定度為0.1。該樣品金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)計(jì)數(shù)結(jié)果為：ω＝10(2.11±0.21)CFU/g，即ω＝(79～209)CFU/g。

經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)結(jié)果分析得出，按照GB/T 4789.37—2008中第一法中的檢驗(yàn)方法和實(shí)際操作，此次檢驗(yàn)結(jié)果的不確定度主要來(lái)源是：肉眼讀數(shù)的偏差、培養(yǎng)基貯存條件、樣品稱(chēng)量過(guò)程、稀釋過(guò)程等因素。

對(duì)各不確定度分量進(jìn)行分析和計(jì)算表明，肉眼讀數(shù)偏差產(chǎn)生的不確定度分量最大，其次是培養(yǎng)基貯存條件引入的不確定度，再次是血漿凝固酶驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和稱(chēng)量引入的不確定度，相對(duì)較小的是樣品稀釋過(guò)程和實(shí)驗(yàn)重復(fù)性引入的不確定度。

因此，以后對(duì)于樣品金黃色葡萄球菌的檢驗(yàn)，盡量采用逐個(gè)點(diǎn)數(shù)可疑菌落，并在盡可能短的時(shí)間內(nèi)使用所配制的Barid-Parker培養(yǎng)基，是確保檢測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠的有效手段。

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Evaluation of Measurement Uncertainty in the Enumeration of Staphylococcus aureus in Aquatic Products

WANG Li-bao，LING Yun，LIU Lu-ye，SHEN Hui，WAN Xi-he
(Institute of Oceanology and Marine Fisheries, Nantong Jiangsu 226007, China)

To make an evaluation on measurement uncertainty in the enumeration of Staphylococcus aureus in aquatic products, the sources of measurement uncertainty were analyzed, each uncertainty component was modeled and an integrated uncertainty model as a function of all components was established and expanded. The expanded uncertainty was calculated to be 0.1. The evaluation is a good fit for each aquatic product sample.

aquatic products；Staphylococcus aureus；uncertainty evaluation

TS254.1

A

1002-6630(2010)10-0212-04

2009-08-14

江蘇省社會(huì)發(fā)展科技計(jì)劃(面上)項(xiàng)目(BS2006029)

王李寶(1978—)，男，助理研究員，碩士，主要從事海洋微生物學(xué)研究。E-mail：zebra_w@126.com