徐雅琴，王 翀，崔崇士

(1.東北農(nóng)業(yè)大學理學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

高效液相色譜法測定南瓜果肉中胡蘆巴堿含量

徐雅琴1，王 翀1，崔崇士2

(1.東北農(nóng)業(yè)大學理學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院，黑龍江 哈爾濱 150030)

以脫脂南瓜粉為原料，70%乙醇溶液為溶劑，微波輔助萃取樣品中的胡蘆巴堿，建立南瓜果肉中胡蘆巴堿含量的高效液相色譜(HPLC)檢測方法。實驗過程中，采用的色譜柱為Agilent-ZORBX SB-C18(4.6mm×150mm，5μm)柱，流動相為0.40mmol/L磷酸溶液(pH3.2)，流速為0.6mL/min，進樣量為10μL，檢測波長265nm，柱溫為室溫。研究結(jié)果表明，胡蘆巴堿在5.6～134.4μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.9999(n=5)；平均回收率為97.09%，RSD為1.02%(n=5)。本法簡便、準確、重復性好，可用于南瓜果肉中胡蘆巴堿的含量測定。此外，采用此方法測定了13個品種南瓜果肉中胡蘆巴堿的含量，結(jié)果表明胡蘆巴堿含量為172.5～475.5μg/g。

南瓜；胡蘆巴堿；高效液相色譜法(HPLC)

南瓜，又名倭瓜、番瓜、飯瓜、窩瓜等，胡蘆科南瓜屬的一年生蔓性草本植物，以其營養(yǎng)價值極高被世界營養(yǎng)學家公認為是21世紀的保健食品[1]。南瓜的果實、莖、葉、花朵和種子中含有豐富的類胡蘿卜素、南瓜多糖、抗菌活性蛋白、降血糖多肽物質(zhì)等[2-4]。除此之外南瓜果肉含有生物堿——胡蘆巴堿。胡蘆巴堿是一種植物激素類活性成分，具有抗腫瘤作用及降血糖活性，還可有效治療一些皮膚疾病，例如牛皮癬[5-9]等。

目前有關(guān)胡蘆巴堿的定量方法文獻上報道主要采用高效液相色譜法(HPLC)[10-15]，南瓜中胡蘆巴堿含量的測定國內(nèi)僅見張春英等[11]報道采用正相氨基鍵合相色譜柱，以乙腈-水(80:20)為流動相，得到了較好的分離效果。本實驗以南瓜果肉為試材，采用反向C18色譜柱，確定HPLC的測定條件，拓展南瓜果肉中胡蘆巴堿含量測定的HPLC方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

方法探討實驗用市售南瓜，方法應(yīng)用實驗南瓜由東北農(nóng)業(yè)大學南瓜研究所提供。

甲醇(色譜純)；磷酸(色譜純)；胡蘆巴堿對照品 中國藥品生物制品檢定所，其他試劑均為分析純。

H P 1 1 0 0型高效液相色譜儀[配置四元梯度泵(G 1 3 1 4 A)、自動進樣器(G 1 3 1 3 A)、紫外檢測器(G1314A)、ZORBX SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)]美國Agilent公司；XH-100A微波催化合成/萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生生物技術(shù)有限公司。

1.2 原料預處理

將南瓜洗凈后，去皮、去瓤、切片、烘干、粉碎成粉后備用。

1.3 色譜條件的選擇

采用Agilent-ZORBX SB-C18色譜柱(4.6mm× 150mm，5μm)，檢測波長為265nm，柱溫為室溫，進樣體積10μL，流速為0.6mL/min分別考察不同比例的甲醇-水、乙腈-水及磷酸溶液作為流動相時對分離效果的影響。

1.4 樣品處理

將南瓜粉過40目篩后，置索氏提取器中，加無水乙醚連續(xù)回流12h脫脂，得脫脂南瓜粉。揮盡乙醚后精密稱取約5g的脫脂南瓜粉，加70%乙醇溶液100mL，微波萃取7min，過濾，乙醇沉后再次過濾，回收乙醇[16]。提取物用甲醇溶解，定容于25mL容量瓶中。0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.5 標準溶液的配制

胡蘆巴堿對照品約10mg，精密稱取，置于10mL容量瓶中，甲醇定容，最后得到質(zhì)量濃度為1.12mg/mL的對照品儲備液，4℃冰箱存放。分別精密吸取儲備液0.05、0.2、0.4、0.8、1.2mL于10mL容量瓶中，甲醇稀釋并定容，搖勻配制成質(zhì)量濃度分別為5.6、22.4、44.8、89.6、134.4μg/mL系列對照品溶液，進行液相色譜分析，繪制標準曲線。

1.6 方法學考察

對所建立測定方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度、回收率進行評價。

1.7 樣品測定

按1.4節(jié)樣品處理方法對13個品種的南瓜進行處理，進行液相色譜分析，進樣量10μL，采用外標法定量，測定胡蘆巴堿的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

實驗結(jié)果表明：當流動相選擇不同比例的甲醇-水、乙腈-水溶液作為流動相都不能將樣品中的胡蘆巴堿與其他物質(zhì)進行分離。當流動相采用0.40mmol/L磷酸溶液(pH3.2)溶液時，分離效果較好，其對照品和樣品的色譜圖如圖1所示。

圖1 對照品(A)及樣品(B)的HPLC譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of trigonelline standard and a pumpkin pulp sample

由圖1可看出，對照品和樣品的出峰時間分別在3.165nm和3.167nm，基本一致，而且樣品中胡蘆巴堿與相鄰物質(zhì)的分離效果較好。因此確定流動相為0.40mmol/L磷酸溶液(pH3.2)。

2.2 線性范圍的考察

分別取胡蘆巴堿含量為5.6、22.4、44.8、89.6、134.4μg/mL的標準溶液，0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，按色譜條件1.3節(jié)進行分析，以對照品質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(X)、對照品峰面積為縱坐標(Y)，繪制工作曲線。結(jié)果得到回歸方程：Y=22.381X +59.627，相關(guān)系數(shù)r=0.9999(n=5)。表明對照品溶液在5.6～134.4μg/mL內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 穩(wěn)定性實驗

取同一供試品溶液，按所建立的方法進樣分析，分別在0、2、4、8、1 2、2 4、4 8、9 6 h測定峰面積，平均值為881.9，相對標準偏差(RSD)為0.27% (n=5)。表明供試品溶液在96h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4 重現(xiàn)性實驗

精密稱取5份脫脂南瓜粉樣品，質(zhì)量分別為5.0132、5.0096、4.9982、5.0201、5.0105g，樣品按1.4節(jié)方法

處理，進樣分析，測定胡蘆巴堿含量分別為186.1、182.4、178.9、189.6、181.7μg/g，平均含量為183.7μg/g，RSD為2.27%(n=5)。該結(jié)果表明方法重現(xiàn)性好。

2.5 精密度實驗

取同一供試品溶液，按1.3節(jié)色譜條件重復進樣5次，測定峰面積，結(jié)果分別為876.4、872.9、875.8、874.1、869.7，平均值為873.8，RSD為0.31%(n=5)。表明該方法精密度很高。

2.6 回收率實驗

精密稱取6份已知含量的脫脂南瓜粉樣品約2.5g，分別精密加入對照品儲備液0.2、0.2、0.4、0.4、0.6、0.6mL，揮盡甲醇，按1.4節(jié)樣品處理方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件進樣分析，結(jié)果見表1。

表1 回收率實驗結(jié)果(n=5)Table 1 Average recovery for trigonelline in a total of 6 real samples spiked at 3 levels repeated twice each in 5 replicates

表1測量結(jié)果表明，加樣回收實驗中在胡蘆巴堿出峰時間處沒有意外峰出現(xiàn)，說明供試品種含有與對照品出峰時間相同的物質(zhì)。平均回收率為97.09%，RSD為1.02%，滿足測定要求。

2.7 不同南瓜品種胡蘆巴堿含量的測定

表2 不同南瓜品種中胡蘆巴堿的含量Table 2 Results of determination of trigonelline in different cultivars of pumpkin powder by the method

不同品種南瓜果肉中胡蘆巴堿的含量測定結(jié)果見表2。結(jié)果表明，所測脫脂南瓜粉中胡蘆巴堿的含量為172.5～475.5μg/g。

3 結(jié) 論

本實驗首次采用反相C18色譜柱，建立南瓜果肉中胡蘆巴堿含量的測定方法。本測定方法操作簡便、準確、靈敏度高、重復性好，可用于對南瓜果肉中胡蘆巴堿成分的定性與定量的分析。

[1]劉軟枝, 趙玉安. 南瓜的功能特性[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2006(3): 47-48.

[2]黃黎慧, 黃群, 于美娟. 南瓜的營養(yǎng)保健價值及產(chǎn)品開發(fā)[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2005, 21(3): 176-179.

[3]孔謹, 李新崢, 周俊國, 等. 南瓜綜合深加工及新型功能性食品的開發(fā)前景與技術(shù)研[J]. 食品研究與開發(fā), 2004, 25(5): 72-74.

[4]王洪偉, 徐雅琴. 南瓜功能成分研究進展[J]. 食品與機械, 2004, 20 (4): 55-56.

[5]朱寶立, 班永宏, 段金廒. 胡蘆巴對急性化學性肝損傷的保護作用[J]. 中國工業(yè)醫(yī)學雜志, 2000, 13(1): 19-21.

[6]AGARWAL J S, RASTOGI R P. Chemical examination of water soluble fraction of Mappia foetida Miers[J]. Indian J Chem, 1975,13(7): 758-759.

[7]MAI J, MAI H. Treatment of skin diseases with trigonelline: Germany, 3915535[P]. 1990-11-15.

[8]MAI J. Oral hair growth stimulant based on fenugreek extract: Germany, 273379[P]. 1989-11-15.

[9]STUECKLER E. Compositions comprising trigonelline and vita-minB6 for hair,nail and skin care: Germany, 4012148[P]. 1990-10-31.

[10]TRUGO L C, MACRAE R, DICK J. Determination of purine alkaloids and trigonelline in the instant coffee and otherbeverage using highperformance liquid chromoto-graphy[J]. J Sci Food Agri, 1983, 34(3): 300-306.

[11]張春英, 楊鑫, 張華, 等. 高效液相色譜法測定南瓜粉中胡蘆巴堿的含量[J]. 食品科學, 2008, 29(1): 280-282.

[12]姜舜堯, 田頌九. 用高效離子交換色譜法分析使君子藥材中胡蘆巴堿成分[J]. 中國中藥雜志, 2004, 29(2): 135-137.

[13]趙懷清, 曲燕, 王學婭, 等. 胡蘆巴堿的HPLC法測定及藥代動力學研究[J]. 藥學學報, 2003, 8(4): 279-282.

[14]曲燕, 趙懷清, 張洪建, 等. HPLC法測定雀巢速溶咖啡中胡蘆巴堿的含量[J]. 沈陽藥科大學學報, 2001, 18(6): 422-444.

[15]宋粉云, 張德志, 鐘運香, 等. HPLC法測定紫茉莉根中葫蘆巴堿的含量[J]. 中國新藥與臨床藥理, 2005, 16(3): 189-191.

[16]王翀, 徐雅琴. 微波輔助萃取南瓜胡蘆巴堿工藝的優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技, 2009, 30(1): 258-262.

HPLC Determination of Trigonelline in Pumpkin Pulp

XU Ya-qin1，WANG Chong1，CUI Chong-shi2
(1. College of Science, Northeast Agricultual University, Harbin 150030, China；2. College of Horticulture, Northeast Agricultual University, Harbin 150030, China)

A method for the determination of trigonelline in pumpkin flesh was established using high performance liquid chromatography (HPLC). Samples were defatted in a Soxhlet extractor with absolute ethyl ether as solvent and extracted with 70% aqueous ethanol with microwave assistance. An Agilent Zorbax SB-C18 column kept at ambient temperature was used for the chromatographic separation with 0.40 mmol/L aqueous solution of phosphoric acid (pH 3.2) as a mobile phase at a flow rate of 0.6 mL/min. The injection volume was 10 μ L. The detection wavelength was set at 265 nm. Results showed that the developed standard curve of trigonelline exhibited good linearity over the concentration of 5.6 to 134.4 μ g/mL, with a correlation coefficient of 0.9999 (n = 5). The average recovery for trigonelline in a total of 6 real samples spiked at 3 levels repeated twice each in 5 replicates was 97.09%, with a relative standard deviation of 1.02%. This method proved to be simple, accurate and of good repeatability so as to be most suitable for the determination of trigonelline in pumpkin pulp. Thirteen cultivars of pumpkin pulp were determined by the method to have very different trigonelline contents ranging between 172.5μ g/g and 475.5 μ g/g.

pumpkin；trigonelline；high performance liquid chromatography

TS218.1

A

1002-6630(2010)10-0209-03

2009-08-30

黑龍江省自然科學基金資助重點項目(ZJN0606-01)；黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究項目(11521028)

徐雅琴(1964—)，女，教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物及其開發(fā)研究。E-mail：xu-yaqin@163.com