羅舜菁，鐘寒燕，劉成梅，陳婷婷，陳發(fā)榮，嚴杰琳

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

氯霉素免疫抗原及包被抗原的制備

羅舜菁，鐘寒燕，劉成梅，陳婷婷，陳發(fā)榮，嚴杰琳

(南昌大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047)

采用混合酸酐法合成30:1～10:1 三個不同起始物質(zhì)的量比的氯霉素免疫抗原(HAP-KLH)，采用活潑酯法(EDC-NHS)合成40:1～1:1 七個不同起始物質(zhì)的量比的包被抗原(HAP-OVA)，紫外測定HAP-KLH偶聯(lián)比25:1～8:1，HAP-OVA偶聯(lián)比23:1～1:3。間接競爭ELISA實驗優(yōu)化包被抗原，在23:1～3:1偶聯(lián)比范圍內(nèi)，氯霉素(CAP) IC50值為36～15ng/mL，隨著偶聯(lián)比的減小而降低，當偶聯(lián)比低于3:1則略為上升。確定了包被抗原HAP-OVA最佳偶聯(lián)比為3:1。本研究表明包被抗原的偶聯(lián)比對ELISA測定IC50值有重要影響，應合成不同偶聯(lián)比的包被抗原，選出最佳偶聯(lián)比。

氯霉素；免疫抗原；包被抗原；偶聯(lián)比

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一種廣譜抗生素，對革蘭氏陽性、陰性菌均有抑制作用[1]。氯霉素對人體有較強的副作用和毒性，可導致再生障礙性貧血和粒細胞缺乏癥[2]。2002年中國農(nóng)業(yè)部《動物性食品獸藥殘留規(guī)定》中規(guī)定氯霉素在可食部分不得檢出，在出口的日常檢測中列為必檢項目。但由于其低廉的價格和穩(wěn)定的抗菌性，在畜牧業(yè)及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中違法使用的現(xiàn)象仍屢見不鮮[3]。

對氯霉素的檢測方法有微生物檢測法、色譜分析法、免疫檢測法[4]。微生物法靈敏度低；色譜分析法樣品前處理麻煩，費用高；免疫分析法具有快速、靈敏度高、高通量的特點。其中免疫分析方法有傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析、膠體金免疫層析技術、化學發(fā)光免疫分析法及新的液態(tài)芯片技術[5](又稱懸浮陣列技術)，這些檢測方法都是以抗原抗體的特異性、可逆性結(jié)合反應為基礎的分析方法。它們的檢測靈敏度都與單克隆抗體的特異性、親和力密切相關[6]，若欲制備高特異性、高親和力的單克隆抗體不僅需要優(yōu)質(zhì)的免疫抗原，而且篩選產(chǎn)單克隆抗體細胞株時所用包被抗原偶聯(lián)比直接影響單克隆抗體質(zhì)量的判斷。氯霉素是小分子物質(zhì)，屬于

半抗原，需要與大分子物質(zhì)偶聯(lián)合成人工抗原才具有免疫原性，人工抗原包括免疫抗原和包被抗原。CAP與琥珀酸酐反應的產(chǎn)物是琥珀氯霉素(HAP)，它和CAP有相同的抗原決定簇，可利用HAP制備抗CAP單克隆抗體。本實驗室已經(jīng)合成牛血清白蛋白(BSA)為載體的HAP-BSA免疫抗原，并制備出抗氯霉素單克隆抗體(mAb)，但親和性未達到商品化要求(CAP的IC50值為2～5ng/mL)，已制備出的單克隆抗體則用來考察包被抗原偶聯(lián)比對酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)的影響。為了得到更高親和力的mAb，重新合成新抗原免疫小鼠，文獻報道[7]鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)對比于常用的牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等具有更好的免疫原性，但由于價格昂貴，較少用來作為載體蛋白，且未見報道用于合成氯霉素免疫抗原。本研究采用混合酸酐法將HAP與KLH偶聯(lián)合成免疫抗原(HAP-KLH)，采用活潑酯(EDC-NHS)法將HAP與OVA偶聯(lián)合成檢測用包被抗原。按3個不同起始物質(zhì)的量比合成不同偶聯(lián)比的HAP-KLH免疫抗原，分別免疫。按7個不同起始物質(zhì)的量比合成7個不同偶聯(lián)比的HAP-OVA包被抗原。抗體為同一抗體，包被抗原采用上述7個不同偶聯(lián)比的HAP-OVA，利用間接競爭酶聯(lián)免疫吸附實驗(ic-ELISA)分別測定對應的IC50值，IC50值最低時對應的包被抗原的偶聯(lián)比為最佳偶聯(lián)比，為抗CAP單克隆抗體的制備和靈敏度高的檢測方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯霉素(CAP)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC-HCl) BBI公司；琥珀氯霉素(HAP)、鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) Sigma公司；酶標板 美國Corning公司；其余試劑均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

TU-1900雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；Multiskan MK3酶標儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 人工抗原的合成

1.3.1.1 混合酸酐法合成HAP-KLH

稱取一定量的HAP，溶于DMF和1,4-二氧六環(huán)混合液(按體積比1:1配制)中，通過稀釋使最終質(zhì)量濃度為12.01、8.58、5.15μg/mL，體積各1mL，分別編號①、②、③。分別加入三正丁胺10μL，冰浴條件下攪拌反應10min，加入氯甲酸異丁酯7μL，室溫下攪拌反應1h，此為A液；稱取7.3mg K LH蛋白，溶于3mL的 0.01mol/L PBS溶液中，調(diào)節(jié)pH8.5，平均分成3份，編號①、②、③，此為B液。冰浴攪拌下，將A分別逐滴加入到編號相同的B中，維持pH8.5，冰浴條件下攪拌反應4h，反應液裝入透析袋中，用pH7.4 PBS透析3 d，每天換液3次。透析后冷凍干燥備用。

1.3.1.2 EDC-NHS法合成HAP-OVA

稱取7.0mg HAP溶于0.01mol/L PBS溶液中，分別加入一定量的EDC-HCl和NHS，控制pH值在5.0左右，室溫避光振蕩活化15min。加入20mmol/L的β-巰基乙醇4μL淬滅未反應的EDC-HCl。將其平均分成7組，對應編號為①、②、③、④、⑤、⑥、⑦，按H A P與OVA的起始物質(zhì)的量比為40:1、30:1、20:1、10:1、7:1、4:1、1:1分別加入一定量OVA溶液，室溫反應2h后，反應液中加入10mmol/L鹽酸羥胺3μL淬滅未反應的NHS。反應液用pH7.4的0.01mol/L PBS透析3d，透析后冷凍干燥備用。

1.3.2 人工抗原的的鑒定

紫外掃描HAP-KLH、標準品KLH、OVA、HAP。

1.3.3 人工抗原偶聯(lián)比的測定

1.3.4 HAP-OVA的優(yōu)化

1.3.4.1 間接ELISA法確定HAP-OVA、抗體最佳工作濃度

包被：將7個偶聯(lián)比的包被抗原HAP-OVA分別倍比稀釋成一系列質(zhì)量濃度梯度10、5、2.5、1.25、

0.625、0.3125、0.1562μg/mL，加至酶標板，同列為同一濃度，100μL/孔，4℃冰箱過夜。用PBST洗液洗5遍，吸水紙上拍干。封閉：每孔加380μL封閉液37℃封阻70min。洗滌同上。加抗體：抗體稀釋倍數(shù)從2×104到1.28×106作倍比稀釋。加入酶標板中，同行七孔同濃度，37℃溫育1h，洗滌同上。加二抗：每孔加100μL HRP-羊抗兔IgG，37℃溫育1h，洗滌同上。顯色：每孔加100μL TMB顯色液，37℃溫育15min。終止：每孔加入50μL終止液，用酶標儀讀取各孔OD450值。

以OD450值為1.0左右孔對應的HAP-OVA包被濃度為抗原最佳工作濃度，此孔對應的抗體濃度作為抗體最佳工作濃度。

1.3.4.2 ic-ELISA法測定CAP的IC50值

將7個偶聯(lián)比的HAP-OVA分別按1.3.4.1節(jié)確定的最佳濃度包板，進行ic-ELISA實驗，另配制一系列質(zhì)量濃度的CAP標準溶液(103、102、50、20、10、5、0ng/mL)，加入50μL CAP標液和50μL最佳工作濃度的單抗，測定不同濃度CAP的抑制率，以抑制率B/B0(B是CAP不同標準濃度對應的OD450值，B0是CAP濃度為0時OD450值)為縱坐標，以不同濃度的CAP為橫坐標繪制曲線，抑制率為50%對應的CAP濃度為半數(shù)抑制濃度IC50值。整個ELISA實驗做3個平行，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的鑒定結(jié)果

KLH、HAP、偶聯(lián)物HAP-KLH、標準品OVA、偶聯(lián)物HAP-OVA的紫外掃描見圖1。為與偶聯(lián)物透析環(huán)境相似，將KLH標準品溶于PBS溶液，在4℃放置3d后進行紫外掃描，結(jié)果見圖1a。KLH在200～400nm波長范圍內(nèi)沒有明顯的特征吸收峰，吸光度隨波長的減小一直呈增大趨勢。由圖1b可知，HAP特征吸收峰為276nm。由圖1c可知，HAP-KLH的吸收在276nm附近明顯有拐點，260～278nm處吸收度大致持平，對比圖1a可知，這一變化主要是偶聯(lián)物中HAP的影響，可以證明HAP-KLH偶聯(lián)成功。OVA、HAP、HAP-OVA的特征吸收峰分別在278、276、277nm，由此可判斷出HAP-OVA偶聯(lián)成功。

圖1 紫外掃描圖Fig.1 UV absorption spectra of KLH chloramphenicolsuccinate, a chloramphenicolsuccinate-KLH conjugate, OVA and a chloramphenicolsuccinate-OVA conjugate

2.2 免疫抗原偶聯(lián)比結(jié)果

免疫抗原HAP-KLH偶聯(lián)比結(jié)果見表1。相關研究[9]表明，免疫抗原的偶聯(lián)比太高會導致特異性不好，偶聯(lián)比太低則抗體產(chǎn)生的滴度不高，且根據(jù)本實驗室前期研究結(jié)果，偶聯(lián)比在10:1～20:1為宜，過多的半抗原可能會影響載體蛋白與淋巴細胞表面的接觸致使免疫反應減弱。不同人工抗原具有不同的最佳偶聯(lián)比，為了獲得最佳免疫效果，得到特異性最好和效價最高的單克隆抗體，應制備不同偶聯(lián)比的免疫抗原免疫小鼠，并用不同的劑量免疫小鼠，低劑量較難刺激機體免疫，但一旦免疫成功則能得到更高親和力抗體。

表2 HAP-OVA偶聯(lián)比Table 2 Coupling ratios corresponding to initial molar ratios between chloramphenicolsuccinate and OVA

包被抗原偶聯(lián)比結(jié)果見表2。用不同的方法合成免疫抗原和包被抗原，可以避免合成免疫抗原時引入氯甲酸異丁酯部分基團所造成的橋抗體的干擾[10]。采用活潑酯法合成了偶聯(lián)比23:1～1:3的包被抗原。

2.3 包被抗原優(yōu)化結(jié)果

表3 ic-ELISA實驗結(jié)果Table 3 Results of determination of IC50 of CAP by the ic-ELISA method

在ic-ELISA實驗中，用不同偶聯(lián)比的HAP-OVA包板測得CAP的IC50值結(jié)果見表3。不同偶聯(lián)比的HAPOVA作為包被抗原進行間接競爭ELISA實驗時，對應得到CAP的IC50值不一樣。CAP的IC50值越低，表明CAP對單抗與包被抗原結(jié)合的抑制作用越強，即抗體對待測小分子CAP的靈敏度越高。結(jié)果顯示，在26:1～3:1偶聯(lián)比范圍內(nèi)，CAP的IC50值為36～15ng/mL，隨著偶聯(lián)比的減小而降低，當偶聯(lián)比為3:1～1:3，IC50值從15ng/mL略為上升至18ng/mL。一方面是因為包被抗原偶聯(lián)比過高，偶聯(lián)在大分子OVA上的半抗原HAP相互擁擠，HAP的舒展性受到抑制，阻礙了HAP與抗體的結(jié)合，使使IC50值偏低；另一方面，半抗原HAP相互疊加所形成網(wǎng)絡結(jié)構，使加入的競爭品CAP嵌入其中，影響CAP抗原表位的充分展露，導致實際和抗體結(jié)合的CAP量減少，要達到半數(shù)抑制所要加入的CAP量增大，這兩方面的作用，導致在一定范圍內(nèi)隨著包被抗原偶聯(lián)比增加IC50值則增大。當偶聯(lián)比為1:1～1:3時，包被抗原的質(zhì)量濃度增大至1.25μg/mL，包被在酶標板上的蛋白質(zhì)分子OVA形成網(wǎng)絡結(jié)構使待測小分子CAP嵌入其中，影響CAP與抗體的結(jié)合，IC50值略微上升。

3 結(jié) 論

采用混合酸酐法以KLH作為載體蛋白合成氯霉素免疫抗原，通過紫外光譜檢測證明偶聯(lián)成功。采用活潑酯法合成以OVA為載體的包被抗原，考察不同偶聯(lián)比對間接競爭ELISA實驗的影響。結(jié)果表明，對于同一抗體，不同偶聯(lián)比的包被抗原測得的IC50值不同。在單克隆抗體整個制備過程中，抗體親和力是否達到要求，ic-ELISA測定的IC50值為最主要的反應指標。IC50值越低，表明抗體親和力越好，抗體與待測小分子反應越靈敏。如果包被抗原未優(yōu)化，測得的IC50值可能偏高，導致誤判所制備出的單克隆抗體不合格，所以優(yōu)化包被抗原，選出最適偶聯(lián)比的包被抗原對真實測定IC50值至關重要。在制備免疫抗原和包被抗原時，常常對免疫抗原進行偶聯(lián)比的考慮，而忽略了制備一系列不同偶聯(lián)比的包被抗原，本研究表明了包被抗原的偶聯(lián)比對ELISA實驗影響的重要性。

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Preparation of Chloramphenicol Immunogen and Coating Antigen

LUO Shun-jing，ZHONG Han-yan，LIU Cheng-mei，CHEN Ting-ting，CHEN Fa-rong，YAN Jie-lin
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

Chloramphenicolsuccinate and keyhole limpet hemocyanin (KLH) were mixed at 3 initial molar ratios, namely 30:1, 20:1 and 10:1, to synthesize chloramphenicol (CAP) immunogens (hapten-KLH conjugates) with coupling ratios of 25:1, 16:1 and 8:1, respectively. Additionally, chloramphenicolsuccinate was mixed with ovalbumin (OVA) at 7 initial molar ratios, namely 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 7:1, 4:1 and 1:1, to synthesize CAP coating antigens (hapten-OVA conjugates) with coupling ratios determined by the UV spectrometric method of 23:1, 20:1, 14:1, 6:1, 3:1, 1:1 and 1:3, respectively. Indirect competitive enzyme linked immunosorbent assay (ic-ELISA) experiments were carried out to choose a CAP coating antigen with an optimal coupling ratio. CAP was determined with the CAP coating antigens to have IC50 values ranging from 15 to 36 ng/mL. As the coupling ratio between chloramphenicolsuccinate and OVA decreased from 26:1 to 3:1, there was a decrease in the IC50 value of CAP. When the coupling ratio was less than 3:1, the IC50value of CAP exhibited a slight increase. These findings demonstrate that a CAP coating antigen with an optimal coupling ratio should be synthesized for the ic-ELISA assay of IC50significantly influenced by coupling ratio.

chloramphenicol；immunogen；coating antigen；coupling ratio

R446.61

A

1002-6630(2010)10-0091-04

2009-08-05

江西省教育廳科學技術研究項目(GJJ09062)

羅舜菁(1969—)，女，副教授，碩士，研究方向為食品安全。E-mail：luoshunjing@yahoo.com.cn