譚貝妮，馬美湖*，魏 濤

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)肉類科學(xué)研究所，湖北 武漢 430070)

牛骨蛋白酶解工藝條件的優(yōu)化

譚貝妮，馬美湖*，魏 濤

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)肉類科學(xué)研究所，湖北 武漢 430070)

以水解度和氮收率為指標(biāo)，研究酶制劑種類、底物質(zhì)量濃度、加酶量、酶解時(shí)間、pH值及酶解溫度對牛骨酶解工藝的影響，并采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)進(jìn)行工藝優(yōu)化，得到最佳優(yōu)化工藝條件：確定木瓜蛋白酶作為試驗(yàn)用酶、底物質(zhì)量濃度1g/100mL、加酶量6000U/g、酶解溫度60℃、pH6.5、酶解時(shí)間3h。在該條件下制備的酶解產(chǎn)物水解度可達(dá)26.27%?？紤]到酶解后固形物的產(chǎn)率，選取底物質(zhì)量濃度為5g/100mL進(jìn)行工藝試驗(yàn)，根據(jù)回歸方程可得水解度的理論值為18.33%。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在5g/100mL的底物質(zhì)量濃度條件下，牛骨酶解產(chǎn)物水解度可達(dá)16.5%～20%，氮收率可達(dá)84.5%～92%。

牛骨；利用；酶解條件；二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)

我國肉類年總產(chǎn)量在世界居于第一位，但每年也產(chǎn)生大量的畜禽屠宰下腳料，其中鮮骨達(dá)兩千萬噸，大多數(shù)銷路不佳，且價(jià)格較低。這些骨頭大多沒有得到充分利用，不僅造成了巨大的浪費(fèi)，還會因骨頭富含的營養(yǎng)物質(zhì)易于腐敗而造成嚴(yán)重的環(huán)境污染[1]。研究發(fā)現(xiàn)，牛骨所含營養(yǎng)素非常豐富，其蛋白質(zhì)和脂肪含量與肉類相似。牛骨中蛋白質(zhì)和脂肪含量分別為11.5%和8.5%，牛肉中分別為18.0%和16.4%。骨中含有構(gòu)成蛋白質(zhì)的所有氨基酸，且比例均衡、必需氨基酸水平高，屬于優(yōu)質(zhì)蛋白[2-3]。人類利用蛋白酶水解蛋白質(zhì)生產(chǎn)食品和調(diào)味料已有悠久的歷史，但直到1783年，Adler-Nissen[4]對胃消化的研究才拉開了人類研究蛋白酶水解的序幕。

酶解法是一種新興的動物蛋白水解液的生產(chǎn)方法，與已有的化學(xué)法和物理法相比，酶解法具有定向、易控、溫和等優(yōu)點(diǎn)，因此人們對酶法生產(chǎn)動物蛋白質(zhì)水解液的研究開始重視。許多學(xué)者對蛋白酶及蛋白酶水解中的底物、反應(yīng)速率、水解產(chǎn)物等方面做了大量的系統(tǒng)研究，同時(shí)人們從酶解機(jī)理、酶解原料、酶及酶解

液等方面也進(jìn)行了大量的深入研究[5]。本研究采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)對酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，以制備口感和營養(yǎng)俱佳的牛骨蛋白水解液。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮牛腿長骨 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場。

堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶 龐博生物酶制劑有限公司；胰蛋白酶 上?？笊锛夹g(shù)有限公司；胃蛋白酶(進(jìn)口分裝) Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3C酸度計(jì) 上海雷磁儀器廠；UV-1800紫外可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；DFT-200高速粉碎機(jī) 溫嶺市林大機(jī)械有限公司；TDL-50B離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；QSL-08消化爐、QSY型凱氏定氮儀 北京強(qiáng)盛分析儀器制造中心；SHA-B水浴恒溫振蕩器 常州國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 骨粉的制備及酶解工藝流程

選取新鮮的牛腿骨，清洗、破碎處理后于0.1MPa條件下蒸煮3h，將軟化后的牛骨去掉油脂，然后放入烘箱50℃烘制6h，用粉碎機(jī)粉碎過80目篩，制得樣品骨粉。按照設(shè)計(jì)方案進(jìn)行酶解，酶解完成后升溫至90℃滅酶10min，冷卻至常溫，4000r/min離心15min，取上清液進(jìn)行測定。

1.3.2 鮮牛骨、酶解原料骨粉基本組成成分的測定

為便于開展實(shí)驗(yàn)研究，對原料鮮骨、酶解骨粉的水分、蛋白質(zhì)、脂肪及鈣含量進(jìn)行測定，每次測試均做3個(gè)平行。

1.3.3 酶解工藝條件的試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1 酶的篩選

按照酶切位點(diǎn)的不同，分別采用堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及胃蛋白酶在其各自的最適溫度、pH值條件下，統(tǒng)一底物質(zhì)量濃度為5g/ 100mL，加酶量為6000U/g對牛骨蛋白進(jìn)行水解，酶解時(shí)間為3h，每個(gè)試驗(yàn)結(jié)果均做3個(gè)平行，測定酶解產(chǎn)物的水解度、氮收率及水解液風(fēng)味來確定最佳用酶。

1.3.3.2 酶解溫度的選擇

樣品骨粉分別在50、55、60、65、70℃條件下酶解。其他酶解條件為底物質(zhì)量濃度5g/100mL、pH6.0、加酶量5000U/g、酶解4h。終止反應(yīng)后離心取上清液測定水解度和氮收率，每個(gè)試驗(yàn)結(jié)果均做3個(gè)平行，確定最佳酶解溫度。

1.3.3.3 酶解底物質(zhì)量濃度的選擇

樣品骨粉分別調(diào)整底物質(zhì)量濃度為2、3、4、5、6、7、8g/100mL。其他酶解條件為pH6.0、加酶量5000U/g、酶解溫度60℃、酶解4h，終止反應(yīng)后離心取上清液測定水解度和氮收率，每個(gè)試驗(yàn)結(jié)果均做3個(gè)平行，確定最佳底物質(zhì)量濃度。

1.3.3.4 酶解pH值的選擇

樣品骨粉分別調(diào)整體系pH值至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。其他酶解條件為底物質(zhì)量濃度5g/ 100mL、加酶量5000U/g、酶解溫度60℃、酶解4h，終止反應(yīng)后離心取上清液測定水解度和氮收率，每個(gè)試驗(yàn)結(jié)果均做3個(gè)平行，確定最佳pH值。

1.3.3.5 加酶量的選擇

取加酶量分別為1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000U/g。其他酶解條件為底物質(zhì)量濃度5g/100mL、pH6.5、酶解溫度60℃、酶解4h，終止反應(yīng)后離心取上清液測定水解度和氮收率，每個(gè)試驗(yàn)結(jié)果均做3個(gè)平行，確定最佳加酶量。

1.3.3.6 酶解時(shí)間的選擇

在以上單因素試驗(yàn)篩選的最佳條件下分別水解1、2、3、4、5、6、7、8 h。終止反應(yīng)后離心取上清液測定水解度和氮收率，每個(gè)試驗(yàn)結(jié)果均做3個(gè)平行，確定最佳酶解時(shí)間。

1.3.3.7 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上以水解度為指標(biāo)，選用底物質(zhì)量濃度、加酶量、酶解溫度、pH值4因素進(jìn)行二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)，共進(jìn)行36組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)結(jié)果測試均做3個(gè)平行，取均值進(jìn)行二次正交旋轉(zhuǎn)組合試驗(yàn)分析[6]。因素水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼表Table 1 Variables and levels in quadratic orthogonal rotation combination design

1.4 鮮牛骨、骨粉基本組成成分測定

水分：GB/T 5009.3—2003《食品中水分的測定》；蛋白質(zhì)：GB/T 50 09.5—85《食品中蛋白質(zhì)的測定》；脂肪：GB/T 147 72—2008《食品中粗脂肪的測定》；總鈣：GB/T 5009.92—2003《食品中鈣的測定》；動物蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味酶酶活的測定：SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》；游離氨基態(tài)氮含量：參照GB/T 3600—

2 0 0 0《肥料中氨態(tài)氮含量的測定：甲醛法》。

1.5 水解度的測定[7]

1.6 氮收率的測定

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS200和SAS 8.1數(shù)據(jù)處理軟件運(yùn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 鮮牛骨、酶解原料骨粉基本組成成分測定結(jié)果

表2 牛骨與酶解骨粉的成分分析Table 2 Chemical composition of bovine bone powder and its hydrolysate

由表2可看出，原料骨粉經(jīng)處理后仍含豐富蛋白質(zhì)資源，占總量的46.07%。因此，以牛骨為蛋白酶酶解的原料制備氨基酸和多肽類物質(zhì)具有理論基礎(chǔ)，有極大的開發(fā)價(jià)值。

2.2 酶制劑的確定

按照酶切位點(diǎn)的不同，分別以堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶及胃蛋白酶進(jìn)行了酶解工藝實(shí)驗(yàn)。各種不同蛋白酶的酶解條件，結(jié)果見表3。這幾種蛋白酶在其各自的最適溫度、pH值條件下，統(tǒng)一底物質(zhì)量濃度5g/100mL、加酶量6000U/g對牛骨蛋白進(jìn)行水解，結(jié)果見表4。

表3 不同蛋白酶酶解牛骨蛋白的條件Table 3 Optimal conditions for hydrolysis of bone powder with different proteases

表4 不同蛋白酶的牛骨酶解結(jié)果Table 4 Degree of hydrolysis and nitrogen recovery of bovine bone powder hydrolyzed with different proteases and sensory quality of the resulting hydrolysate

由表4可知，無論是從水解度還是氮收率來看，胃蛋白酶的酶解效果都較好，其次為木瓜蛋白酶及胰蛋白酶。這可能與各種酶的酶切位點(diǎn)及牛骨蛋白中的氨基酸組成有關(guān)。綜合考慮感官品質(zhì)，最終選取木瓜酶作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)用酶，并且木瓜蛋白酶比較經(jīng)濟(jì)適合產(chǎn)品開發(fā)使用。

2.3 酶解溫度對酶解效果的影響

圖1 酶解溫度對酶解效果的影響Fig.1 Effect of hydrolysis temperature on degree of hydrolysis and nitrogen recovery of bovine bone powder hydrolyzed with papain

由圖1可知，溫度對酶解反應(yīng)的影響較大，因?yàn)槊笇囟缺容^敏感，溫度過高或過低都會對抑制酶活，降低酶解效果。從圖中可以看出，60℃時(shí)的水解度和氮收率均最高，故選取60℃為最適酶解溫度。

2.4 底物質(zhì)量濃度對酶解效果的影響

圖2 底物質(zhì)量濃度對酶解效果的影響Fig.2 Effect of substrate concentration on degree of hydrolysis and nitrogen recovery of bovine bone powder hydrolyzed with papain

底物質(zhì)量濃度過低時(shí)，蛋白酶和底物接觸的位點(diǎn)較充分；而如果底物質(zhì)量濃度過大，阻礙了酶和底物充分接觸，則水解度和氮收率均低。從圖2可以看出，水解度和氮收率隨著底物質(zhì)量濃度的不斷升高而降低。底物質(zhì)量濃度為2g/100mL時(shí)水解度和氮收率都為最高。然而考慮到產(chǎn)品的得率及降低后期濃縮干燥的成本，因此選取木瓜蛋白酶解最適底物質(zhì)量濃度為5g/100mL。

2.5 pH值對酶解效果的影響

圖3 pH值對酶解效果的影響Fig.3 Effect of pH value on degree of hydrolysis and nitrogen recovery of bovine bone powder hydrolyzed with papain

pH值是影響酶活力的重要因素之一，因?yàn)槊敢l(fā)揮其催化功能，它的活性基團(tuán)部位必須有一定的解離形式。pH值會影響酶分子的構(gòu)象和酶分子及底物的解離狀態(tài)，從而影響酶活性和酶促反應(yīng)速度，pH值過高或過低都不利于酶解反應(yīng)[8]。從圖3可以看出，pH6.5時(shí)水解度和氮收率均為最高，故綜合考慮木瓜蛋白酶解的最適pH值為6.5。

2.6 加酶量對酶解效果的影響

圖4 加酶量對酶解效果的影響Fig.4 Effect of enzyme amount on degree of hydrolysis and nitrogen recovery of bovine bone powder hydrolyzed with papain

加酶量低時(shí)主要為酶控制反應(yīng)，加酶量高時(shí)主要為底物控制反應(yīng)；但是加酶量過高時(shí)，由于酶本身的相互水解作用加強(qiáng)，會阻礙酶對底物的酶解[9]。從圖4可看出，加酶量對酶解效果有顯著的影響；隨著加酶量的增加，水解度和氮收率都逐步上升，加酶量為6 00 0～8000U/g底物區(qū)間內(nèi)兩個(gè)指標(biāo)上升但較緩慢。綜合經(jīng)濟(jì)效益和酶解效果將木瓜蛋白酶解最適加酶量定為6000U/g底物。

2.7 酶解時(shí)間對酶解效果的影響

圖5 酶解時(shí)間對酶解效果的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis and nitrogen recovery of bovine bone powder hydrolyzed with papain

由圖5可知，水解度與氮收率呈正相關(guān)；兩指標(biāo)在前3h內(nèi)上升最快，在3～6h其值趨于平緩；7～8h之間兩指標(biāo)值略為下降。反應(yīng)時(shí)間過長，因美拉德反應(yīng)會影響酶解物的外觀顏色，還會產(chǎn)生一些短肽類的苦味物質(zhì)[10-13]；綜合考慮將酶解時(shí)間定在3h為宜，故將最佳酶解時(shí)間設(shè)為3h。

2.8 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果分析

表5 二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Quadratic orthogonal rotation combination design matrix and experimental results of degree of hydrolysis of bovine bone powder

2.8.1 數(shù)學(xué)模型的建立及擬合

二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果見表5。將試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)DPS軟件處理，得到回歸方程：

2.8.2 二次回歸模型的顯著性檢驗(yàn)

表6 方差分析表Table 6 Analysis of variance for degree of hydrolysis of bovine bone powder with various hydrolysis conditions

二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果方差分析見表6。為檢驗(yàn)回歸方程的有效性，按F1＝失擬均方/誤差均方，F(xiàn)2＝回歸均方/剩余均方，其程序進(jìn)行二次F檢驗(yàn)，擬合檢驗(yàn)F2＝18.1022＞F0.01(14,21)＝3.0715，回歸方程擬合度極高，說明此回歸模型所考慮因子足以反映試驗(yàn)中各種酶解條件對水解度的影響，該回歸方程在此試驗(yàn)中有意義。失擬檢驗(yàn)F1＝2.6397＜F0.05(10,11)＝2.8536，失擬性不顯著，說明此回歸模型中各因子的設(shè)置水平是合理的。經(jīng)計(jì)算該模型的相關(guān)系數(shù)為R2＝回歸平方和/總平方和＝464.3367/502.8127＝0.9235，R2表示方程與試驗(yàn)結(jié)果的擬合程度。表明在試驗(yàn)中各種酶解條件對水解度影響中92.35%可變性可由該模型解釋。

從回歸系數(shù)絕對值及顯著性分析可以看出，底物質(zhì)量濃度對水解度影響最大，其次是pH值和加酶量，酶解溫度影響較小。酶解底物質(zhì)量濃度和pH值對水解度的影響極顯著，加酶量和酶解溫度不顯著。各因素兩者間的交互作用均不太顯著，僅底物質(zhì)量濃度與酶解初始pH值之間有交互影響作用。

2.8.3 重建二次回歸模型

根據(jù)表6，以α＝0.10顯著水平剔除不顯著項(xiàng)后，簡化后的回歸方程為：

Y＝18.32500－2.96583X1－1.35583X4＋0.50458X12－1.04042X22－1.44292X32－1.61792X42－0.75250X1X4

2.8.4 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為了證實(shí)回歸模型與實(shí)際情況的吻合程度，通常采用頻數(shù)分析來進(jìn)行。以水解度為指標(biāo)，對最優(yōu)酶解工藝參數(shù)的預(yù)測：已知－2≤Xj≤2(j＝1，2，3，4)，取步長h＝1，共有54＝625個(gè)組合方案，取水解度為15.93%，在625個(gè)組合方案的水解度預(yù)測值中，水解度大于15.93%有136個(gè)。選取水解度大于15.93%的136個(gè)方案進(jìn)行頻數(shù)分析，以及得到95%的置信區(qū)間，結(jié)果見表7。

表7 樣品水解度大于15.93%的酶解條件Table 7 Hydrolysis conditions resulting in degree of hydrolysis of bovine bone powder of more than 15.93%, frequency analysis and 95% confidence intervals

為驗(yàn)證模型的實(shí)用性，隨機(jī)選取3組結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見表8。由表可知，3組的實(shí)測水解度與根據(jù)模型計(jì)算得到的結(jié)果誤差均小于5%；說明該模型可以較好的反映水解過程的實(shí)際情況，在實(shí)驗(yàn)中可以根據(jù)所設(shè)定的水解條件用該模型計(jì)算出水解度。

表8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 8 Predicted and experimental values of degree of hydrolysis of bovine bone powder under randomly chosen hydrolysis conditions resulting in degree of hydrolysis of bovine bone powder of more than 15.93%

2.8.5 最佳酶解方案的確定

對四元二次回歸正交旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，可以得到四因素極值點(diǎn)編碼值最優(yōu)酶解條件為X1＝

－2.0000、X2＝0.0000、X3＝0.0000、X4＝0.0000將編碼值換算成實(shí)際值，可以得到四因素的最佳酶解條件為底物質(zhì)量濃度1g/100mL、加酶量6000U/g、酶解溫度60℃、pH6.5，在此條件下獲得的水解度可達(dá)26.27%。

3 結(jié) 論

通過酶解因素試驗(yàn)，對影響酶解過程的各個(gè)因素進(jìn)行研究，初步得出酶解工藝各單因素的適宜條件：確定木瓜蛋白酶作為酶制劑、加酶量6000U/g、底物質(zhì)量濃度5g/100mL、酶解溫度60℃、pH6.5、酶解時(shí)間3h。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過DPS數(shù)據(jù)處理及SAS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)采用二次正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法對酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化。得到最佳酶解工藝條件為底物質(zhì)量濃度1g/100mL、加酶量6000U/g、酶解溫度60℃、pH6.5，在此條件下獲得的水解度高達(dá)26.27%。然而考慮到水解后固形物的產(chǎn)率，選取底物質(zhì)量濃度為5g/100mL進(jìn)行工藝實(shí)驗(yàn)，根據(jù)建立的回歸方程可得，水解度的理論值為18.33%。經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在5g/100mL的底物質(zhì)量濃度下，其水解度優(yōu)化值可達(dá)16.5%～20%，氮收率優(yōu)化值可達(dá)84.5%～92%。

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Protease Hydrolysis of Bovine Bone Power

TAN Bei-ni，MA Mei-hu*，WEI Tao
(Meat Science Institute, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

Pepsin, alkaline protease, trypsin, neutral protease and papain were used to hydrolyze bovine bone powder, respectively. According to the overall evaluation on degree of hydrolysis and nitrogen recovery of bovine bone powder and sensory quality of the resulting hydrolysate, papain was selected to prepare bovine bone hydrolysate. Single factor experiments were carried out to examine the effects of papain hydrolysis parameters including substrate concentration, enzyme amount, pH and hydrolysis time and temperature on degree of hydrolysis and nitrogen recovery of bovine bone powder. Based on this, a 4-variable, 5-level quadratic orthogonal rotation combination design involving 36 experiments was employed to investigate the optimal values of other 4 hydrolysis parameters except hydrolysis time. Results showed that the optimal hydrolysis of bovine bone powder with 6000 U/g papain for 3 h at 60 ℃, pH 6.5 and 1 g/100 mL substrate concentration resulted in a degree of hydrolysis of up to 26.27%. When the substrate concentration was adjusted to be 5 g/100 mL for the enhancement of solid content in bovine bone powder hydrolysate, a predicted value of degree of hydrolysis of 18.33% was obtained. Validation experiments gave an actual value range of 16.5% to 20% and a nitrogen recovery range of 84.5% to 92%.

bovine bone；utilization；hydrolysis conditions；quadratic orthogonal rotation combination design

TS209

A

1002-6630(2010)10-0020-06

2009-08-25

“十一五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD05A16)

譚貝妮(1984—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)食品科學(xué)與生物技術(shù)。E-mail：tanbeini@yahoo.com.cn

*通信作者：馬美湖(1957—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槿忸?、蛋品科學(xué)理論與技術(shù)。E-mail：mameihuhn@yahoo.com.cn