董洪新，程顯好，朱 林，蔡德華，李 玉*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所，吉林 長春 130118；2.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025)

豬肚菇子實(shí)體發(fā)育過程中抗氧化酶活性的變化

董洪新1,2，程顯好2，朱 林2，蔡德華2，李 玉1,*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物研究所，吉林 長春 130118；2.魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025)

研究豬肚菇子實(shí)體不同發(fā)育時(shí)期膜脂過氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)的活性變化情況。結(jié)果表明：隨著豬肚菇子實(shí)體生長和衰老，子實(shí)體中MDA逐漸積累，膜脂過氧化程度加重；SOD和CAT活性先升高后降低，SOD、CAT活性最高值分別出現(xiàn)在杯形期和釘頭期，而POD活性則基本穩(wěn)定。因此，活性氧代謝失調(diào)引發(fā)的生物膜結(jié)構(gòu)破壞是豬肚菇子實(shí)體衰老的重要原因之一。關(guān)鍵詞：豬肚菇；子實(shí)體；發(fā)育；抗氧化酶

自由基學(xué)說認(rèn)為，生物衰老過程是活性氧大量積累與代謝失調(diào)的過程[1]。近來研究發(fā)現(xiàn)活性氧可能作為第二信使參與生物體內(nèi)的代謝及生命活動(dòng)[2]。生物在正?；蚍钦４x進(jìn)程中可通過多種途徑產(chǎn)生活性氧自由基，同時(shí)它們又存在著清除這些自由基的機(jī)制, 包括保護(hù)酶系統(tǒng)，如過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等和非保護(hù)酶系統(tǒng)，如VC、類胡蘿卜素、VE等。生物種類的不同，表現(xiàn)出活性氧代謝各因素間相互作用的復(fù)雜性和多樣性。近來關(guān)于抗氧化酶活性的相關(guān)研究報(bào)道多集中在小麥、果蔬、花卉等植物上[3-5]，而對(duì)衰老過程中食用菌子實(shí)體抗氧化酶的響應(yīng)及調(diào)節(jié)機(jī)理則未見報(bào)道。

豬肚菇(Panus giganteus)又名大杯香菇、大革耳等，是國內(nèi)近年來新開發(fā)的一種珍稀食用菌，其口感風(fēng)味獨(dú)特，有豬肚般的滑膩，因此而得其商品名[6-7]。豬肚菇子實(shí)體的菌肉肥厚，質(zhì)地細(xì)膩，脆嫩可口，湯汁鮮美營養(yǎng)豐富，其生長條件粗獷，適用原料廣泛，且在夏季出菇，對(duì)于解決食用菌生產(chǎn)淡季和調(diào)節(jié)市場(chǎng)供應(yīng)很有意義，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。豬肚菇子實(shí)體發(fā)育和衰老過程中，在形態(tài)上有典型的4個(gè)時(shí)期，可以代表其發(fā)育和衰老的不同階段，是研究子實(shí)體發(fā)育和衰老的好材料。大型真菌子實(shí)體的形成和衰老是十分復(fù)雜的生理生化過程，研究子實(shí)體形成和衰老機(jī)理，對(duì)于調(diào)節(jié)大型真菌子實(shí)體發(fā)育，具有重要理論和實(shí)踐意義。本研究以豬肚菇為研究材料，探究子實(shí)體形成和衰老過程中其細(xì)胞抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化情況，為揭示其抗衰老機(jī)理提供理論依據(jù)，同時(shí)對(duì)理解子實(shí)體生理代謝規(guī)律具一定意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

供試菌株豬肚菇 LD-1 魯東大學(xué)食用菌工程技術(shù)研究中心。

葡萄糖、KH2PO4等試劑均為國產(chǎn)分析純；氮藍(lán)四唑(NBT)為進(jìn)口分裝。

752N型紫外-可見分光光度計(jì)、冷凍離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 子實(shí)體培養(yǎng)

將培養(yǎng)料按照配方(棉籽殼83%，麩皮15%，石灰2%，含水量63%)拌料、裝袋，滅菌、接種和培養(yǎng)，菌絲滿袋后移入栽培室采用袋內(nèi)覆土出菇，覆土厚度3～4cm。栽培室溫度在23～32℃，空氣相對(duì)濕度 90%～92%。待子實(shí)體形成后，分別采集不同發(fā)育階段的子實(shí)體樣品，采摘后的子實(shí)體放于冰盒中，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，用于生理指標(biāo)測(cè)定。

1.2.2 酶活性及MDA 含量的測(cè)定

超氧化物歧化酶(SOD)的活性以(NBT)光化還原法測(cè)定，以A560nm下抑制NBT還原的50%所需的酶量為SOD的一個(gè)酶活單位(U)，用U/g表示；過氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定采用紫外吸收法，過氧化物酶(POD)活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，在一級(jí)反應(yīng)范圍內(nèi)，分別以每分鐘內(nèi)A240和A470變化0.01為 CAT和POD的一個(gè)酶活單位(U)，用U/(mg·min)表示。

MDA含量測(cè)定：硫代巴比妥酸(TBA)比色法測(cè)定[8]。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2003和 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及差異顯著性檢驗(yàn)，所有數(shù)值均為3次重復(fù)平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬肚菇子實(shí)體不同發(fā)育階段形態(tài)的變化

豬肚菇子實(shí)體發(fā)育的各個(gè)階段形態(tài)差別較大，大致劃分為如圖1所示4個(gè)時(shí)期。圖1a為棒形期，此期為子實(shí)體發(fā)育的初級(jí)階段，即原基形成期，原基初期白色，球形或似卵形，后長成倒棒形。出土部分見光變灰色，逐步加深至鼠灰色或黑褐色。表面有灰白色鱗片。圖1b為釘頭期，此期為原基分化，菌蓋、菌柄、菌褶等器官形成期，棒形原基頂端細(xì)胞迅速增殖長成釘頭狀，縱切可見菌蓋、菌褶和碩長的菌柄。內(nèi)菌幕未破裂或剛破裂。圖1c為杯形期，此期菌蓋迅速發(fā)育，中部菌肉增厚，內(nèi)菌幕破裂，露出片狀菌褶。蓋頂平至下凹，顏色由蓋沿開始逐漸變淺。圖1d為成熟期，菌蓋完全伸展，菌肉變薄，顏色變淺，蓋緣平直至波曲，釋放出擔(dān)孢子。

圖1 豬肚菇子實(shí)體發(fā)育的4個(gè)時(shí)期Fig.1 Four stages of fruit body development for Panus giganteus

2.2 豬肚菇子實(shí)體不同發(fā)育階段SOD活性變化

圖2 豬肚菇子實(shí)體不同發(fā)育時(shí)期的SOD活性變化Fig.2 Change in SOD activity during fruit body development of Panus giganteus

如圖 2所示，豬肚菇子實(shí)體發(fā)育過程中，各個(gè)時(shí)期SOD活性達(dá)到顯著差異(P＜0.05)，其子實(shí)體中SOD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，即由棒形期到杯形期發(fā)育期間，子實(shí)體中SOD逐漸增加，在杯形期 SOD活性達(dá)到最大，杯形期菌蓋 SOD活性是棒形期的 3.5倍，杯形期菌柄 SOD活性是棒狀期的 3.2倍。隨后 SOD活性開始降低，成熟期菌柄SOD活性明顯低于杯形期。

在杯形期和成熟期，菌蓋和菌柄的 SOD含量都達(dá)到差異顯著(P＜0.05)，菌蓋中 SOD含量顯著高于菌柄。菌蓋的生理代謝活動(dòng)比菌柄更活躍，在研究大型真菌對(duì)于金屬離子的吸收和富集過程中也發(fā)現(xiàn)，富集的金屬離子在子實(shí)層中含量最高，其次是菌蓋部分，而菌柄中含量最低[9]。

SOD廣泛分布于細(xì)胞各組成部分，是防御自由基危害的第一道防線，催化O2-·或 HO·歧化為H2O2，一定程度上控制著活性氧(ROS)的含量，但其活性又受ROS的影響。對(duì)環(huán)境變化比較敏感。在豬肚菇子實(shí)體發(fā)育過程中，也表現(xiàn)出不同階段的明顯差異。

2.3 豬肚菇子實(shí)體不同發(fā)育階段POD 活性的變化

過氧化物酶(POD)是以過氧化氫為電子受體催化底物氧化的酶。主要存在于細(xì)胞的過氧化物酶體中，以鐵卟啉為輔基，可催化過氧化氫、氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。如圖 3 所示，在豬肚菇子實(shí)體生長和衰老過程中，與SOD活性的變化趨勢(shì)不同，POD活性基本保持穩(wěn)定。

植物衰老過程中，其POD變化趨勢(shì)隨植物種類不同而不同。如荔枝、獼猴桃、胡柚等果實(shí)隨貯藏時(shí)間延長，POD活性增強(qiáng)，認(rèn)為POD活性升高可以作為果實(shí)衰老的指標(biāo)；而杏果實(shí)成熟衰老過程中，POD活性則呈下降趨勢(shì)[10]。豬肚菇子實(shí)體生長和衰老過程中，無論菌柄還是菌蓋，其POD活性都基本保持穩(wěn)定，所以不宜作為子實(shí)體衰老的生理指標(biāo)。POD活性在子實(shí)體發(fā)育過程中保持基本穩(wěn)定屬于食用菌的普遍現(xiàn)象還是個(gè)例現(xiàn)象，需要進(jìn)一步研究和探討。

圖3 豬肚菇子實(shí)體不同發(fā)育時(shí)期的POD活性變化Fig. 3 Change in POD activity during fruit body development of Panus giganteus

2.4 豬肚菇子實(shí)體不同發(fā)育階段CAT 活性的變化

CAT主要存在于過氧化物體，線粒體和乙醛酸循環(huán)體中，CAT是細(xì)胞內(nèi)H2O2的重要清除劑，但CAT清除H2O2的效率非常低，CAT活性顯著下降會(huì)造成H2O2積累。胞內(nèi)H2O2不能及時(shí)清除，可與過量的O2·生成氧化性更強(qiáng)的·OH。

從圖 4可以看出，CAT活性從棒形期到釘頭期迅速升高，然后逐漸降低。與SOD活性變化相比CAT活性高峰期的出現(xiàn)較早，在釘頭期達(dá)到最高。在杯形期和成熟期，菌蓋和菌柄之間的CAT酶活都達(dá)到差異顯著(P＜0.05)，在杯形期的CAT活性菌蓋高于菌柄，而在成熟期的CAT活性菌蓋低于菌柄。

圖4 豬肚菇子實(shí)體不同發(fā)育時(shí)期的CAT活性變化Fig.4 Change in CAT activity during fruit body development of Panus giganteus

2.5 豬肚菇子實(shí)體不同發(fā)育階段MDA含量的變化

膜的穩(wěn)定性是生物衰老過程中的重要生理指標(biāo)。膜脂過氧化加劇會(huì)導(dǎo)致膜脂不飽和度降低，膜流動(dòng)性下降，對(duì)為膜所束縛的細(xì)胞酸性磷酸脂酶起明顯的增溶作用，膜脂分子構(gòu)象發(fā)生改變，致使細(xì)胞膜透性增強(qiáng)[11]。丙二醛(MDA)是細(xì)胞膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，MDA在生物體內(nèi)的積累是活性氧毒害的表現(xiàn)，其含量是判斷膜脂過氧化程度的一個(gè)重要指標(biāo)。

由圖 5可知，隨著豬肚菇子實(shí)體的生長和衰老，子實(shí)體中MDA含量逐漸增加，到成熟期時(shí)，MDA含量明顯增加，其含量為棒形期的6.84倍，表明細(xì)胞膜膜脂過氧化程度加劇。所以MDA含量明顯增加，可以作為豬肚菇子實(shí)體衰老的主要指標(biāo)。

圖5 豬肚菇子實(shí)體不同發(fā)育時(shí)期的MDAs含量變化Fig.5 Change in MDA content during fruit body development of Panus giganteus

3 討 論

在正常情況下植物體內(nèi)有一套完整的活性氧清除系統(tǒng)(抗氧化酶和抗氧化劑)能將活性氧的產(chǎn)生和清除維持在動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。SOD是植物氧代謝過程中的一個(gè)極為重要的誘導(dǎo)酶，它能催化超氧陰離子自由基歧化反應(yīng)成為基態(tài)的分子氧和H2O2，并與 POD和 CAT組成活性氧防御酶系統(tǒng)[12-13]?？寡趸富钚宰兓c子實(shí)體衰老密切相關(guān)。在衰老過程中活性氧大量產(chǎn)生，生物體可通過抗氧化保護(hù)酶系統(tǒng)中的 SOD、POD、CAT和 APX來調(diào)節(jié)活性氧產(chǎn)生與清除之間的平衡。

該實(shí)驗(yàn)中，隨著子實(shí)體生長和衰老的進(jìn)行，子實(shí)體中SOD活性開始增加，這可能是生物抗氧化衰老的一種防衛(wèi)響應(yīng)，隨著活性氧物質(zhì)的增加，防御系統(tǒng)進(jìn)一步啟動(dòng)，子實(shí)體中CAT活性進(jìn)一步升高，起到協(xié)助清除活性氧物質(zhì)的作用。但是，隨著衰老的不可逆轉(zhuǎn)，整個(gè)防御系統(tǒng)遭到破壞，SOD、CAT的活性隨之降低，MDA含量迅速升高。但豬肚菇子實(shí)體生長和衰老進(jìn)程中，POD活性則基本保持穩(wěn)定。因此，活性氧代謝失調(diào)引發(fā)的生物膜結(jié)構(gòu)破壞是豬肚菇子實(shí)體衰老的重要原因之一。

自由基引起的衰老理論在近半個(gè)多世紀(jì)以來得到了人們的廣泛關(guān)注，很多研究證實(shí)衰老過程中CAT、SOD、POD等抗氧化酶的活性均降低，導(dǎo)致自由基代謝產(chǎn)物增高，致使線粒體結(jié)構(gòu)的損傷，氧化呼吸傳遞鏈傳遞受阻，使自由基的生成量進(jìn)一步增加，從而加速了衰老進(jìn)程[14]。Orr等[15]將銅(Cu)鋅(Zn)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶基因(sod與cat)導(dǎo)入果蠅，使其平均壽命和最高壽限都不同程度得到了延長，與之相關(guān)的與蛋白質(zhì)的氧化損傷現(xiàn)象減輕。從本實(shí)驗(yàn)得知，在豬肚菇子實(shí)體生長階段，CAT和SOD活性維持在較高水平，活性氧自由基的水平亦較低；但在衰老階段，CAT和SOD活性明顯下降，致使自由基水平提高，并導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷加劇。另外，CAT和SOD的活性隨豬肚菇子實(shí)體的發(fā)育階段的不同呈現(xiàn)明顯變化的特點(diǎn)，表明除MDA水平之外，CAT和SOD的活性也可以作為豬肚菇子實(shí)體的衰老標(biāo)記。因此，如果能利用合適的技術(shù)手段從生理水平上提高CAT和SOD的活性，將能延緩其衰老過程，延長豬肚菇的貨架期，這需要今后進(jìn)一步深入研究。

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Change of Antioxidant Enzyme Activities in Fruit Body Development Process of Panus giganteus

DONG Hong-xin1,2，CHENG Xian-hao2，ZHU Lin2，CAI De-hua2，LI Yu1,*
(1. Institute of Mycology, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China；2. College of Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China)

In this stady, the change in the content of malonaldehyde (MDA) and the activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) in fruit body of Panus giganteus during its development process were investigated. Results indicated that MDA content exhibited a gradual accumulation and the membrane lipid peroxidation was increased; meanwhile, the activities of SOD and CAT exhibited an initial increase and a final decrease trend; the highest activity of SOD and CAT was observed in the cup stage and pin-head stage. However, POD activity was stable during the stage of growth and senescence. Therefore, the metabolic disorder induced by the accumulation of active oxygen species was one of important factors for the senescence of Panus giganteus.

Panus giganteus；fruiting body；development；antioxidant enzymes

S646.9

A

1002-6630(2010)24-0469-04

2010-03-24

“十一五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BADA1B04)；山東省農(nóng)業(yè)良種工程項(xiàng)目(2008LZ-008)

董洪新(1976—)，男，講師，博士研究生，研究方向?yàn)槭秤镁耘唷-mail：ytdhx@163.com

*通信作者：李玉(1944—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)榫飳W(xué)。E-mail：yuli966@126.com