王 闖，李大婧,,*，宋江峰，劉春泉

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.國(guó)家農(nóng)業(yè)科技華東(江蘇)創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014)

萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化工藝的優(yōu)化

王 闖1，李大婧1,2,3,*，宋江峰2,3，劉春泉2,3

(1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.國(guó)家農(nóng)業(yè)科技華東(江蘇)創(chuàng)新中心農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014)

以萬(wàn)壽菊干花顆粒為原料，對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素進(jìn)行同時(shí)提取皂化工藝研究?？疾觳煌袡C(jī)溶劑和用量、KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度和用量、提取皂化溫度和時(shí)間等因素對(duì)反式葉黃素提取皂化效果的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法對(duì)影響萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的3個(gè)主要因素即石油醚用量、KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度和提取皂化溫度進(jìn)行優(yōu)化，建立并分析各因素與反式葉黃素得率關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，同時(shí)對(duì)反式葉黃素粗品進(jìn)一步分離純化。結(jié)果表明：采用有機(jī)溶劑法進(jìn)行同時(shí)提取皂化的最佳工藝條件為石油醚用量42.6mL/g、溫度58.8℃、KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度0.099g/mL，在此條件下反式葉黃素得率為1.499%。對(duì)反式葉黃素粗品進(jìn)一步純化，最終獲得純度達(dá)90.42%的反式葉黃素晶體。

萬(wàn)壽菊；反式葉黃素；提取皂化；響應(yīng)曲面法；純化

葉黃素，是一種含氧類(lèi)胡蘿卜素，含有多個(gè)共軛雙鍵，在理論上存在8種立體異構(gòu)體，包括Z-和E-異構(gòu)體(常稱(chēng)為順式和反式異構(gòu)體)，但由于葉黃素的甲基取代作用，只有9-Z、13-Z和15-Z異構(gòu)體(和9＇-Z和13＇-Z)存在，葉黃素全反式的化學(xué)構(gòu)象最為穩(wěn)定，分子結(jié)構(gòu)如圖1，在生物體內(nèi)反式構(gòu)象的活性也較順式構(gòu)象高很多[1]。葉黃素是眼睛組織視網(wǎng)膜中的主要類(lèi)胡蘿卜素抗氧化成分，可預(yù)防老年性眼球視網(wǎng)膜黃斑退化引起的視力退化和失明癥[2-3]。此外，葉黃素含有的共軛雙鍵不僅賦予其顏色特征，也使其在疾病防治中具有較強(qiáng)的抗氧化功能，它們能阻止或預(yù)防癌癥、抗誘變、動(dòng)脈硬化、白內(nèi)障等疾病[4-6]。

圖1 全反式葉黃素分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of trans-lutein

萬(wàn)壽菊花中葉黃素含量高，其他類(lèi)胡蘿卜素雜質(zhì)少，主要為葉黃素與月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸等飽和脂肪酸形成的酯，游離葉黃素含量很低。研究表明，葉黃素酯類(lèi)衍生物不能被人體直接吸收代謝，必須先轉(zhuǎn)化成游離葉黃素才能被人體吸收利用，因此對(duì)葉黃素酯類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行皂化，制備成游離葉黃素十分必要[7-9]。國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)葉黃素的方法大多采用提取、皂化、分離、純化等步驟，其中，提取和皂化較為費(fèi)時(shí)，若能將這兩步同時(shí)進(jìn)行，可以減少制備葉黃素酯這一復(fù)雜工藝，縮短制備時(shí)間。葉黃素傳統(tǒng)的純化方法是柱層析和重結(jié)晶，得到結(jié)晶葉黃素純度很高，達(dá)95%以上，但柱層析需要消耗大量溶劑，費(fèi)時(shí)費(fèi)力不經(jīng)濟(jì)；而重結(jié)晶大多使用了含氯有機(jī)溶劑，應(yīng)用受到限制[10-11]，故應(yīng)尋找一種相對(duì)安全、經(jīng)濟(jì)的純化方法。

國(guó)內(nèi)外對(duì)萬(wàn)壽菊花中葉黃素的分析方法研究較多，主要采用AOAC法或HPLC分析，大都選用C18柱進(jìn)行分離，只能分離檢測(cè)出游離葉黃素。C30柱是繼C18柱之后又一廣泛應(yīng)用的反相吸附色譜固定相，在分離類(lèi)胡蘿卜素幾何異構(gòu)體方面顯示出優(yōu)勢(shì)，可以準(zhǔn)確檢測(cè)出反式葉黃素含量[12-14]。

在已有的報(bào)道中，對(duì)萬(wàn)壽菊葉黃素提取及皂化條件的優(yōu)化多采用正交設(shè)計(jì)法[15-16]，側(cè)重于科學(xué)地合理安排實(shí)驗(yàn)，減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)，而在尋找因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系及各因素之間交互作用方面尚顯不足。響應(yīng)曲面法已被廣泛應(yīng)用于生物過(guò)程的優(yōu)化，但在葉黃素提取皂化工藝研究方面仍是空白。因此本實(shí)驗(yàn)擬采用有機(jī)溶劑法進(jìn)行反式葉黃素同時(shí)提取皂化工藝研究，通過(guò)響應(yīng)曲面法優(yōu)選最佳工藝參數(shù)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用這一天然色素提供參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

萬(wàn)壽菊干花顆粒 云南曲靖博浩生物科技股份有限公司。

石油醚(沸程30～60℃)、THF(四氫呋喃)、乙酸乙酯、丙酮、正己烷、無(wú)水乙醇、氫氧化鉀(均為分析純)；MTBE(甲基叔丁基醚)、甲醇(均為色譜純)；反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品(97%) 美國(guó)Fluka公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S恒溫水浴鍋 江蘇金壇市恒豐儀器廠；TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；RE-52A真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；LGJ-12冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；FA2104電子分析天平 上海恒平科學(xué)儀器有限公司；HPLC1200高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜分析條件

色譜柱為YMC Carotenoid S-5(4.6mm×250mm)，流動(dòng)相：甲醇-MTBE=95:5(V/V)，流速1.0mL/min，柱溫25℃，進(jìn)樣量20μL，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱(chēng)取1mg反式葉黃素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容于25mL容量瓶中，混勻，制成質(zhì)量濃度40μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。再分別取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL標(biāo)準(zhǔn)液置于10mL容量瓶中，混勻，制成2、4、6、8、10μg/mL反式葉黃素系列標(biāo)準(zhǔn)液。按照1.3.1節(jié)所述色譜條件分析，以反式葉黃素峰面積為縱坐標(biāo)，反式葉黃素系列標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=187.62X-97.07，R2=0.9992。

1.3.3 萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化工藝

將萬(wàn)壽菊干花顆粒粉碎過(guò)20目篩，準(zhǔn)確稱(chēng)取萬(wàn)壽菊花粉1.00g，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求加入有機(jī)溶劑、KOH-乙醇溶液進(jìn)行水浴加熱回流提取皂化處理，提取結(jié)束后趁熱過(guò)濾，殘?jiān)礈靸纱?，合并濾液及洗滌液。將濾液真空濃縮至無(wú)餾出液，加入60mL 50%乙醇溶液，用醋酸水溶液調(diào)pH值至中性，離心去除上清液，沉淀物經(jīng)真空冷凍干燥得到反式葉黃素粗品。將反式葉黃素粗品用甲醇溶解稀釋?zhuān)肏PLC分析測(cè)定反式葉黃素含量，同時(shí)計(jì)算反式葉黃素得率。上述操作均在避光條件下進(jìn)行。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

本試驗(yàn)中主要考慮不同有機(jī)溶劑和用量、KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度和用量、提取皂化溫度和時(shí)間作為萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化過(guò)程的影響因素。在單因素試驗(yàn)中采用如1.3.3節(jié)所述的方法進(jìn)行萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素的提取皂化處理，用反式葉黃素得率評(píng)價(jià)試驗(yàn)效果。

1.3.4.1 有機(jī)溶劑對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響

有機(jī)溶劑用量40mL/g、KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度0.10g/mL、KOH-乙醇溶液用量15mL/g、提取皂化溫度60℃、提取皂化時(shí)間3h，研究有機(jī)溶劑乙酸乙酯、丙酮、石油醚、正己烷和THF對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響。

1.3.4.2 有機(jī)溶劑用量對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響

KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度0.10g/mL、KOH-乙醇溶液用量15mL/g、提取皂化溫度60℃，提取皂化時(shí)間3h，研究石油醚用量10、20、30、40、50mL/g時(shí)對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響。

1.3.4.3 KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響

在石油醚用量40mL/g、KOH-乙醇溶液用量15mL/g、提取皂化溫度60℃、提取皂化時(shí)間3h、研究KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度為0.02、0.06、0.10、0.14、0.18g/mL時(shí)對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響。

1.3.4.4 KOH-乙醇溶液用量對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響

石油醚用量40mL/g、KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度0.10g/mL、提取皂化溫度60℃、提取皂化時(shí)間3h，研究KOH-乙醇溶液用量為5、10、15、20、25mL/g時(shí)對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響。

1.3.4.5 提取皂化溫度對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響

石油醚用量40mL/g、KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度0.10g/mL、KOH-乙醇溶液用量20mL/g、提取皂化時(shí)間3h，研究提取皂化溫度40、50、60、70、80℃時(shí)對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響。

1.3.4.6 提取皂化時(shí)間對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響

石油醚用量40mL/g、KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度0.10g/ mL、KOH-乙醇溶液用量20mL/g、提取皂化溫度60℃，研究提取皂化時(shí)間為1、2、3、4、5h時(shí)對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響。

1.3.5 響應(yīng)曲面法優(yōu)選萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化工藝參數(shù)

表1 萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for optimizing extraction and saponification of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，用石油醚作為提取溶劑，確定提取皂化時(shí)間3h，KOH-乙醇溶液用量20mL/g，以石油醚用量(X1)、提取皂化溫度(X2)和KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度(X3)3個(gè)因素與反式葉黃素得率進(jìn)行響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)(表1)，優(yōu)化萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化工藝。通過(guò)Design Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，確定最佳工藝參數(shù)。

1.3.6 葉黃素粗品的進(jìn)一步純化

將1.3.3節(jié)中得到的反式葉黃素粗品用乙酸乙酯溶解，并用去離子水沖洗去除多余的皂化物質(zhì)和水溶性雜質(zhì)，將乙酸乙酯相減壓濃縮，回收溶劑。向濃縮物中加入4倍體積的正己烷-丙酮混合溶劑(體積比為4:1)，并在室溫下靜置30min后過(guò)濾，再分別用少量0～5℃無(wú)水乙醇和去離子水洗滌，經(jīng)真空冷凍干燥制得反式葉黃素晶體。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同有機(jī)溶劑對(duì)萬(wàn)壽菊花中葉黃素提取皂化效果的影響

圖2 不同有機(jī)溶劑對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響Fig.2 Effect of organic solvent type on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

由圖2可見(jiàn)，用石油醚作為提取溶劑，反式葉黃素得率最高，為1.467%，乙酸乙酯得率最低，為0.255%。原因可能是由于石油醚極性較低，對(duì)葉黃素脂肪酸酯的溶解性最大，使得皂化反應(yīng)比較充分。THF對(duì)游離態(tài)的葉黃素溶解性最大，目前許多人應(yīng)用THF提取葉黃素，然而有研究表明THF容易形成過(guò)氧化物，可能會(huì)導(dǎo)致葉黃素的分解[17]。因此，對(duì)萬(wàn)壽菊干花顆粒中反式葉黃素的提取可選用石油醚，而且石油醚在后續(xù)分離提純工序中易于除去。

2.1.2 有機(jī)溶劑用量對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響

液固比是提取過(guò)程的一個(gè)重要影響因素，液固比的大小會(huì)影響兩相的混合情況。尤其在攪拌不充分的情況下，會(huì)改變表觀傳質(zhì)系數(shù)，從而影響傳質(zhì)速率[18]。液固比的提高必然會(huì)在較大程度上提高傳質(zhì)推動(dòng)力，但也提高了生產(chǎn)成本及后續(xù)處理的難度，所以液固比不宜過(guò)高。由圖3可知，選擇有機(jī)溶劑石油醚用量40mL/g比較合適。

圖3 石油醚用量對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響Fig.3 Effect of petroleum ether amount on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

2.1.3KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響

圖4 KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響Fig.4 Effect of KOH-ethanol concentration on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

由圖4可見(jiàn)，KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度在0.02～0.18g/ mL范圍內(nèi)，隨著KOH質(zhì)量濃度的增加，皂化產(chǎn)品中反式葉黃素得率逐漸升高，高于0.10g/mL則有下降趨勢(shì)。可能是由于反式葉黃素在強(qiáng)堿環(huán)境會(huì)分解，使得其得率降低，因此選用0.10g/mL的KOH-乙醇溶液為皂化液。

2.1.4KOH-乙醇溶液用量對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響

由圖5可見(jiàn)，KOH-乙醇溶液用量在5～25mL/g范圍內(nèi)，隨著KOH-乙醇溶液用量的增加，皂化產(chǎn)品中反式葉黃素得率逐漸升高，高于20mL/g則有下降趨勢(shì)。主要是由于KOH-乙醇溶液體積增大，導(dǎo)致強(qiáng)堿性環(huán)境中游離的反式葉黃素易于發(fā)生分解，而且在提取皂化處理過(guò)程中需要耗費(fèi)大量的酸中和、去離子水洗滌，從而也造成反式葉黃素的損失，因此選擇KOH-乙醇溶液用量為20mL/g。

圖5 KOH-乙醇溶液用量對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響Fig.5 Effect of KOH-ethanol amount on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

2.1.5 提取皂化溫度對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響

圖6 溫度對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

由圖6可見(jiàn)，提取皂化溫度在40～80℃范圍內(nèi)，皂化產(chǎn)品中反式葉黃素得率呈先上升，隨后下降的趨勢(shì)。由于溫度過(guò)低，不利于提取出來(lái)的葉黃素酯在皂化體系中分散，易導(dǎo)致皂化不完全，而溫度過(guò)高則會(huì)導(dǎo)致游離反式葉黃素的降解和異構(gòu)化，導(dǎo)致產(chǎn)品中反式葉黃素得率下降。因此，提取皂化溫度控制在60℃為宜。

圖7 提取皂化時(shí)間對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響Fig.7 Effect of extraction time on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

2.1.6 提取皂化時(shí)間對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果的影響由圖7可見(jiàn)，當(dāng)提取皂化時(shí)間小于3h時(shí)，隨著提取皂化時(shí)間的延長(zhǎng)，皂化產(chǎn)品中反式葉黃素得率呈逐漸增大的趨勢(shì)。當(dāng)提取皂化時(shí)間超過(guò)3h時(shí)，反式葉黃素得率有所下降。這是因?yàn)殡S著時(shí)間的延長(zhǎng)，反式葉黃素在堿性條件下易發(fā)生氧化和異構(gòu)化，故提取皂化時(shí)間以3h為宜。

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化工藝

表2 萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of response surface experiments for optimizing the extraction and saponification of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對(duì)石油醚用量(X1)、提取皂化溫度(X2)和KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度(X3)進(jìn)行了三因素三水平響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。利用Design Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到反式葉黃素得率預(yù)測(cè)值(y)對(duì)編碼自變量x1、x2和x3的二次多元回歸方程：

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析(表3)，結(jié)果表明，模型極顯著(P＜0.0001)，失擬檢驗(yàn)不顯著，回歸模型的調(diào)整確定系數(shù)為0.9568，說(shuō)明該模型能夠解釋95.68%的變化，因此，可用此模型對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

從表4回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知：模型(1)一次項(xiàng)x1、x2、x3均處于顯著水平；二次項(xiàng)x32極顯著，x12、x22顯著；交互項(xiàng)x1x3顯著，x1x2、x2x3均不顯著。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 Variance analysis of regression equation

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Table 4 Significance test for regression coefficients

利用Design Expert軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見(jiàn)圖8～10。

圖8 提取皂化溫度和石油醚用量對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.8 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between extraction temperature and petroleum ether amount on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

當(dāng)KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度為0.10g/mL時(shí)，提取皂化溫度和石油醚用量對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取效果影響見(jiàn)圖8。石油醚用量不變時(shí)，提取皂化溫度在55～65℃范圍內(nèi)，反式葉黃素得率隨著溫度的增加而增加，當(dāng)提取皂化溫度達(dá)到一定值后，反式葉黃素得率逐漸下降。提取皂化溫度一定時(shí)，石油醚用量在35～45mL/g范圍內(nèi)，反式葉黃素得率先逐漸增加，達(dá)到極大值后逐漸下降。

圖9 KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度和石油醚用量對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化效果影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.9 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between KOH-ethanol concentration and petroleum ether amount on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

當(dāng)提取皂化溫度為60℃時(shí)，KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度和石油醚用量對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取效果的影響見(jiàn)圖9。石油醚用量不變，KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度在0.05～0.15g/mL范圍內(nèi)，反式葉黃素得率隨著KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度的增加而增加，當(dāng)KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度達(dá)到一定值后，反式葉黃素得率呈逐漸下降的趨勢(shì)。KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度一定時(shí)，石油醚用量在35～45mL/g范圍內(nèi)，反式葉黃素得率先逐漸增加，達(dá)到極大值，隨后逐漸下降。

當(dāng)石油醚用量40mL/g，KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度和提取皂化溫度對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取效果的影響見(jiàn)圖10。當(dāng)提取皂化溫度不變時(shí)，KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度在0.05～0.15g/mL范圍內(nèi)，隨著KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度的增加，反式葉黃素得率增加，當(dāng)KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度達(dá)到一定值后，得率逐漸下降。KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度恒定，在溫度55～65℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，反式葉黃素得率增加，但超過(guò)一定值后溫度的升高對(duì)反式葉黃素得率的影響卻發(fā)展為負(fù)面效應(yīng)。

圖10 KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度和提取皂化溫度對(duì)萬(wàn)壽菊花中葉黃素提取皂化效果影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.10 Response surface and contour plots for the effect of crossinteraction between KOH-ethanol concentration and extraction temperature on extraction and saponification efficiency of trans-lutein from marigold (Tagetes erecta) flowers

為了進(jìn)一步確定最佳點(diǎn)，對(duì)模型(1)取一階偏導(dǎo)等于零并整理得：

求解方程得到最佳工藝參數(shù)石油醚用量42.6mL/g、溫度58.8℃、KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度0.099g/mL，在此條件下，反式葉黃素得率可達(dá)1.494%。按優(yōu)化工藝進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，反式葉黃素的得率為(1.499±0.008)%，與傳統(tǒng)工藝(正己烷萃取、KOH-乙醇溶液皂化、水洗滌后離心分離得到葉黃素粗品，反式葉黃素得率1.352%)相比，得率提高了10.87%，另外同時(shí)提取皂化簡(jiǎn)化工藝，溶劑消耗量小，且整個(gè)反應(yīng)過(guò)程只需3h，可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中。

2.3 反式葉黃素粗品的純化

圖11 反式葉黃素晶體HPLC色譜圖Fig.11 HPLC chromatogram of trans-lutein crystal

反式葉黃素粗品經(jīng)乙酸乙酯分離后，先用去離子水洗滌去除水溶性雜質(zhì)，然后用正己烷-丙酮復(fù)合溶劑洗滌去除脂溶性雜質(zhì)，最后用冷乙醇和水洗滌可以除去大部分的有機(jī)溶劑，并使葉黃素的損失降到最低，經(jīng)純化后，得到反式葉黃素晶體，純度達(dá)到90.42%，與傳統(tǒng)純化方法獲得的葉黃素晶體純度相當(dāng)。反式葉黃素晶體HPLC色譜圖如圖11所示，與反式葉黃素標(biāo)品出峰時(shí)間一致，經(jīng)光電二極管陣列檢測(cè)器(DAD)檢測(cè)分析，其相似度達(dá)到98.9%。

3 結(jié) 論

本研究將萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素的提取與皂化過(guò)程同時(shí)進(jìn)行，簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)葉黃素的制備工藝。由于提取與皂化過(guò)程的同時(shí)進(jìn)行，使得萬(wàn)壽菊花中葉黃素酯充分溶出，從而提高反應(yīng)效率，縮短了制備時(shí)間，避免了游離葉黃素長(zhǎng)時(shí)間接觸空氣而氧化和異構(gòu)化。

應(yīng)用響應(yīng)曲面法對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素的提取皂化工藝進(jìn)行了探討，對(duì)萬(wàn)壽菊花中反式葉黃素提取皂化工藝條件中有機(jī)溶劑用量、KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度、提取皂化溫度的最優(yōu)化組合問(wèn)題進(jìn)行了定量研究，建立了具有良好預(yù)測(cè)性能的萬(wàn)壽菊葉黃素提取皂化條件的模型，并獲得最佳工藝條件為石油醚用量42.6mL/g、溫度58.8℃、KOH-乙醇溶液質(zhì)量濃度0.099g/mL時(shí)，反式葉黃素得率為(1.499±0.008)%。

反式葉黃素粗品經(jīng)純化后，最終獲得高純度的反式葉黃素晶體純度達(dá)90%以上，生物活性高，沒(méi)有使用傳統(tǒng)的純化方式如凝膠柱層析或重結(jié)晶，得到產(chǎn)品相對(duì)安全、經(jīng)濟(jì)，可應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食品領(lǐng)域。

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Extraction and Saponification of Trans-lutein from Marigold Flowers

WANG Chuang1，LI Da-jing1,2,3,*，SONG Jiang-feng2,3，LIU Chun-quan2,3
(1. College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；2. Institute of Farm Products Processing, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China；3. Engineering Research Center for Agricultural Products Processing, National Agricultural Science and Technology Innovation Center in East China, Nanjing 210014, China)

Marigold (Tagetes erecta) flowers were used as raw materials to investigate the extraction and saponification of translutenin from marigold flowers. The effects of organic solvent amount, KOH-ethanol concentration and amount, extraction and saponification temperature and time on extraction and saponification rate of trans-lutenin from marigold flowers was explored. Based on the single factor experimental results, response surface experiments were used to optimize the extraction and saponification efficiency of trans-lutein and a mathematic model between the factors and extraction rate of trans-lutenin from marigold flowers was established. Meanwhile, crude trans-lutein was further purified. Results indicated that the optimal extraction parameters were raw material amount of 1.00 g, petroleum ether amount of 42.6 mL/g, KOH-ethanol concentration of 0.099 g/mL and extraction temperature of 58.8 ℃. Under the optimal extraction conditions, the extraction rate of trans-lutein was up to 1.499%. After the purification of trans-lutein, the content of trans-lutein crystal was up to 90.42%.

Tagetes erecta；trans-lutein；extraction and saponification；response surface methodology；purification

TS202.3

A

1002-6630(2010)24-0095-07

2010-03-01

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2010467)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)(DL10BA12)

王闖(1985—)，女，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物研究。E-mail：wangchuang0406@126.com

*通信作者：李大婧(1976—)，女，副研究員，博士，主要從事天然產(chǎn)物研究。E-mail：lidajing@163.com