丁進(jìn)鋒，蘇秀榕*，張春丹，李妍妍，徐嘉杰

(寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

海蜇膠原蛋白提取工藝及促愈合作用研究

丁進(jìn)鋒，蘇秀榕*，張春丹，李妍妍，徐嘉杰

(寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

通過響應(yīng)面法優(yōu)化海蜇膠原蛋白的提取工藝，并通過小鼠皮膚創(chuàng)傷模型研究海蜇膠原蛋白的促愈合作用。通過單因素試驗(yàn)選取因素與水平，根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素基礎(chǔ)上采用三因素三水平響應(yīng)面分析法(RSM)，對(duì)海蜇膠原蛋白的酸法提取工藝進(jìn)行優(yōu)化；采用小鼠皮膚創(chuàng)傷模型，創(chuàng)面外用膠原蛋白，并以云南白藥處理為陽(yáng)性對(duì)照，通過十字測(cè)量法測(cè)量創(chuàng)面大小并計(jì)算創(chuàng)面愈合率。結(jié)果顯示海蜇膠原蛋白的最佳提取工藝條件為提取時(shí)間62.64h、液料比23.6:1，醋酸濃度0.562mol/L；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明海蜇膠原蛋白能夠明顯縮短傷口愈合時(shí)間，對(duì)創(chuàng)面修復(fù)有促進(jìn)作用。響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件準(zhǔn)確可靠；海蜇膠原蛋白具有明顯的促愈合作用。

海蜇；膠原蛋白；響應(yīng)面；傷口愈合

海蜇(Rhopilema esculentum Kiahinouye)隸屬于腔腸動(dòng)物門(Coelentera)、缽水母綱(Scyphozoa)、根口水母(Rhizostomeae)、根口水母科(Rhizostomatidae)、海蜇屬(Rhopilema)的無(wú)緣膜動(dòng)物。世界已記錄的海蜇屬只有海蜇(R.esculentum)、黃斑海蜇(R.hispidum)、棒狀海蜇 (R. rhopalophorum)和疣突海蜇(R.verrilli)等4種。前3種在我國(guó)已有記錄。棒狀海蜇個(gè)體小(40～100mm)，傘部的中膠層薄，數(shù)量稀少，沒有捕撈價(jià)值。作為漁業(yè)生產(chǎn)的只有海蜇和黃斑海蜇兩種[1]。

海蜇經(jīng)加工后，傘部稱為海蜇皮，口腕部稱為海蜇頭，二者均具有很高的經(jīng)濟(jì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，富含較高的蛋白質(zhì)及鈣、磷、碘、鐵等無(wú)機(jī)鹽和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分[2]，去水分蛋白質(zhì)占總干質(zhì)量的50%左右，其脂肪含量低[3]，是一種高蛋白低脂肪的食品。海蜇不僅是宴席佳肴，也是一味治病良藥。海蜇性咸、平，入肝腎，可消熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)、降壓消腫等功效，并對(duì)氣管炎、哮喘、高血壓、口噪咽干、陰虛便秘等有一定的治療作用[2-5]。海蜇富含一些具有生物活性的物質(zhì)，如膠原蛋白、毒素、糖胺聚糖、糖蛋白等[5-8]，其中膠原蛋白的含量最為豐富[9]。膠原蛋白由3條α多肽鏈構(gòu)成三股螺旋結(jié)構(gòu)，其分子結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，分子質(zhì)量在30kD以上，不利于人體直接吸收。國(guó)內(nèi)外研究表明，水解膠原蛋白的主要產(chǎn)物膠原多肽，具有保護(hù)胃黏膜、抗?jié)?、抑制血壓上升，促進(jìn)骨形成、皮膚膠原代謝等營(yíng)養(yǎng)及生理功能，在食品及醫(yī)藥等領(lǐng)域具有巨大的開發(fā)前景[10-11]。

傷口愈合是機(jī)體所具有的一種修復(fù)功能，它包括炎癥、增生期、傷口收縮、膠原代謝和上皮形成等一系列復(fù)雜過程[12]。膠原具有很強(qiáng)的生物活性及生物功能，能參與細(xì)胞的遷移、分化和增殖，使骨、腱、軟骨和皮膚具有一定的機(jī)械強(qiáng)度。因膠原的抗原性和良好的生物相容性，在燒傷、創(chuàng)傷、眼角膜疾病、美容、矯形、硬組織修復(fù)、創(chuàng)面止血等醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域用途廣泛[13]。長(zhǎng)期以來，人們都是使用豬、牛的皮和骨提取膠原蛋白和明膠。但因瘋牛病、口蹄疫等疾病的爆發(fā)對(duì)牲畜膠原制品安全性產(chǎn)生疑慮。另外，由于宗教和習(xí)俗等原因，有些地區(qū)也不能使用牲畜膠原蛋白制品。因此，獲得膠原蛋白的新來源顯得十分迫切[14]。本實(shí)驗(yàn)利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)酸法提取海蜇膠原蛋白工藝，并研究海蜇膠原蛋白的促傷口愈合作用，旨在為海蜇生物活性物質(zhì)的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為其在功能食品、醫(yī)藥、化妝品等方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海蜇購(gòu)于浙江省岱山縣；ICR小鼠 浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

L-羥脯氨酸 Sigma公司；氯胺T、鹽酸、氫氧化鈉、檸檬酸、高氯酸、無(wú)水乙醇、乙二醇獨(dú)甲醚、對(duì)二甲基氨基苯甲醛、濃硫酸、醋酸等均為AR 寧波奧博科學(xué)儀器有限公司；云南白藥 云南白藥集團(tuán)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T6新悅可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DKS-26電熱恒溫水浴鍋 寧波江南儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 膠原蛋白提取

1.3.1.1 單因素試驗(yàn)

選取提取時(shí)間、料液比及醋酸濃度三個(gè)因素，探討其對(duì)海蜇膠原蛋白提取效果的影響。取一定量搗碎均勻的海蜇，加入適量的醋酸，在4℃條件下浸提一定時(shí)間后，10000r/min、4℃離心30min，取上清液，加入6mol/L鹽酸后130℃水解6h，測(cè)定羥脯氨酸含量[15]。

提取率/%=m/M×100

式中：m為提取的膠原質(zhì)量/mg；M為海蜇質(zhì)量/mg。

1.3.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定各因素最佳條件后，以Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)試驗(yàn)，設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)優(yōu)化海蜇膠原蛋白提取條件。

1.3.2 促愈合作用

1.3.2.1 動(dòng)物分組及傷口模型建立

ICR小鼠45只，平均質(zhì)量為(20±2)g。將小鼠隨機(jī)分為3組，每組15只，分別為正常對(duì)照組(NG)、海蜇膠原蛋白組(JG)及云南白藥組(YG)。小鼠以戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，背部去毛，消毒。在小鼠背部剪去直徑約1cm的全層皮膚，造成全皮層缺損動(dòng)物模型。JG組每天涂抹0.2mL 1mg/mL海蜇膠原蛋白溶液，YG組每天涂抹0.2mL 0.6mg/mL云南白藥懸浮液。以上各組均用無(wú)菌紗布包扎好，每日換藥1次，連續(xù)14d。每天對(duì)創(chuàng)傷口面觀察，測(cè)量傷口大小，并記錄結(jié)果。

1.3.2.2 傷口愈合率

每天用游標(biāo)卡尺測(cè)量創(chuàng)面大小(十字測(cè)量法)，創(chuàng)傷口面積按橢圓面積計(jì)算[16]，并計(jì)算傷口愈合率。

S=0.25abπ

式中：a為傷口長(zhǎng)軸長(zhǎng)度；b為傷口短軸長(zhǎng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白提取單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

圖1 提取時(shí)間對(duì)海蜇膠原蛋白的影響Fig.1 Effect of extraction time on the yield of jellyfish collagen

取一定質(zhì)量的海蜇，加入0.5mol/L醋酸，液料比為10:1(V/m)，在4℃條件分別浸提12、24、48、72、84h。在48h內(nèi)，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原蛋白提取率也隨之增加，但超過48h后，提取率不再增加，因此提取時(shí)間以48h為佳(圖1)。

2.1.2 醋酸濃度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

取一定質(zhì)量的海蜇，分別加入0.1、0.2、0.5、0.7、1.0mol/L醋酸，液料比為10:1，在4℃條件浸提48h。從圖5可看出，隨著醋酸濃度的增加，膠原蛋白提取率也增加，在0.5mol/L達(dá)到最大，超過0.5mol/L時(shí)，提取率無(wú)太大影響，因此以0.5mol/L為醋酸最佳濃度。

圖2 不同醋酸濃度對(duì)海蜇膠原蛋白提取的影響Fig.2 Effect of acetic acid concentration on the yield of jellyfish collagen

2.1.3 液料比對(duì)膠原蛋白提取率的影響

取一定質(zhì)量的海蜇，加入0.5mol/L醋酸，在4℃條件浸提48h，液料比分別為5、10、15、20、25。由圖6可看出，液料比較小時(shí)，海蜇不能完全浸于其中，提取率低，液料比大時(shí)，對(duì)膠原蛋白提取率的影響較小，并會(huì)造成膠原蛋白分離純化困難，因此提取海蜇膠原蛋白的最佳液料比為20:1。

圖3 液料比對(duì)海蜇膠原蛋白提取的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the yield of jellyfish collagen

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化海蜇膠原蛋白的提取工藝

2.2.1 分析因素選取

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取提取時(shí)間(A)、液料比(B)、醋酸濃度(C)，以海蜇膠原蛋白提取率為響應(yīng)值(Y)做3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素及水平設(shè)計(jì)見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面法分析因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface method

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果Table 2 The results of response surface analysis

由表3方差分析表可知，方程一次項(xiàng)的影響是顯著的，提取時(shí)間和醋酸濃度二次項(xiàng)的影響也是顯著的，交互項(xiàng)作用影響不顯著，說明各因素對(duì)海蜇膠原蛋白提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。為明確各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，經(jīng)回歸擬合后，試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響可用回歸方程表示為：Y=0.988＋0.025A＋0.0125B＋0.0125C＋0.0025AB＋0.0125AC＋0.0025BC-0.02525A2-0.01025B2-0.03525 C2

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

從表3結(jié)果可看出，整體模型的P≤0.01，表明該回歸方差模型極顯著，并且失擬項(xiàng)不顯著，說明該模型的擬合度較好。

2.2.2 響應(yīng)面分析及等高線圖

從圖4可以看出，圖4兩因素提取時(shí)間和液料比交互作用不顯著，當(dāng)提取時(shí)間、醋酸濃度一定時(shí)，提取率隨液料比的增加而增加。從圖5、6可以看出，等高線呈橢圓形，說明圖中兩因素交互作用明顯。圖5和圖6表明，當(dāng)醋酸濃度一定時(shí)，提取率分別隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)和液料比的增加而增加，到一定程度后均又有所下降。

圖4 提取時(shí)間(A)與液料比(B)對(duì)海蜇膠原蛋白提取率的影響Fig.4 Response surface plots showing the effects of extraction time and substrate concentration on the yield of jellyfish collagen

圖5 提取時(shí)間(A)與醋酸濃度(C)對(duì)海蜇膠原蛋白提取率的影響Fig.5 Response surface plots showing the effects of extraction time and acetic acid concentration on the yield of jellyfish collagen

圖6 液料比(B)與醋酸濃度(C)對(duì)海蜇膠原蛋白提取率的影響Fig.6 Response surface plots showing the effects of substrate concentration and acetic acid concentration on the yield of jellyfish collagen

2.2.3 提取工藝的確定

結(jié)合回歸模型的數(shù)學(xué)分析可知，海蜇膠原蛋白的提取最佳工藝為：提取時(shí)間62.64h、液料比23.6:1、醋酸濃度0.562mol/L，在此條件下海蜇膠原蛋白的預(yù)測(cè)提取率1.002%。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的可靠性，采用最佳提取條件海蜇膠原蛋白，考慮到實(shí)驗(yàn)操作的可靠性，將最優(yōu)提取條件修正為提取時(shí)間63h、液料比24:1、醋酸濃度0.56mol/L，在此條件下測(cè)定的膠原蛋白的提取率為1.011%，與理論預(yù)測(cè)值的誤差為0.90%，說明采用RSM法優(yōu)化得到的浸提條件可靠。

2.3 促愈合實(shí)驗(yàn)

2.3.1 肉眼觀察

小鼠術(shù)后1d，各組創(chuàng)面均有濕潤(rùn)，無(wú)明顯膿液形成，無(wú)明顯感染，創(chuàng)傷面也未出現(xiàn)明顯縮小，傷口邊緣的基底細(xì)胞開始增生，覆蓋于肉芽組織的表面。

術(shù)后3d，各組創(chuàng)面均無(wú)感染，均出現(xiàn)了不規(guī)則的隆起團(tuán)狀硬塊，即增生的肉芽組織，傷口收縮不明顯。

術(shù)后5d，JG組和YG組傷口有明顯的收縮，JG和YG組傷口均被填平，團(tuán)塊狀隆起，創(chuàng)面完全封閉，而NG組傷口未完全封閉。

術(shù)后7d，JG組痂皮已經(jīng)脫落，邊緣新皮組織向中心發(fā)展，其他各組還未出現(xiàn)痂皮脫落現(xiàn)象，但用藥組肉芽組織體積縮小。

術(shù)后10d， JG和YG組痂皮都已自然脫落，傷口大小有明顯的變化，瘢痕觸之較為柔軟，彈性好，活動(dòng)度較大，而NG組痂皮還有部分未脫落，瘢痕觸之較為僵硬，彈性差，活動(dòng)度小。

2.3.2 各因素處理對(duì)創(chuàng)面愈合率的影響

由圖7可以看出，術(shù)后3d，各因素處理對(duì)創(chuàng)面愈合率比NG組有所提高，但是無(wú)顯著性差異(P＞0.05)；術(shù)后5d，JG組和YG組與N組比較，創(chuàng)面愈合率有明顯提高(P＜0.05)，術(shù)后7d，JG組和YG組與N組相比，愈合率有明顯提高(P＜0.01)；而JG組和YG組愈合率提高極顯著(P＜0.01)；術(shù)后10d，JG組和YG組愈合率較N組有極顯著差異(P＜0.01)。

圖7 各因素處理后小鼠傷口愈合率Fig.7 The healing rate of three wound treatments

3 討 論

本研究采用響應(yīng)面法提取海蜇膠原蛋白，結(jié)果表明膠原蛋白最佳提取條件為：提取時(shí)間62.64h、液料比23.6:1、醋酸濃度0.562mol/L，在此條件下海蜇膠原蛋白預(yù)測(cè)得率為1.002%，實(shí)際測(cè)定值與理論預(yù)測(cè)值的誤差為0.90%。響應(yīng)面分析法是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，它以回歸方程作為函數(shù)估算的工具，確定各因素及其交互作用對(duì)各指標(biāo)的影響，精確地表達(dá)因素和響應(yīng)值之間的關(guān)系[17]。因此本研究利用響應(yīng)面法提取海蜇中的膠原蛋白，結(jié)果表明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的提取條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

此外本研究還對(duì)所提取的膠原蛋白對(duì)小鼠傷口模型的促愈合作用進(jìn)行研究，結(jié)果表明膠原蛋白溶液對(duì)創(chuàng)面模型傷口愈合有明顯的促進(jìn)作用。本研究采用云南白藥作為陽(yáng)性對(duì)照組，云南白藥可明顯促進(jìn)小鼠堿性成纖維細(xì)胞因子(bFGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的生成，bFGF與VEGF可促進(jìn)成纖維細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞生成，因此可以加速血管的生長(zhǎng)及結(jié)締組織增生，達(dá)到促進(jìn)傷口愈合的作用。從結(jié)果可以看出膠原蛋白組對(duì)小鼠傷口的愈合率與云南白藥組相比沒有顯著差異，結(jié)果顯示膠原蛋白組和云南白藥組比正常組傷口要提前2～3d愈合。膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣的蛋白質(zhì)，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞等增殖、分化和移行，且膠原纖維具有彈性，能減少創(chuàng)面的收縮。可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化并形成基質(zhì)。同時(shí)膠原蛋白可以促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)，并為機(jī)體修復(fù)細(xì)胞提供所必需的氨基酸，加速創(chuàng)面的愈合[18]。張紅等[18]曾研究膠原蛋白對(duì)大鼠創(chuàng)傷皮膚的促愈合作用，結(jié)果表明膠原蛋白能加速大鼠創(chuàng)傷模型的愈合率，有效促進(jìn)大鼠創(chuàng)傷皮膚的愈合。

仇樹林等[19]研究表明羥脯氨酸含量的增加，能加速創(chuàng)面的愈合，同時(shí)也提高創(chuàng)面的愈合質(zhì)量。而羥脯氨酸是膠原蛋白的主要成分，并是一種具有獨(dú)特生理活性的氨基酸，它可以作為化妝品添加劑，具有抗氧化、抗輻射的作用；可作為各種軟組織疾病的藥物，如結(jié)締組織受損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，又可加快傷口愈合，以及治療各種皮膚疾病等生物活性[20]。

筆者認(rèn)為膠原蛋白組涂抹了膠原蛋白，增加了羥脯氨酸的含量，從而促進(jìn)了創(chuàng)面膠原纖維的合成，這可能是膠原蛋白促進(jìn)傷口愈合的一重要機(jī)制；此外膠原蛋白是皮膚細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，細(xì)胞外基質(zhì)加速重建，可為表皮細(xì)胞等增殖、分化和移行提供一個(gè)合適的微環(huán)境，因此這也可能是膠原蛋白促進(jìn)傷口愈合的一重要環(huán)節(jié)。但海蜇膠原蛋白的促進(jìn)傷口愈合詳細(xì)機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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Extraction of Collagen from Jellyfish (Rhopilema esculentum) and Wound Healing-Promoting Effect in Mouse

DING Jin-feng，SU Xiu-rong*，ZHANG Chun-dan，LI Yan-yan，XU Jia-jie
(Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The optimum condition of jellyfish (Rhopilema esculentum Kiahinouye 1891) collagen was studied, and the effect of jellyfish collagen on promoting the wound healing was studied based on the model of mouse skin wounds. Experimental factors and their levels were determined by single-factor tests, and then a three factors and three levels test was designed based on the principle of Box-Benhnken design. The extraction conditions were optimized through response surface method (RSM). In the experiment of wound healing in mouse, cutting-skin injures model in mouse were created and wounds were treated with collagen, at the same time yunnan baiyao was used as positive control. The size of wounds was measured through cross measurement, and the healing rates were calculated. Results showed the optimal conditions of jellyfish collagen extraction were obtained as following: extraction time 62.64 h, the solid/water ratio of 1:23.6, acetic acid concentration of 0.562 mol/L. Animal tests showed that treatment with collagen could significantly accelerate the process of re-epithelialization, and promote wound healing.

jellyfish；collagen；Response surface method (RSM)；wound healing

TS254.4

A

1002-6630(2010)24-0019-05

2010-08-13

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(Y304358)；寧波市科技局重點(diǎn)資助項(xiàng)目(200120041)

丁進(jìn)鋒(1984—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工與貯藏工程。E-mail：djfeng_0617@163.com

*通信作者：蘇秀榕(1956—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)與工程、生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail：suxiurong@nbu.edu.cn