文富華 鄧懷福 唐剛?cè)A 易 暢 吳克寧

(中山大學附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學科PET-CT 廣州 510080)

3'-脫氧-3'-18F-氟代胸苷(3'-deoxy-3'-18F-fluorothymidine,18F-FLT)是一種PET顯像劑，其用胸苷激酶催化的磷酸化作用評價 DNA復制過程，能準確評估腫瘤細胞 DNA合成和細胞增殖活性，在腫瘤早期診斷、鑒別診斷及療效監(jiān)測等方面具有重要價值，是目前最有發(fā)展前景的PET藥物之一，其放射合成成為研究熱點。Buck等[1]的研究表明，18F-FLT比18F-FDG能更好反映惡性腫瘤的增殖情況。結(jié)合18F-FDG PET顯像，可提高腫瘤診斷的準確性。

然而，現(xiàn)有18F-FLT合成方法產(chǎn)率低，合成時間較長(～60 min)，產(chǎn)物分離過程繁瑣，分離時間長(30 min左右)，設備要求制備型HPLC分離儀，所用前體量大，成本較高。鑒此，我們對18F-FLT的合成及分離進行了研究。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

Cyclone 10/5(比利時IBA公司)；PET-MF-2VIT-I型氟-18多功能合成模塊(北京派特生物有限公司)；1200 Series 高效液相分析色譜儀(HPLC, 美國Agilent公司)；流動相放射性檢測儀(華盛頓BIOSCAN公司)；MiniGita放射性TLC掃描儀(德國Raytest公司)。

前體 3-N-t-叔丁氧羰基-1-[5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基) -2’-脫氧-3’-O-（4-硝基苯磺?；?β-1)-蘇戊呋喃糖]胸腺嘧啶和標準品 3’-脫氧-3’-氟代胸苷(19F-FLT, 德國 ABX 公司)；4,7, 13,16,21,24-六氧雜-1,10-二氮雜雙環(huán)[8,8,8]二十六碳烷(Kryptofix2.2.2,K222，德國 ABX 公司)；乙腈(英國 ACROS 公司)；Sep Pak QMA、Sep Pak C18 小柱、Sep Pak Al2O3小柱和 Sep Pak SCX 小柱(美國 Waters 公司)；HCl(美國 Aldrich 公司)；碳酸鉀(美國 Sigma-Aldrich公司)；無水乙醇(天津市福晨化學試劑廠)；氫氧化鈉(天津市大茂化學試劑廠)；注射用水(安徽雙鶴藥業(yè)有限責任公司)。

1.2 合成方法

以 3-N-t-叔丁氧羰基-1-[5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧-3’-O-(4-硝基苯磺?；?β-1)-蘇戊呋喃糖]胸腺嘧啶脫氧核苷為前體，溶于1 mL無水乙腈中，在 105℃密閉狀態(tài)下與干燥18F–進行親核反應5 min；然后冷卻，加入1 mL 1 mol/L HCl，100℃水解反應5 min；冷卻，再加入0.5 mL 1 mol/L NaOH 進行中和；最后，反應液過小柱進行分離純化并過無菌濾膜得到18F-FLT注射液，合成路線見圖1。

2 實驗內(nèi)容

2.1 自動化合成前準備

18F-FLT自動化合成在PET-MF-2V-IT-I型氟-18多功能合成模塊中完成，由圖2，在V0的六通閥處安裝活化后的QMA柱，并將QMA柱放入活度計內(nèi)；在V7與V10間安裝Sep Pak SCX 小柱、Sep Pak Al2O3小柱；在V15與V17間安裝Sep Pak C18 小柱。在V1中加入1.5 mL K2CO3(30 mg/6 mL水)和K222混合液(130 mg/5 mL乙腈)；V2中加入2 mL無水乙腈；V3中加入溶于1 mL無水乙腈的前體15 mg；V4加入1 mol/L HCl 1 mL；V5加入1 mol/L NaOH 1mL；V6加入30 mL 注射用水；V11加入2 mL乙醇。在產(chǎn)品出口接無菌濾膜和產(chǎn)品收集瓶，并放入活度計。

圖1 18F-FLT的合成路線Fig.1 Scheme of 18F-FLT synthesis.

圖2 18F-FLT自動化合成流程圖Fig.2 Schematic diagram of the automated synthesis of 18F-FLT at PET-MF-2V-IT-I system.

2.2 18F-FLT自動化合成步驟

(1)18F–由Cyclone 10/5通過18O(p, n)18F反應生產(chǎn)；(2)18F–被QMA捕獲后，用V1中的K2CO3和K222混合液將其洗脫，進入第一個反應管；(3) 反應管中溶液在105℃蒸發(fā)干燥6 min；加入V2中的乙腈，105℃蒸發(fā)干燥至反應管中無液體殘留；(4)加入V3中的前體，105℃下密閉反應6 min；116℃下蒸發(fā)乙腈；(5) 冷卻反應管；(6) 加入V4中的HCl溶液，在100℃下水解反應5 min；(7) 冷卻反應管；(8) 加入V5中的NaOH溶液進行中和反應；(9) 從V6中的水吸取10 mL到第一反應管，稀釋反應液。將反應液通過V7與V10間相連的Sep Pak SCX 小柱、Sep Pak Al2O3小柱，進入第二反應管，再從第二反應管轉(zhuǎn)移并通過V15與V17間的Sep Pak C18 小柱，淋洗液進入廢液瓶中；(10) 從V6中吸取10 mL水到第一反應管，將反應管中殘留的反應液溶入水中，并將洗液通過V15與V17間的Sep Pak C18 小柱，重復此操作一次；(11) 將V11中的乙醇加入第二反應管，經(jīng)Sep Pak C18 小柱將產(chǎn)品洗脫到瓶中。

2.3 化學純度和放射化學純度的測定

用放射性高效液相色譜(HPLC)系統(tǒng)測定18F-FLT注射液的化學純度和放射化學純度。HPLC分析條件：乙醇:水=10:90(V/V)，流速為1 mL /min，254 nmUV檢測。TLC 展開劑：二氯甲烷:甲醇=90:10(V/V)。

用精密pH試紙測定18F-FLT注射液的 pH值，目測溶液的顏色和澄清度；取一定量的18F-FLT注射液，用活度計測定不同時間的活度值，用半對數(shù)作圖法計算其半衰期和核純度；按中國藥典 2005年版所載無菌檢查法(肉湯法)對18F-FLT溶液進行無菌檢查，用鱟試劑法進行細菌內(nèi)毒素檢查，并用5只昆明小白鼠尾靜脈注射18F-FLT注射液各 0.5 mL進行異常毒性檢查。其中無菌檢查及內(nèi)毒素檢查由本單位檢驗科協(xié)助完成。

2.4 小鼠肝細胞癌模型制備及PET/CT顯像

C57BL/6J小鼠10只，雌性，5周齡，體質(zhì)量20–25 g。將Hepa1-6肝癌細胞株常規(guī)傳代培養(yǎng)，收集對數(shù)生長期的細胞，用1×PBS溶液配成2×107個/mL的細胞懸液，無菌條件下在小鼠右肋腰部皮下注射0.1 mL瘤細胞懸液。7 d后可捫及皮下結(jié)節(jié)，待腫瘤長徑至15–25 mm時進行實驗。由尾靜脈注射生理鹽水稀釋的18F-FLT 15 MBq (0.2 mL)，1 h后固定于小鼠架上，行全身PET/CT掃描，經(jīng)衰減校正后，迭代重建獲得橫斷面、矢狀面、冠狀面斷層圖像及MIP(maxmium-intensity projection)圖像。

3 結(jié)果與討論

3.1 18F-FLT的合成

自 Grierson等[2]合成無載體18F-FLT以來，放化工作者嘗試用多種前體、不同合成路線、不同純化條件等進行18F-FLT的合成及分離，以提高合成產(chǎn)率。前體可分為兩大類：(1) 2,3’-anhydrothymidine類似物，(2) 胸苷母體的3、3'位有保護基的類似物，以第二類中的3-N-Boc類前體的方法研究較多，其合成產(chǎn)率相對較高 (表 1)。本工作選用 3-N-t-叔丁氧羰基-1-[5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧-3’-O-(4-硝基苯磺酰基-β-1)-蘇戊呋喃糖]胸腺嘧啶作起始原料，合成18F-FLT。Oh等[5]以40 mg N-Boc-前體與18F–在150℃加熱100 s，然后在85℃加熱反應450 s，再加HCl水解，中和后經(jīng)HPLC分離得18F-FLT，總合成時間～60 min，放化產(chǎn)率34.5%。考慮到原料價格，我們選用15 mg前體進行合成。

取15 mg前體與18F-在105℃加熱反應6 min，再加HCl水解，最后用NaOH中和反應液并過柱純化產(chǎn)品。該‘一鍋法’合成18F-FLT共耗時35 min，產(chǎn)率為 12%–15%。與文獻[5]合成方法相比，雖產(chǎn)率稍低，但反應較溫和，程序簡單且合成時間短；與國內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)相比，產(chǎn)率較高；特別是柱分離的方法大大縮短了合成時間。傅喆等[6]用柱分離法進行18F-FLT 合成，但其方法是半自動化合成，操作人員接觸照射較多，不能滿足日常臨床需求。Lee等[7]在質(zhì)子溶劑中用20 mg前體與18F–在120℃加熱反應10 min，再加HCl水解，中和后經(jīng)HPLC分離得18F-FLT，總合成時間～70.5 min，放化產(chǎn)率51.0%，是目前產(chǎn)率最高的合成方法，但我們按其方法進行合成，并未得到18F-FLT。

表1 3-N-Boc類前體法合成18F-FLTTable 1 The method of synthesis 18F-FLT with 3-N-Boc analogues as precursor.

3.2 產(chǎn)品的純化

我們用兩種方法進行產(chǎn)品分離(表2)，兩種方法相比，顯然第二種方法更加合理、優(yōu)化，不但 pH值較適宜，而且放射性純度高，產(chǎn)率也較高，可以滿足臨床的需要。

表2 小柱連接順序?qū)?8F-FLT的影響Table 2 The effect of Sep Pak cartridges sequence on 18F-FLT.

該合成方法主要優(yōu)點如下：(1) 使用 Sep Pak小柱分離純化代替HPLC分離，不僅簡化了分離純化過程，更便于實現(xiàn)18F-FLT自動化合成，而且大大縮短了總合成時間，比傳統(tǒng)合成工藝節(jié)省了15–25 min，這對于半衰期為109.8 min的18F–意義重大。(2) 使用較少化學量的前體，節(jié)約了成本。

柱分離后的產(chǎn)品經(jīng)無菌濾膜進入無菌真空瓶，即得18F-FLT注射液，pH值～7.0，無色透明、穩(wěn)定的液體，用時間衰變法測定18F半衰期～110 min，放射性核素純度>99%，HPLC測定其放射化學純度>95% (圖3)，254 nm紫外吸收只檢測到溶劑峰和FLT標準品峰，TLC掃描Rf～0.66(圖4)，細菌內(nèi)毒素檢查、無菌檢查均符合國家藥典規(guī)定，異常毒性試驗中無小白鼠死亡發(fā)生。

圖3 18F-FLT 柱分離后的HPLC放射性及紫外圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of Sep-Pak purified 18F-FLT.

圖4 18F-FLT的TLC層析圖Fig.4 TLC chromatogram of 18F-FLT.

3.3 荷肝細胞小鼠18F-FLT顯像結(jié)果

注射18F-FLT后1 h荷肝細胞癌小鼠PET/CT顯像結(jié)果如圖 5，可見小鼠肝細胞癌腫瘤明顯放射性攝取，高于周圍正常組織。全身顯像圖可見雙腎及肝臟顯影，膀胱內(nèi)可見放射性滯留，腦組織攝取較低。

圖5 荷肝細胞癌小鼠18F-FLT PET/CT顯像圖A.橫斷面CT圖像 B.橫斷面PET圖像C.冠狀面PET圖像 D.MIP圖像Fig.5 18F-FDG PET/CT imaging of mice models bearing hepatocellular carcinoma.A.Axial CT imaging B.Axial PET imaging C.Coronal PET imaging D.MIP PET imaging.

4 結(jié)論

以 3-N-t-叔丁氧羰基-1-[5’-O-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-2’-脫氧-3’-O-(4-硝基苯磺?；?β-1)-蘇戊呋喃糖]胸腺嘧啶為前體，使用自動化合成裝置PET-MF-2V-IT-I型氟-18多功能合成模塊，經(jīng)氟化、水解兩步反應“一鍋法”制備了 3’-脫氧-3’-氟代胸苷(18F-FLT)，并經(jīng)柱分離制得18F-FLT注射液，共耗時35 min。放化產(chǎn)率12%–15%，放化純度>95%，該法生產(chǎn)的18F-FLT更便于其在臨床中推廣應用。

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