吳琦 劉哲丞 齊曉丹 張英博

(1.齊齊哈爾醫(yī)學院生化教研室; 2.齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院; 3.齊齊哈爾醫(yī)學院實驗中心 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

膈下逐瘀湯對大鼠纖維化肝組織CTGFmRNA和PDGF-A蛋白表達的影響①

吳琦1劉哲丞2齊曉丹1張英博3

(1.齊齊哈爾醫(yī)學院生化教研室; 2.齊齊哈爾醫(yī)學院藥學院; 3.齊齊哈爾醫(yī)學院實驗中心 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 觀察膈下逐瘀湯對肝纖維化大鼠肝臟組織結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)mRNA和血小板衍生生長因子(platelet_derived growth factor, PDGF)-A蛋白表達的影響。方法 Sprague-Dawley(SD)大鼠60只隨機分為空白對照組(n=20)、模型對照組(n=20)和膈下逐瘀湯組(n=20),共3組。用40%四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)復制大鼠肝纖維化模型,膈下逐瘀湯干預12周后處死大鼠。采用實時熒光定量PCR法檢測大鼠肝組織CTGF mRNA的表達,免疫組化染色法檢測PDGF-A蛋白表達。結(jié)果模型組CTGF mRNA 2-ΔΔCt值(3.59±0.52)和PDGF-A積分光密度(IOD)值(23.38±1.55),顯著高于正常對照組(分別為1.02±0.23和15.02±1.34)(P<0.05),表明模型組CTGF mRNA和PDGF-A蛋白表達上調(diào)。與模型組比較,膈下逐瘀湯組CTGF mRNA 2-ΔΔCt值(1.62±0.25)和PDGF-A IOD值(18.04±0.83)顯著降低(P<0.05),表明CTGF mRNA表達下調(diào)。結(jié)論 膈下逐瘀湯可能通過下調(diào)CTGF mRNA和PDGF-A蛋白的表達而發(fā)揮抗肝纖維化作用。

膈下逐瘀湯 肝纖維化 結(jié)締組織生長因子 血小板衍生生長因子

肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理基礎,也是進一步向肝硬化發(fā)展的中間環(huán)節(jié)[1]。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種重要的促纖維化細胞因子,不僅可以直接刺激成纖維細胞增殖和促進細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)合成,還可以專一介導化生長因子-β(transforma-tion growth factor beta,TGF-β)的促纖維化作用,其異常表達在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關鍵作用[2]。血小板衍生生長因子(platelet_derived growth factor,PDGF)是結(jié)締組織來源細胞的主要有絲分裂原,可調(diào)控成纖維細胞的分化增殖,具有誘導膠原和其他細胞外基質(zhì)成分合成的功能。有研究表明,PDGF與組織纖維化的關系密切[3]。中藥復方的作用特點是多種成分和多個靶點的整體調(diào)節(jié),在防治肝纖維化的效果上往往明顯優(yōu)于單味藥物或單一成分。膈下逐瘀湯作為治療膈下瘀血證的代表方劑,對肝纖維化的預防、治療具有良好臨床基礎[4]。因此,本課題組利用實時熒光定量PCR和免疫組化技術,觀察了膈下逐瘀湯對大鼠肝纖維化肝組織中CTGFmRNA和PDGF-A蛋白表達的影響,旨在探討膈下逐瘀湯防治肝纖維化的作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 藥物 膈下逐瘀湯取自《醫(yī)林改錯》原方。由五當歸9g、靈脂6g、紅花9g、桃仁9g、川芎6g、烏藥6g、丹皮6g、赤芍6g、甘草9g、延胡索3g、枳殼5g、香附5g組成。方藥按傳統(tǒng)水煎成劑并濃縮,4℃冰箱保存。四氯化碳(CCl4分析純,北京北化精細化學品有限責任公司)。

1.1.2 實驗動物及分組 實驗動物及分組雄性SD大鼠60只,清潔級,體重(200±10)g,北京維通利華實驗動物技術有限公司購買,許可證編號SCXK(京)2002-0003。將SD大鼠隨機分為空白對照組、肝纖維化模型組和膈下逐瘀湯組共3組。

1.1.3 儀器及試劑 2700型PCR System擴增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品,UV-2550型紫外分光光度計為日本島津產(chǎn)品,ABI 7300熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。RNA抽提試劑RNAiso和SYBR(r)ExScript(tm)RT-PCR試劑盒購自TAKARA公司。引物由TAKARA公司設計和合成,其序列如下:GAPDH引物序列:forward 5′-GACAACTTTGGCATCGTG-GA-3′;reverse 5′-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3′。CTGF引物序列:CTGF引物序列:forward,5′-CACCCGGGTTACCAATGACAA-3′;reverse,5′-AGCCCGGTAGGTCTTCACAC-TG-3′;Rabbit Anti-PDGF-A和SABC免疫組化染色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供。DAB顯色試劑盒為福州邁新生物技術開發(fā)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 肝纖維化模型的建立[5]和藥物干預 模型組用40%CCl4(精制橄欖油配制)皮下注射法,劑量為2mL/kg體重,每周2次,共12周?？瞻讓φ战M以生理鹽水代替CCl4皮下注射,膈下逐瘀湯組按7.0g·kg-1·d-1灌胃給予膈下逐瘀湯,每天1次,連續(xù)12周?？瞻讓φ战M和模型組給予等體積蒸餾水,給藥方法同模型組。

1.2.2 大鼠肝臟組織CTGF mRNA表達水平檢測 治療結(jié)束后第2天,每組隨機取5只大鼠,戊巴比妥鈉麻醉取肝臟后處死。用RNAiso Reagent(TaKaRa公司)提取肝組織總RNA,利用紫外分光光度分析及瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的含量、純度及完整性。按SYBR(r)ExScript(tm)RT-PCR試劑盒方法將肝組織RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,cDNA中取1個樣本進行梯度稀釋作為繪制標準曲線的樣本,與其余樣本同時進行PCR反應。PCR反應采用SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time)kit試劑,反應體系為20μL。熱循環(huán):95℃預變性10s,共1個循環(huán)。95℃變性5s,60℃退火31s,40個循環(huán)。分別擴增GAPGH和CTGF,每個樣本作2個復孔,獲得到2組Ct平均值。用基于2-△△Ct方法進行相對定量分析[6]?！鳌鰿t=(Ct目的基因-Ct管家基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct管家基因)對照組。

1.2.3 大鼠肝組織PDGF-A蛋白質(zhì)表達水平檢測 治療結(jié)束后第2d,每組都隨機選出6只大鼠取肝組織,用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片。采用SABC法進行免疫組化染色,石蠟切片脫蠟水化,經(jīng)0.3%H2O2室溫25min滅活內(nèi)源性酶,微波爐加熱抗原修復。用5%BSA封閉液室溫封閉20min,加PDGF-A抗體4℃冰箱過夜,滴加生物素化山羊抗兔IgG 37℃ 20min,滴加試劑SABC 37℃ 20min,以上各步驟間均用0.02M PBS漂洗3次,DAB顯色后蘇木精淡染胞核,常規(guī)脫水、透明、封片,光鏡下觀察,棕色著色處為陽性,對照組用未免疫的兔血清代替一抗,其他步驟相同。采用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng),對每個統(tǒng)計場PDGF-A陽性細胞的積分光密度(IOD)進行測量。

圖1 各組樣本CTGF mRNA的擴增曲線(A.空白對照組;B.模型對照組;C.治療組)

2 結(jié)果

2.1 膈下逐瘀湯對肝纖維化大鼠肝臟組織CTGF mRNA表達的影響(圖1和表1)

2.2 膈下逐瘀湯對肝纖維化大鼠肝組織PDGF-A蛋白的影響

各組大鼠肝組織均見PDGF-A陽性細胞(圖2),通過Motic Med 6.0 數(shù)碼醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)分析各組IOD(圖3)。

3 討論

慢性肝病在我國的發(fā)病率很高,日益威脅我國人民的健康,其中肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化的共同途徑。在對慢性乙型肝炎等原發(fā)疾病尚無有效病因治療方法的情況下,減緩或阻止肝纖維化進程是很重要的治療對策。肝纖維化屬中醫(yī)“積聚”范疇,中醫(yī)藥在防治肝纖維化方面積累了大量的臨床經(jīng)驗,利用中藥多成分和多靶點的特點,從療效確切的藥方中尋找新的治療效果好、毒副作用較小的抗肝纖維化藥物,是我們國家創(chuàng)制自主知識產(chǎn)權新藥物的捷徑。膈下逐瘀湯出自清代醫(yī)家王清任的《醫(yī)林改錯》,臨床應用比較廣泛,對肝纖維化的治療有良好的效果。

目前認為,肝纖維化是可以逆轉(zhuǎn)的,在纖維化過程中肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)活化起著重要的作用,而HSC活化主要涉及一系列細胞因子的作用[7]。其中PDGF是目前已知的HSC最強絲裂原,也是HSC遷移最有力的促進因子,對HSC的活化、增殖和遷移均有明顯的促進作用。PDGF能夠促進活化HSC產(chǎn)生膠原,尤其是Ⅰ型和Ⅲ性膠原,PDGF還可以抑制膠原酶活性,減少細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的降解[8]。在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中,PDGF的表達明顯高于正常肝組織,其活性隨肝纖維化程度加重而升高,尤其在肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)內(nèi)的表達量與肝纖維化程度呈顯著正相關[9]。CTGF為PDGF的下游因子,是一種富含半胱氨酸的多肽,其主要生物學效應為促進細胞增殖,參與細胞轉(zhuǎn)分化過程和ECM的產(chǎn)生,誘導黏附、參與組織的創(chuàng)傷修復。在正常狀態(tài)下表達水平很低,且其作用限于結(jié)締組織,因此,阻斷CTGF表達或抑制其活性,將有望成為一種更特異、更有效的長期防治肝纖維化的手段[10]。

圖2 各組PGGF-A免疫陽性細胞IOD照片(A. 正常對照組;B.模型對照組;C.中藥組)

圖3 各組大鼠肝臟組織;PDGF-A表達水平比較(n=6)

表1 各組大鼠肝臟組織CTGF基因表達相對值比較(,n=5)

表1 各組大鼠肝臟組織CTGF基因表達相對值比較(,n=5)

注:與模型對照組比較,*P＜0.05

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本課題組分別采用SYBR Green Ⅰ實時定量RT-PCR法和免疫組織化學染色法檢測各組大鼠肝組織CTGFmRNA和PDGF-A的表達,結(jié)果顯示,各組均有CTGF mRNA和PDGF-A的表達。模型對照組與空白對照組相比CTGF mRNA和PDGF-A的表達顯著增加;膈下逐瘀湯干預組與模型對照組相比CTGF mRNA和PDGF-A的表達則降低,因此,我們認為膈下逐瘀湯可調(diào)控肝組織CTGF mRNA和PDGF-A蛋白分子的表達,從而延緩甚至抑制肝纖維化的進程。

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R243:Q7

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1674-0742(2010)08(c)-0029-04

吳琦(1975～):男,黑龍江齊齊哈爾人,碩士,講師,齊齊哈爾醫(yī)學院生物化學教研室,研究方向:分子生物學。

劉哲丞(1980～):男,黑龍江齊齊哈爾人,本科,助理實驗師,齊齊哈爾醫(yī)學院生物化學實驗室,研究方向:生物化學。

齊曉丹(1981～):黑龍江齊齊哈爾人,研究生,助教,齊齊哈爾醫(yī)學院生物化學教研室,研究方向:分子生物學。

張英博(1973～):男,黑龍江齊齊哈爾人,研究生,副研究員,高級實驗師,齊齊哈爾醫(yī)學院中心實驗室,研究方向:中醫(yī)中藥。

2010-06-08