林 芬，謝 和*

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

產(chǎn)醬香細(xì)菌中高活性纖溶酶菌株的篩選

林 芬，謝 和*

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

以醬香型酒生產(chǎn)所使用的高溫大曲、酒糟、窖泥為樣品，經(jīng)分離篩選獲得24株產(chǎn)醬香結(jié)果優(yōu)良的細(xì)菌及16株產(chǎn)醬香結(jié)果較好的細(xì)菌。對(duì)產(chǎn)醬香細(xì)菌進(jìn)行纖溶酶活性篩選，得到一株高產(chǎn)纖溶酶菌株GZJSⅠ-2，經(jīng)初步鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，測得其發(fā)酵液酶活力(相當(dāng)尿激酶酶活力單位)為1479.11U/mL，酶比活力為21751.62U/mg。以pH7.4的生理鹽水作陰性對(duì)照，以尿激酶作陽性對(duì)照，在體外研究菌株GZJSⅠ-2發(fā)酵液上清液的抗凝集和血栓溶解作用，結(jié)果表明該菌株發(fā)酵上清液具有顯著的體外血栓溶解作用，及一定的抗凝血效果，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

產(chǎn)醬香細(xì)菌；篩選；纖溶酶；分類；鑒定

醬香是一種傳統(tǒng)香型，歷史悠久，應(yīng)用非常廣泛，在食品、制醬、釀酒等方面都得到了很好的應(yīng)用，尤其在釀酒方面。醬香型白酒也因具有優(yōu)雅、獨(dú)特的醬香味而聞名遐邇。醬香型白酒香味物質(zhì)的產(chǎn)生、風(fēng)格形成是美拉德反應(yīng)的結(jié)果，而產(chǎn)醬香細(xì)菌所產(chǎn)生的生物酶，對(duì)美拉德反應(yīng)及香味物質(zhì)形成起了決定性的作用[1-3]。因此，醬香風(fēng)味的形成與細(xì)菌有密切的關(guān)系[4]。

血栓性疾病是當(dāng)前危害人類健康，導(dǎo)致死亡率最高的原因之一。治療血栓栓塞類疾病目前最為有效并且可靠的方法是溶栓療法。然而，傳統(tǒng)溶栓藥物如尿激酶、鏈激酶等具有半衰期短、易出血、口服無效等缺點(diǎn)。自1987年日本學(xué)者須見洋行等[5]首先發(fā)現(xiàn)微生物纖溶酶具有纖溶活性以來，由于微生物所產(chǎn)的纖溶酶來源廣泛、易于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，并且具有無毒副作用、體內(nèi)半衰期長、成本低廉等其他溶栓劑所不具備的特點(diǎn)，受到各國科學(xué)家的廣泛關(guān)注和深入研究。現(xiàn)已證明，微生物纖溶酶極有可能成為一種預(yù)防血栓栓塞類疾病的優(yōu)良保健食品和藥物。目前已經(jīng)有很多學(xué)者分別從枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[6]、根霉(Rhizopus sp.)[7]、米曲霉(Aspergillus oryzae)[8]、蛹蟲草(Cordyceps militaris)[9]、黃綠蜜環(huán)菌(Armillaria)[10]等中發(fā)現(xiàn)纖溶酶。本研究從產(chǎn)醬香細(xì)菌中篩選高產(chǎn)纖溶酶的菌株，在國內(nèi)外文獻(xiàn)中尚未見報(bào)道，該菌的篩選鑒定將為下一步進(jìn)行誘變、提高其產(chǎn)酶能力、微生物纖溶酶的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)及微生物纖

溶酶高效表達(dá)基因工程菌的構(gòu)建打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

產(chǎn)醬香參照菌株：枯草芽孢桿菌B1⑥(Bacillus subtilis B1⑥)由貴州大學(xué)微生物教研室分離并保存；不產(chǎn)醬香參照菌株：枯草芽孢桿菌10075(Bacillus subtilis 10075)為中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(CICC)保藏菌株。

1.2 材料與試劑

貴州茅臺(tái)酒廠、習(xí)酒廠、懷莊酒廠等貴州省11家酒廠的酒曲、酒糟、窖泥等34個(gè)樣品；家雞購于貴陽醫(yī)學(xué)院。

尿激酶(1280U/支) 中國藥品生物制品鑒定所；凝血酶(200U/支)、纖維蛋白原(1g/瓶) Sigma公司；牛血清白蛋白(5g/瓶) Solarbio公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器與設(shè)備

WFZ UV-2000型紫外分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；SHZ-82A氣浴恒溫振蕩器 常州奧華儀器有限公司；2-16K高速冷凍離心機(jī) Sigma公司；SHP-250型智能生化培養(yǎng)箱 上海光都儀器設(shè)備有限公司。

1.4 培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、瓊脂20g/L、pH7.2～7.4，121℃，0.1MPa，滅菌30min；普通肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏3g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 5g/L、pH7.2～7.4，121℃，0.1MPa，滅菌30min；產(chǎn)醬香篩選培養(yǎng)基：黃豆用水浸泡3～8h，去皮，分裝三角瓶(25g/250mL)，121℃，0.1MPa，滅菌30min；產(chǎn)纖溶酶初篩培養(yǎng)基：脫脂奶粉50g/L(115℃滅菌20min)，瓊脂15g/L(121℃，滅菌30min)，冷卻至50℃左右混勻；種子培養(yǎng)基Ⅰ：蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 5g/L、pH 7.2～7.4，121℃，0.1MPa，滅菌30min；種子培養(yǎng)基Ⅱ：葡萄糖10g/L、蛋白胨10g/L、Na2HPO42g/L、NaH2PO41g/L、CaCl20.2g/L、MgSO40.5g/L、pH7.0，121℃，0.1MPa、滅菌20min；發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ：葡萄糖5g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、K2HPO42g/L、KH2PO41g/L、CaCl20.2g/L、MgSO40.5g/L、pH7.0，121℃，0.1MPa、滅菌20min；發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、Na2HPO42g/L、NaH2PO41g/L、CaCl20.2g/L、MgSO40.5g/L、pH7.0，121℃，0.1MPa、滅菌20min。

1.5 方法

1.5.1 菌株的分離

稱取樣品10g放入盛有90mL無菌水三角瓶中，充分振蕩搖勻，再稀釋成10-2～10-10不同稀釋度的樣品懸液，選擇10-3至10-107個(gè)稀釋度涂布于分離培養(yǎng)基平板中，37℃倒置培養(yǎng)24h。挑取單菌落經(jīng)平板劃線純化，簡單染色鏡檢為純種后轉(zhuǎn)接于營養(yǎng)瓊脂斜面，37℃恒溫培養(yǎng)24h，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 產(chǎn)醬香菌株的篩選

將分離得到的菌株經(jīng)兩次活化后按體積分?jǐn)?shù)20%接種于普通肉湯培養(yǎng)基，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)24h，取400μL培養(yǎng)液接種于已滅菌的產(chǎn)醬香篩選培養(yǎng)基中，按30℃→35℃→40℃→45℃升溫發(fā)酵各24h，發(fā)酵結(jié)束后由5人觀察嗅聞評(píng)價(jià)。

1.5.3 產(chǎn)纖溶酶菌株的初篩

一次初篩：將篩選得到的產(chǎn)醬香菌株培養(yǎng)18h后點(diǎn)種于產(chǎn)纖溶酶初篩培養(yǎng)基中，37℃倒置培養(yǎng)48h，分別測量菌落直徑(d)與透明圈直徑(D)3次，計(jì)算平均值，D/d值表示菌株產(chǎn)蛋白酶能力的大小，將比值較大的菌株確定為二次初篩的出發(fā)菌株。

二次初篩：將已活化的出發(fā)菌株按體積分?jǐn)?shù)20%接于種子培養(yǎng)基Ⅰ，37℃、180r/min搖床培養(yǎng)24h，按體積分?jǐn)?shù)5%接種量轉(zhuǎn)接于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ的三角瓶(250mL)中，37℃、180r/min搖床培養(yǎng)36h，冷凍離心取上清液測中性蛋白酶活力[11]。

1.5.4 產(chǎn)纖溶酶菌株的復(fù)篩

挑取一環(huán)產(chǎn)纖溶酶初篩菌株，轉(zhuǎn)接于裝有50mL種子培養(yǎng)基Ⅱ的三角瓶(250mL)中，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)24h，按體積分?jǐn)?shù)4%接種量轉(zhuǎn)接于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ的三角瓶(250mL)中，30℃、150r/min搖床培養(yǎng)96h， 4℃、8000r/min、離心20min，取上清液10μL點(diǎn)樣于纖維蛋白平板中。室溫放置10min，再置于37℃恒溫培養(yǎng)18h，測其溶解圈垂直直徑，各測3次計(jì)算平均值，垂直直徑的乘積為溶解圈的面積。溶解圈面積最大的菌株作為發(fā)酵生產(chǎn)纖溶酶的目的菌株。

1.5.5 纖溶酶活性的測定

參照文獻(xiàn)[12]的方法，稍加修改。取質(zhì)量濃度2g/100mL 瓊脂溶液約10mL于直徑9cm平板中，冷卻凝固形成第一層。取質(zhì)量濃度1g/100mL瓊脂糖溶液10mL，3.72mg/mL纖維蛋白原溶液6.25mL，20U/mL凝血酶125μL，于50℃左右混勻，倒入平板形成第二層，室溫放置至乳白色，用直徑為3mm的打孔器打孔。分別取20、40、60、80、100U/mL尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品10μL點(diǎn)樣于上述平板的小孔中，37℃溫育18h，測定溶解圈的垂直直徑。根據(jù)報(bào)道[13]，溶解圈的兩垂直直徑之積(A)與酶濃度(c)有以下關(guān)系，A=K×c，所以以測定的不同酶濃度的溶解圈垂直直徑乘積的對(duì)數(shù)對(duì)不同酶濃度標(biāo)準(zhǔn)品的對(duì)數(shù)作一元線性回歸。根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品發(fā)酵液纖溶酶活力。

1.5.6 蛋白質(zhì)含量的測定

參照文獻(xiàn)[12]測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.5.7 產(chǎn)纖溶酶目的菌株的初步鑒定

參照文獻(xiàn)[14]的方法。

1.5.8 抗凝血實(shí)驗(yàn)[15]

3支滅菌小試管，分別加1mL 0.9g/100mL NaCl(用0.005mol/L PBS，pH7.4配制)，發(fā)酵上清液，尿激酶100U/mL(0.9g/100mL NaCl配制，pH7.4)，然后再在每管加1mL新鮮雞血血液，輕輕振蕩、混勻，置37℃恒溫水浴，定時(shí)觀察、記錄、拍照。

1.5.9 體外血栓溶解實(shí)驗(yàn)[15]

取新鮮雞血血液，制成實(shí)驗(yàn)性血栓。將血栓切割成大致相等的若干份，稱質(zhì)量后分別加入滅菌的試管中，再分別加入1mL 0.9g/100mL NaCl(用0.005mol/L PBS，pH7.4配制)、發(fā)酵上清液(根據(jù)1.2.4節(jié)測定的酶活，用0.9g/100mL NaCl將其稀釋至對(duì)照尿激酶的活性)、尿激酶100U/mL(0.9g/100mL NaCl配制，pH7.4)、然后置于37℃恒溫水浴，分別于2、4、6h后取出試管，小心取出血栓，并用濾紙條輕輕吸干血栓表面水分后，依次稱質(zhì)量，計(jì)算血栓溶解率。

式中：m1為實(shí)驗(yàn)前血栓質(zhì)量；m2為實(shí)驗(yàn)后血栓質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

采用分離培養(yǎng)基，從34個(gè)樣品中經(jīng)分離純化共獲得451株菌株，接于營養(yǎng)瓊脂斜面4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 產(chǎn)醬香細(xì)菌的篩選

從451株細(xì)菌中篩選出產(chǎn)醬香細(xì)菌62株，其中24株產(chǎn)醬香結(jié)果優(yōu)良，16株產(chǎn)醬香結(jié)果較好，22株微產(chǎn)醬香，結(jié)果見表1。

2.3 產(chǎn)纖溶酶菌株的初篩

62株產(chǎn)醬香的細(xì)菌均能不同程度產(chǎn)生蛋白酶，其D/d＞1.5。其中有20株產(chǎn)醬香細(xì)菌的D/d≥3.0，將其作為二次初篩的出發(fā)菌株。根據(jù)蛋白酶活力測定，確定酶活力較高的9株菌作為產(chǎn)纖溶酶篩選的出發(fā)菌株，結(jié)果見表2。

2.4 產(chǎn)纖溶酶菌株的復(fù)篩

由表3可見，9株產(chǎn)醬香細(xì)菌均有較高的纖溶酶活力，其中菌株GZJSⅠ-2產(chǎn)纖溶酶活力最高，溶解圈直徑最大，其溶解圈面積為541.96mm2。纖維蛋白平板法測定的溶解圈見圖1。

表1 產(chǎn)醬香菌株篩選結(jié)果Table 1 Screening results of Maotai-flavor strains

表2 產(chǎn)纖溶酶菌株初篩結(jié)果Table 2 Preliminary screening results of strains with fibrinolytic enzyme activity

表3 產(chǎn)纖溶酶菌株復(fù)篩結(jié)果Table 3 Secondary screening results of strains with fibrinolytic enzyme activity

圖1 纖維蛋白平板法測定的溶解圈Fig.1 Transparent circle determination on a fibrin plate

2.5 高活性纖溶酶菌株GZJSⅠ-2的初步鑒定

2.5.1 菌落形態(tài)觀察

普通瓊脂營養(yǎng)平板37℃培養(yǎng)24h，菌株GZJSⅠ-2的單菌落為近圓形，白色，邊緣不光滑呈波狀，中央突起有褶皺呈火山口狀，不透明，質(zhì)地干燥，無光澤。在液體肉湯培養(yǎng)基中形成菌膜。

2.5.2 菌體形態(tài)觀察

菌株GZJSⅠ-2革蘭氏染色呈陽性(圖2)，菌體為桿狀，兩端鈍圓，長為1.88μm，寬為0.77μm；形成芽孢，芽孢偏端生，呈柱狀，不膨大，長為1.15μm，寬為0.63μm。

圖2 菌株GZJSI-2的革蘭氏染色結(jié)果Fig.2 Gram staining results of strain GZJSI-2

2.5.3 生理生化鑒定

綜合以上各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，并查閱《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[16]及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[14]將菌株GZJSⅠ-2初步鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

表4 GZJSI-2菌株的生理生化特征Table 4 Biochemical and physiological properties of strain GZJSI-2

2.5.4 抗凝血實(shí)驗(yàn)

圖3 抗凝血實(shí)驗(yàn)Fig.3 Anticoagulant effect of the fermentation supernatant of GZJSI-2

以生理鹽水(0.9g/100mL NaCl)為陰性對(duì)照，尿激酶為陽性對(duì)照，用GZJSⅠ-2的發(fā)酵上清液進(jìn)行抗凝血實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：陰性對(duì)照最初就全部形成血栓，37℃恒溫孵育，形成的血栓幾乎沒有變化；陽性對(duì)照最初僅形成了少量血栓，隨著37℃恒溫孵育，由于尿激酶的濃度很小，導(dǎo)致水分滲出，血栓逐漸萎縮，發(fā)生的血栓溶解速率很慢，溶液較清，含有極少的紅細(xì)胞；GZJSⅠ-2的發(fā)酵上清液組最初形成了更少量的血栓，隨著37℃恒溫孵育，血栓逐漸變小直至完全消失(圖3)。結(jié)果表明，GZJSⅠ-2菌株的發(fā)酵上清液具有明顯的抗凝血作用。

2.5.5 體外血栓溶解實(shí)驗(yàn)

圖4 血栓溶解率曲線Fig.4 Thrombolysis curves of the fermentation supernatant of GZJSI-2, urokinase and normal saline

由圖4可見，生理鹽水對(duì)血栓有輕微溶解作用，尿激酶和GZJSⅠ-2菌株發(fā)酵上清液都對(duì)血栓有明顯的溶解作用，后者的血栓溶解作用略高于尿激酶。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)從不同酒廠的酒曲、酒糟、窖泥中分離篩選出62株產(chǎn)醬香的細(xì)菌，通過酪蛋白平板法測定，這些產(chǎn)醬香細(xì)菌均具有相對(duì)較高的產(chǎn)蛋白酶能力。由此可見，蛋白酶是產(chǎn)醬香的必要條件。蛋白酶活力的大小可能是影響美拉德反應(yīng)產(chǎn)醬香的一個(gè)重要因素，蛋白酶活力低，其分解蛋白產(chǎn)生的氨基酸就少，造成美拉德反應(yīng)前體物質(zhì)的缺乏，從而影響醬香風(fēng)味的形成。這與邵元龍等[17]的研究結(jié)果一致。

血管堵塞所引起的心肌梗塞和腦梗塞，是當(dāng)前臨床死亡的主要原因之一。其病因是纖維蛋白聚集于動(dòng)脈血管壁所導(dǎo)致。因此，研制高效、特異、安全、副作用小的溶血栓藥物，一直是近年來全世界范圍的熱門課題。而微生物是獲得溶栓藥物的一個(gè)重要來源，國際上多采用分離的產(chǎn)纖溶酶菌株作為出發(fā)菌株，通過改良菌種和優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)、生產(chǎn)工藝等方法來提高微生物纖溶酶活性。國內(nèi)微生物纖溶酶的研究主要是菌株篩選和發(fā)酵條件優(yōu)化等，目前還沒有微生物纖溶酶產(chǎn)品上市，主要原因是微生物纖溶酶單位發(fā)酵液中的酶產(chǎn)量低[18]。用野生型微生物進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí)的纖溶酶活力一般可達(dá)200～300U/mL，誘變優(yōu)化后可達(dá)600～3000U/mL，最高可達(dá)5989U/mL[19]。本實(shí)驗(yàn)報(bào)道的菌株 GZJSⅠ-2發(fā)酵液的纖溶酶活力高達(dá)1479.11U/mL，與已報(bào)道的文獻(xiàn)相比較[6-10]，屬野生型高產(chǎn)纖溶酶菌株。并且該菌經(jīng)黃豆發(fā)酵能產(chǎn)生較好的醬香風(fēng)味，具有較高的產(chǎn)蛋白酶能力，屬多功能菌株。因此，該菌不僅可為白酒釀造、酶制劑、藥物、飼料、香料等產(chǎn)業(yè)提供豐富的生物資源，其較高的纖溶酶活性也為生產(chǎn)新型的溶血栓藥物提供了參考。另外，可將發(fā)酵產(chǎn)生的醬香風(fēng)味與高產(chǎn)纖溶酶相結(jié)合，有望開發(fā)成一種新型的醬香風(fēng)味的功能性保健食品，區(qū)別于納豆和豆豉，創(chuàng)造巨大的經(jīng)濟(jì)效益。目前，國內(nèi)外尚未見醬香型細(xì)菌高產(chǎn)纖溶酶的報(bào)道。但是，與文獻(xiàn)報(bào)道的最高產(chǎn)酶活性比較，該菌的產(chǎn)纖溶酶活性還存在一定的差距，下一步可以通過誘變及發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化，進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶能力。

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Screening of Maotai-flavor Strains Producing Highly Active Fibrinolytic Enzyme

LIN Fen，XIE He*
(College of Life Sciences, Guizhou University, Guiyang 550025, China)

Daqu starter, vinase and pit mud applied for producing Maotai-flavor liquors were used as materials to isolate and screen strains with high activity of fibrinolytic enzyme. Totally 24 bacterial strains having excellent ability to produce Maotaiflavor and 16 ones having good ability to produce Maotai-flavor were obtained. A strain (named GZJSI-2) with the highest activity of fibrinolytic enzyme was screened out of the Maotai-flavor strains and identified as Bacillus subtilis. The activity of fibrinolytic enzyme of the fermentation broth of this strain was approximately 1479.11 U/mL and the specific activity was 21751.62 U/mg. Studies using physiological saline as a negative control and urokinase as a positive control demonstrated that the fermentation supernatant of GZJSI-2 had obvious anticoagulant and thrombolytic effects in vitro. Hence, this strain has a potential application value.

Maotai-flavor bacteria；screening；fibrinolytic enzyme；classification；identification

TS201.3；Q93.331

A

1002-6630(2010)17-0258-05

2009-12-09

林芬(1985—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源學(xué)。E-mail：fenlin0219@163.com

*通信作者：謝和(1963—)，男，副教授，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源學(xué)。E-mail：xieheh@163.com