王海兵，吳曉英*，梁文志，謝羽娜，袁思敏

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006)

煙堿協(xié)同過氧化氫對紅酵母累積番茄紅素的影響

王海兵，吳曉英*，梁文志，謝羽娜，袁思敏

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006)

研究煙堿、雙氧水這兩種效應(yīng)物對紅酵母發(fā)酵累積番茄紅素的影響，發(fā)現(xiàn)其加入的量和加入的時(shí)間對累積量影響顯著。結(jié)果表明，在紅酵母發(fā)酵至36h時(shí)，同時(shí)加入2.5mL/L煙堿和1.6mL/L雙氧水(含30%的過氧化氫)，可使番茄紅素得到大量的積累，達(dá)到86.88mg/L，是不加煙堿和雙氧水時(shí)番茄紅素產(chǎn)量4.10mg/L的21.2倍。

紅酵母；番茄紅素；效應(yīng)物；煙堿；過氧化氫

番茄紅素是一種具有11個(gè)共軛雙鍵的不飽和碳?xì)浠衔?，是類胡蘿卜素的一種。作為一種天然脂溶性色素，番茄紅素在自然界中分布廣泛，主要存在于番茄、胡蘿卜、西瓜、紅色胡椒粉、紅色葡萄柚以及紅色棕櫚油中。研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素有很強(qiáng)的抗氧化作用，其對單線氧的消除能力是β-胡蘿卜素的2倍，在類胡蘿卜素中最強(qiáng)；同時(shí)番茄紅素還具有對自由基的清除、阻斷形成亞硝胺、對細(xì)胞增殖的抑制作用、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、增加免疫力、減少DNA損傷以及促進(jìn)細(xì)胞間隙連接通訊等作用[1-2]，是一種很重要的生物活性物質(zhì)，并且在預(yù)防和治療前列腺癌、乳腺癌等癌癥，增強(qiáng)人體免疫功能以及心血管疾病方面有巨大的潛力[3]。

目前國內(nèi)外應(yīng)用的番茄紅素的來源主要有兩個(gè)方面：植物提取法和微生物發(fā)酵法。用植物提取法制取番茄紅素，雖然原料來源廣泛易得，但是含量較低、副產(chǎn)物較多，原料供應(yīng)受到氣候與季節(jié)的影響較大，使得生產(chǎn)成本較高；與此相比，微生物發(fā)酵法具有生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)菌可基因改造而大幅提高產(chǎn)量、易于放大和工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛地應(yīng)用于實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中。目前，生產(chǎn)天然類胡蘿卜素的主要菌種為三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)和紅酵母(Rhodotorular)。雖然與三孢布拉氏霉相比，紅酵母的單位產(chǎn)量比較低，但由于其具有營養(yǎng)要求簡單、生長周期短及菌體營養(yǎng)豐富等許多優(yōu)點(diǎn)，具有很高的實(shí)用價(jià)值和很好的工業(yè)開發(fā)前景。

一般情況下，微生物合成的主要類胡蘿卜素，是番茄紅素經(jīng)過環(huán)化和氧化等之后的衍生物，如β-胡蘿卜素、玉米黃素、蝦青素等[4]。因此，針對類胡蘿卜素這樣的一個(gè)合成途徑，可以從兩個(gè)方面來提高番茄紅素的累積：一是要加強(qiáng)和促進(jìn)類胡蘿卜素合成途徑，二是要控制番茄紅素后續(xù)的過程，阻止其環(huán)化反應(yīng)。目前有人已開始嘗試?yán)么x控制手段，在微生物發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素時(shí)，發(fā)酵到一定時(shí)間點(diǎn)時(shí)添加環(huán)化抑制

劑、氧化劑等效應(yīng)物，使菌體產(chǎn)生和累積番茄紅素[5-7]，取得了較好的結(jié)果。

過氧化氫有很好的氧化性，發(fā)酵過程中它的加入會(huì)使紅酵母產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗逆應(yīng)激反應(yīng)，大大促進(jìn)其類胡蘿卜素合成代謝的進(jìn)行；煙堿是類胡蘿卜素合成途徑中番茄紅素環(huán)化酶的良好抑制劑，它的加入可有效阻止途徑中的環(huán)化反應(yīng)，導(dǎo)致番茄紅素的大量累積。本實(shí)驗(yàn)以黏紅酵母為出發(fā)菌株，在優(yōu)化的類胡蘿卜素發(fā)酵條件下，分別考察加入不同煙堿量和同時(shí)加入不同的雙氧水量對合成番茄紅素的影響，并在不同的培養(yǎng)時(shí)間里，分別添加氧化劑雙氧水和環(huán)化抑制劑煙堿兩種效應(yīng)物，以黏紅酵母中的番茄紅素達(dá)到大量積累。

1 材料與方法

1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)室篩選得到的一株類胡蘿卜素高產(chǎn)菌黏紅酵母2.27。

1.2 試劑與儀器

番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品 上海融和醫(yī)藥公司；煙堿(95%)西安天則生物技術(shù)有限責(zé)任公司；雙氧水(含體積分?jǐn)?shù)30%H2O2的水溶液)。

SHP-450D型生化培養(yǎng)箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SKYB2112B型恒溫?fù)u床 廣州科橋?qū)嶒?yàn)技術(shù)設(shè)備有限公司；LD5-2A低速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；2802S型紫外分光光度計(jì) 尤尼科(上海)儀器有限公司；1525型高效液相色譜儀、2487型紫外分光檢測器 Waters公司。

1.3 培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法

斜面活化培養(yǎng)基：葡萄糖2g/100mL、蛋白胨1g/100mL、酵母粉1g/100mL、瓊脂2g/100mL、自然pH值。液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖2g/100mL、蛋白胨1g/100mL、酵母粉1g/100mL、自然pH值。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5g/100mL、蛋白胨1.5g/100mL、酵母粉 1g/100mL、核黃素 0.5mg/L、吐溫-80 1.5%(體積分?jǐn)?shù))、初始pH5。

種子斜面活化培養(yǎng)：挑黏紅酵母一環(huán)，接入斜面活化培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)48h；液體種子培養(yǎng)：從活化了的斜面種子中挑取培養(yǎng)物兩環(huán)，接于裝有30mL液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶內(nèi)，28℃條件下200r/min振蕩培養(yǎng)24h；液體發(fā)酵培養(yǎng)：以5%的接種量，將液體種子接入到裝有25mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在光照條件下，28℃，200r/min振蕩培養(yǎng)96h。

1.4 生物量的測定

發(fā)酵結(jié)束后，取10mL發(fā)酵液轉(zhuǎn)入離心管中，以4000r/min離心10min，棄上清液，沉淀水洗后再次離心，得酵母泥，于55℃過夜烘干，稱干質(zhì)量。

1.5 番茄紅素的提取

發(fā)酵結(jié)束后，參照文獻(xiàn)采用熱酸法破壁[8]，丙酮浸提：取發(fā)酵液10mL轉(zhuǎn)入離心管中，以4000r/min離心10min，沉淀水洗后得酵母泥；加入3mol/L的HCl溶液5mL，混合均勻后浸泡1.5h，然后再沸水浴4min，迅速冷卻，再4000r/min離心20min，得沉淀水洗2次，離心得到菌體殘片；加入丙酮9mL，混合均勻，浸提1h，4000r/min離心20min，得到色素丙酮浸提液。

1.6 番茄紅素含量測定方法

將色素提取液用0.22μm的微孔濾膜過濾后，以高效液相色譜法(HPLC)測定提取液中番茄紅素的含量。同時(shí)配制不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在相同條件下測定，根據(jù)峰面積制備標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

Waters-1525高效液相色譜儀；色譜柱為：C-18硅膠柱(250mm×4.6mm，5μm)；Binary高效泵；檢測器為：Waters-2487，DoubleλAbsorbance Detector；數(shù)據(jù)分析軟件：Breeze。

高效液相色譜條件：流動(dòng)相為乙腈和二氯甲烷，其體積比為10:90，檢測波長為472nm，流速為1.0mL/min，柱溫為28℃，進(jìn)樣量為10μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確稱量2.5mg的番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮溶解，定容于10mL的棕色容量瓶中，質(zhì)量濃度為250μg/mL。再分別稀釋成50、100、150、200、250μg/mL的質(zhì)量濃度梯度，過濾后HPLC檢測，數(shù)據(jù)處理，得到峰面積與質(zhì)量濃度的關(guān)系曲線如圖1。

圖1 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of lycopene

2.2 環(huán)化酶抑制劑煙堿的加入量對番茄紅素積累的影響

當(dāng)液體發(fā)酵到48h時(shí)，加入不同量的煙堿，測定環(huán)化酶抑制劑的不同加入量對黏紅酵母累積番茄紅素的影響(見圖2)。

從圖2可以看出，隨著環(huán)化酶抑制劑煙堿加入量的增加，黏紅酵母菌體的生物量和番茄紅素的累積量都先

增大后減小。在1.25mL/L的煙堿加入量時(shí)，黏紅酵母生物量達(dá)到最大，為20.36g/L；在2.5mL/L的加入量時(shí)，番茄紅素的累積量達(dá)到最大，為19.93mg/L。雖然2.5mL/L的煙堿加入量對黏紅酵母的生物量的增加會(huì)有一定的不利影響，但卻極大的促進(jìn)了番茄紅素的累積，因此，選擇2.5mL/L為煙堿的最佳加入量。

圖2 煙堿添加量對番茄紅素合成的影響Fig.2 Effect of amount of individually added nicotine on the biosynthesis of lycopene

2.3 添加環(huán)化抑制劑煙堿的同時(shí)，氧化劑雙氧水的加入量對番茄紅素累積的影響

黏紅酵母發(fā)酵的過程中，在發(fā)酵至48h時(shí)加入2.5mL/L煙堿的同時(shí)，加入不同量的雙氧水(含30%H2O2的水溶液)，對黏紅酵母累積番茄紅素的影響見圖3。

圖3 H2O2添加量對番茄紅素合成的影響Fig.3 Effect of amount of hydrogen peroxide added together with nicotine on the biosynthesis of lycopene

從圖3可以看出，隨著雙氧水加入量的增加，黏紅酵母的生物量呈現(xiàn)微弱增大的趨勢，而番茄紅素累積量則是先增大后減小。在3.2mL/L的雙氧水加入量時(shí)，黏紅酵母生物量達(dá)到最高，為22.34g/L；在1.6mL/L的加入量時(shí)，番茄紅素的累積量達(dá)到最大，為65.84mg/L。在這種雙氧水添加量比較小的情況下，雙氧水的加入實(shí)際上增加了發(fā)酵液的溶氧含量，促進(jìn)了菌體的生長，所以生物量隨添加量的增大而增大；過氧化氫的氧化性刺激，激發(fā)了菌體的應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)了抗氧化性類胡蘿卜素合成途徑的進(jìn)行，但過量過氧化氫又會(huì)消耗一部分生成的番茄紅素，所以，番茄紅素的累積量先上升后下降。綜合考慮，選擇雙氧水1.6mL/L為最佳加入量。

2.4 環(huán)化抑制劑和雙氧水不同時(shí)間加入對番茄紅素累積的影響

液體發(fā)酵黏紅酵母生產(chǎn)類胡蘿卜素的過程中，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)加入2.5mL/L的環(huán)化抑制劑煙堿和1.6mL/L的氧化劑雙氧水，最后番茄紅素的累積量見圖4。

圖4 兩種效應(yīng)物的加入時(shí)間對番茄紅素合成的影響Fig.4 Effect of addition time point for the two effectors on the biosynthesis of lycopene

從圖4可以看出，隨著環(huán)化抑制劑與雙氧水同時(shí)加入時(shí)間的推移，黏紅酵母生物量是逐漸增大的，番茄紅素的累積量先增大，后顯著減小。在發(fā)酵至72h同時(shí)加入環(huán)化酶抑制劑和過氧化氫，菌體的生物量達(dá)到了最大，為22.19g/L；在發(fā)酵至36h時(shí)同時(shí)加入，番茄紅素的累積量達(dá)到了最大，為86.88mg/L。

環(huán)化抑制劑和過氧化氫都會(huì)對菌體生物量的增加產(chǎn)生一定的不利作用，特別在發(fā)酵早期加入影響更大，而隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，菌齡的增長和菌體的成熟，其抗逆性也增強(qiáng)了，所以，后期的加入并不會(huì)顯著影響菌體的生物量，因而出現(xiàn)菌體生物量隨煙堿和過氧化氫加入時(shí)間的推移而增大；類胡蘿卜素是黏紅酵母的一種次生代謝產(chǎn)物，主要在發(fā)酵對數(shù)后期和穩(wěn)定期時(shí)合成，因此必須在穩(wěn)定期前加入環(huán)化抑制劑和過氧化氫，這樣才能讓番茄紅素大量積累，所以出現(xiàn)在穩(wěn)定期前加入以上兩種效應(yīng)物時(shí)，番茄紅素的累積量大幅上升的現(xiàn)象。

圖5、6、7分別是番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品丙酮溶液、黏紅酵母發(fā)酵至36h時(shí)同時(shí)添加了2.5mL/L的環(huán)化抑制劑煙堿和1.6mL/L的氧化劑雙氧水的菌體丙酮浸提液和未添加煙堿和雙氧水的發(fā)酵菌體丙酮浸提液在相同的色譜條件下，經(jīng)過HPLC后得到的色譜圖。

圖5 番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC profile of lycopene standard

圖6 發(fā)酵至36h時(shí)添加兩種效應(yīng)物的發(fā)酵菌體浸提液的高效液相色譜圖Fig.6 HPLC profile of the extract from Rhodotorula cells with additions of the two effectors at 36 h of fermentation

圖7 不加效應(yīng)物的發(fā)酵菌體浸提液的高效液相色譜圖Fig.7 HPLC profile of the extract from Rhodotorula cells without additions of the two effectors

從圖5、6可以看出，添加了效應(yīng)物的黏紅酵母菌體的丙酮提取液中主要成分為番茄紅素(保留時(shí)間分別為3.470min、3.506min，基本一致)，再根據(jù)圖6、7的曲線比較，可以看到未添加效應(yīng)物前，番茄紅素含量很少，產(chǎn)物主要是環(huán)化和氧化了的類胡蘿卜素，添加了效應(yīng)物后，環(huán)化的類胡蘿卜素大大減少了，而番茄紅素量卻顯著增加。因此可以得出，煙堿和雙氧水的加入極大的阻礙了類胡蘿卜素合成中的環(huán)化過程，導(dǎo)致了大量番茄紅素的累積。

3 結(jié)論與討論

本研究以煙堿和雙氧水作為效應(yīng)物，在黏紅酵母2.27發(fā)酵至36h時(shí)，向發(fā)酵培養(yǎng)基中同時(shí)添加2.5mL/L的環(huán)化抑制劑煙堿和1.6mL/L的氧化劑雙氧水，可使菌體大量累積番茄紅素，達(dá)到86.88mg/L，是不添加這兩種物質(zhì)時(shí)產(chǎn)量(4.10mg/L)的21.2倍。本研究中黏紅酵母2.27番茄紅素產(chǎn)量，比楊建明等[5]報(bào)道的紅酵母番茄紅素產(chǎn)量(11.79mg/L)、汪福源等[9]誘變得到的突變紅酵母番茄紅素產(chǎn)量(5.53mg/L)都高出很多；同時(shí)，由于煙堿易揮發(fā)，易溶于水，在色素提取中可方便去除；雙氧水分解產(chǎn)物為水，安全無毒，可滿足醫(yī)藥和食品行業(yè)對番茄紅素生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)，可直接在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用，因此，本研究結(jié)果對于進(jìn)一步的生產(chǎn)應(yīng)用有重要的參考價(jià)值。

隨著大量研究工作的展開，類胡蘿卜素的生物合成途徑已經(jīng)研究清楚，各反應(yīng)中作為催化劑的酶的基因也已測序出來，為生產(chǎn)番茄紅素提供了很好的借鑒。利用類胡蘿卜素合成途徑的代謝控制手段，可以嘗試從以下幾個(gè)方面去增加番茄紅素的累積發(fā)酵水平[10]：1)構(gòu)建新的代謝流來生產(chǎn)番茄紅素。2)增強(qiáng)番茄紅素合成代謝流：增加IPP 、GGPP 等前體底物的代謝流提高產(chǎn)量；尋找代謝途徑的關(guān)鍵酶，加速限速反應(yīng)，增強(qiáng)八氫番茄紅素代謝流提高產(chǎn)量。3)打斷其他競爭代謝流提高產(chǎn)量。

本研究就是利用煙堿作為環(huán)化抑制劑，打斷了番茄紅素繼續(xù)轉(zhuǎn)化成其他類胡蘿卜素的代謝流；同時(shí)以雙氧水為氧化劑，對黏紅酵母的刺激增強(qiáng)了番茄紅素的合成代謝流，才得以使番茄紅素大量積累。從理論上講，還可以利用基因敲除或iRNA沉默技術(shù)[11]，終止番茄紅素環(huán)化酶基因的表達(dá)，使其得到積累，或者添加麥角固醇合成抑制劑[12]，阻抑麥角固醇的合成代謝，使兩者共同前體累積，以此增加番茄紅素合成，或者添加前體MVA合成酶的激活劑青霉素[13]，促進(jìn)番茄紅素的積累。目前的工作正在嘗試從更多的方面加以實(shí)驗(yàn)，考察不同效應(yīng)物以及它們之間的相互作用，以便將黏紅酵母的番茄紅素積累水平進(jìn)一步提高。

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Effect of Simultaneous Additions of Nicotine and Hydrogen Peroxide on the Biosynthesis of Lycopene in Rhodotorula

WANG Hai-bing，WU Xiao-ying*，LIANG Wen-zhi，XIE Yu-na，YUAN Si-min
(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)

The effect of simultaneously added nicotine and hydrogen peroxide on lycopene accumulation during Rhodotorula fermentation was explored. Amounts and addition time point of nicotine and hydrogen peroxide significantly affected the biosynthesis of lycopene during fermentation. A maximum lycopene content of 86.88 mg/L was achieved after Rhodotorula fermentation for 36 h with additions of 2.5 mL/L nicotine and 1.6 mL/L hydrogen peroxide, which was 21.2 times higher than that without additions of nicotine and hydrogen peroxide.

Rhodotorula；lycopene；effector；nicotine；hydrogen peroxide

TS201.3

A

1002-6630(2010)17-0254-04

2010-01-19

華南理工大學(xué)學(xué)生研究計(jì)劃項(xiàng)目(SRP)

王海兵(1986—)，男，碩士研究生，主要從事生物制藥研究。E-mail：2004seaside@163.com

*通信作者：吳曉英(1961—)，女，副教授，碩士，主要從事生物制藥和生物活性物質(zhì)的研究。

E-mail：xywu@scut.edu.cn