于玉鳳，陸兆新，汪 瑾，陳舟舟，盧亞萍,,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

高效產(chǎn)脂肪酶菌株Burkholderia cepacia C1產(chǎn)酶條件優(yōu)化

于玉鳳1，陸兆新2，汪 瑾1，陳舟舟1，盧亞萍1,2,*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

從油菜地土壤中分離到一株高效產(chǎn)脂肪酶菌株C1，經(jīng)鑒定為Burkholderia cepacia。為了進(jìn)一步提高C1脂肪酶的產(chǎn)量，對(duì)其產(chǎn)酶的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。首先采用單因子試驗(yàn)篩選出最佳碳源為麩皮，最佳氮源為蛋白胨。通過(guò)Plackett-Burman設(shè)計(jì)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的11個(gè)相關(guān)因子進(jìn)行試驗(yàn)，篩選出3個(gè)主效因子，即蛋白胨質(zhì)量濃度、橄欖油質(zhì)量濃度及裝液量。利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面法分析確定主效因子的最優(yōu)水平，得出產(chǎn)脂肪酶菌株C1的最優(yōu)產(chǎn)酶條件：1.50g/100mL麩皮、1.05g/100mL蛋白胨、1.63g/100mL橄欖油、0.2g/100mL K2HPO4、0.05g/100mL MgSO4、初始pH值為7.0、裝液量為30mL。在優(yōu)化條件下30℃，180r/min培養(yǎng)72h，脂肪酶活力達(dá)到89.65U/mL，比未優(yōu)化前的28.50U/mL提高了2.15倍。

脂肪酶；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；響應(yīng)曲面；發(fā)酵優(yōu)化

脂肪酶(EC3.1.1.3)是一類(lèi)重要的甘油酯鍵水解酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物各種組織及微生物中，可以在油水界面上催化脂類(lèi)物質(zhì)分解、合成和酯交換等反應(yīng)，是最早研究的酶類(lèi)之一[1]。微生物脂肪酶具有種類(lèi)多、比動(dòng)物脂肪酶具有更廣的作用pH值和作用溫度范圍、便于進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)和獲取高純度制劑等優(yōu)點(diǎn)而在多個(gè)行業(yè)得到廣泛應(yīng)用，如食品、制革、飼料、洗滌、油酯化工等[2-3]。不同種屬的微生物所產(chǎn)生的脂肪酶具有不同的催化特性，因此人們致力于發(fā)現(xiàn)具有不同催化特性(如耐高溫、耐低溫、耐有機(jī)溶劑、位置和底物選擇性)的脂肪酶產(chǎn)生菌以滿足不同的工業(yè)生產(chǎn)需求。從自然界尋找產(chǎn)生優(yōu)良特性的脂肪酶的菌株，是促進(jìn)脂肪酶研究

與應(yīng)用的有效途徑之一。

Burkholderia屬細(xì)菌所產(chǎn)脂肪酶具有活性高、耐高溫、耐有機(jī)溶劑、耐表面活性劑等優(yōu)良特性，已被深入研究并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)[4-5]。本實(shí)驗(yàn)從油菜地土壤中分離高效產(chǎn)脂肪酶菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生化特性及16S rDNA鑒定該菌為Burkholderia cepacia。響應(yīng)曲面法等發(fā)酵條件優(yōu)化方法常被用于提高菌株的產(chǎn)酶量，如Dandavate等[6]、汪小鋒等[7]用響應(yīng)曲面法優(yōu)化洋蔥假單胞菌PCL-3的產(chǎn)脂肪酶發(fā)酵條件，將產(chǎn)酶活性提高了1.93倍。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)曲面法對(duì)B. cepacia C1菌的產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為進(jìn)一步規(guī)模生產(chǎn)、分離純化及應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣

本實(shí)驗(yàn)所用土壤樣品采自江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)院多年種植油菜的試驗(yàn)田。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：酵母抽提物2g/L、橄欖油5g/L、K2HPO41g/L、MgSO40.1g/L、(NH4)2SO41g/L、NaCl 0.5g/L，自然pH值；初篩培養(yǎng)基：乳化橄欖油10g/L、K2HPO41g/L、MgSO40.1g/L、(NH4)2SO41g/L、KCl 0.5g/L、瓊脂粉15g/L，自然pH值；羅丹明B復(fù)篩培養(yǎng)基：LB平板中添加0.001% 羅丹明 B和1%乳化橄欖油；產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10g/L、酵母抽提物5g/L、K2HPO42g/L、橄欖油10g/L、MgSO40.5g/L，自然pH值。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450分光光度計(jì) 日本島津公司；Sartorious 電子精密天平 北京賽多利斯天平有限公司；5804R 冷凍高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；ZD-88-3型雙層落地恒溫振蕩器 太倉(cāng)市光明實(shí)驗(yàn)分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種篩選

5g土壤置于45mL生理鹽水中，加玻璃珠打散。移取5mL到45mL富集培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2～4d。富集培養(yǎng)液梯度稀釋后，涂布到以橄欖油為唯一碳源的初篩平板上，37℃培養(yǎng)2～4d。從初篩平板上挑取有水解圈的菌落，用無(wú)菌牙簽接種到羅丹明B復(fù)篩平板上，37℃培養(yǎng)2～4d。觀察并測(cè)量菌落周?chē)鸁晒馊Φ拇笮?。選取熒光圈直徑/菌落直徑較大的菌落，劃線分離后接種到LB平板中過(guò)夜培養(yǎng)，種子液接入產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)，24h后每隔6h取樣測(cè)酶活力。

1.3.2 脂肪酶活力的測(cè)定

脂肪酶活力測(cè)定參照Lee等[8]的方法，略作修改。取10μL發(fā)酵上清液、100μL 10mmol/L對(duì)硝基苯丁酯(pNPB)加入到2.89mL pH7.4磷酸緩沖液(PBS)中，40℃酶促反應(yīng)，測(cè)定產(chǎn)物對(duì)硝基苯酚在波長(zhǎng)410nm處的吸光度。以已知物質(zhì)的量(0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 μmol)的對(duì)硝基苯酚作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算酶活力。每分鐘產(chǎn)生1μmol對(duì)硝基苯酚定義為1個(gè)酶活力單位。

1.3.3 菌種的鑒定

根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]，對(duì)篩選的菌體進(jìn)行表型和生理生化實(shí)驗(yàn)鑒定。另外，以脂肪酶菌株C1基因組DNA為模板，16S-F(5＇-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3＇)和16S-R(5＇-GGTTACCTTG TTACG ACTT-3＇)為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增其16S RNA的編碼基因。將擴(kuò)增片段回收后測(cè)序，序列在NCBI上檢索比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

通過(guò)多輪初篩和復(fù)篩，得到40株產(chǎn)脂肪酶的細(xì)菌。從羅丹明B復(fù)篩培養(yǎng)基平板上挑取有明顯水解圈的菌落(圖1)，接種到基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在培養(yǎng)至72h時(shí)，其中的一株產(chǎn)酶量最高，酶活力可達(dá)到28.50U/mL，命名為C1。C1菌落呈白色，表面光滑不透明，突起，易挑起，有淡淡的異味。通過(guò)生理生化特性及16S DNA序列分析，確定C1為Burkholderia cepacia。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)C1脂肪酶粗酶液作了初步的酶學(xué)性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)它是高溫脂肪酶(最適溫度為60℃)，最適pH值為9.0，對(duì)大部分有機(jī)溶劑(甲醇、異丙醇、丁醇、甘油、乙酸乙酯、正己烷、甲苯等)具有很好的耐受性。由此確定C1脂肪酶是一種具有優(yōu)良特性的脂肪酶，以下實(shí)驗(yàn)通過(guò)改善發(fā)酵條件來(lái)提高其脂肪酶的產(chǎn)量。

2.2 最佳碳、氮源的選擇

改變產(chǎn)酶培養(yǎng)基中碳源的種類(lèi)，以質(zhì)量濃度分別為0.5g/100mL和1g/100mL的蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、玉米粉、淀粉、麩皮和米糠作為碳源進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在篩選出最佳碳源的基礎(chǔ)上，分別以酵母膏、蛋白胨、牛

肉膏、大豆粉、尿素、(NH4)2SO4和KNO3作為氮源進(jìn)行發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵72h時(shí)的酶活力。

圖1 產(chǎn)脂肪酶菌落在羅丹明B復(fù)篩培養(yǎng)基平板上的形態(tài)Fig.1 Morphology of lipase-producing strains on Rhodamine B plate

圖2 不同碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of carbon source type on lipase production

圖3 不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source type on lipase production

由圖2可見(jiàn)，麩皮是最合適的碳源，1g/100mL麩皮作為碳源時(shí)酶活力最高。以1g/100mL麩皮作為碳源，1g/100mL蛋白胨作為氮源時(shí)，脂肪酶產(chǎn)量最高(圖3)。因此在隨后的實(shí)驗(yàn)中選擇麩皮和蛋白胨作為培養(yǎng)基的碳源和氮源。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酶條件

2.3.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選影響產(chǎn)酶的主效因子

依據(jù)已確定的碳源和氮源，以培養(yǎng)基中各種成分質(zhì)量濃度及pH值、裝液量、接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等11個(gè)因素作為研究對(duì)象，考查各個(gè)因子對(duì)C1菌株產(chǎn)酶的影響。實(shí)驗(yàn)采用二水平Plackett-Burman設(shè)計(jì)，每個(gè)因子取高(+1)低(－1)兩個(gè)水平，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表1、2。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及預(yù)測(cè)值Table 1 Plackett-Burman design matrix and actual and predicted values of lipase activity

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)各因素水平及結(jié)果分析Table 2 Significance test for each factor

由表2可知，對(duì)產(chǎn)酶活性有顯著影響(置信度大于95%)的因素有蛋白胨質(zhì)量濃度、橄欖油質(zhì)量濃度和裝液量。這3個(gè)顯著因素中，蛋白胨質(zhì)量濃度和裝液量對(duì)產(chǎn)酶活性為負(fù)效應(yīng)，橄欖油質(zhì)量濃度為正效應(yīng)，對(duì)產(chǎn)酶的影響可以用以下方程表示：＝55.3608－9.4691X＋15.8925X3－8.7803X7，該方程的決定系數(shù)R2值為0.956，表明該回歸方程擬合良好。根據(jù)t檢驗(yàn)結(jié)果可知蛋白胨質(zhì)量濃度、橄欖油質(zhì)量濃度和裝液量為重要因素，適當(dāng)提高橄欖油質(zhì)量濃度、降低蛋白胨質(zhì)量濃度和減少裝液量均能促進(jìn)產(chǎn)酶活性的提高。其他因子對(duì)產(chǎn)酶影響不大，均選擇低水平。

2.3.2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)菌株C1產(chǎn)酶活

性具有顯著影響的因子有蛋白胨質(zhì)量濃度、橄欖油質(zhì)量濃度和裝液量。為了確定顯著因子的最優(yōu)水平，利用響應(yīng)曲面法(Box-Behnken設(shè)計(jì))對(duì)影響菌株C1產(chǎn)酶活性的主效因子進(jìn)一步優(yōu)化。以酶活力為響應(yīng)值，主效因子的水平為自變量，借助試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert version 6.0.10 Trial，進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平表Table 3 Factors and levels in the Box-Behnken design

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值的實(shí)測(cè)值和預(yù)測(cè)值Table 4 Box-Behnken design matrix and actual and predicted values of lipase activity

利用Design Expert 6.0.1 Trial軟件對(duì)表4的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，獲得產(chǎn)酶活力(Y)對(duì)蛋白胨質(zhì)量濃度(X1)、橄欖油質(zhì)量濃度(X3)、裝液量(X7)的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y＝88.15＋0.27X1＋7.71X3－6.56X7－20.83X12－14.97X32－19.45X72＋9.95X1X3－8.85X1X7＋10.28X3X7

表5 二次多項(xiàng)式模型方差分析Table 5 Variance analysis for the developed quadratic polynomial model

由表5可知，該模型極顯著(P=0.0006)，失擬項(xiàng)在α=0.05水平上不顯著(P=0.2727＞0.05)。該模型的R2= 0.9567，R2Adj=0.9011表明模型與實(shí)際情況擬和較好，適用于菌株C1產(chǎn)脂肪酶活力的理論預(yù)測(cè)。

表6 二次多項(xiàng)回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 6 Significance test of each regression coefficient for the developed quadratic polynomial model

由表6可知，橄欖油質(zhì)量濃度和裝液量對(duì)C1菌株產(chǎn)脂肪酶活性的線性效應(yīng)顯著(α=0.05)，但蛋白胨質(zhì)量濃度線性效應(yīng)不顯著；相比較而言，各因素的曲面效應(yīng)極為顯著(α=0.01)；各因素間的交互作用顯著。

2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的分析

由二次回歸方程所作的響應(yīng)曲面圖及其等高線圖見(jiàn)圖4～6。各因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響可通過(guò)該組圖直觀地反映出來(lái)。

圖4 橄欖油質(zhì)量濃度和蛋白胨質(zhì)量濃度對(duì)酶活力影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.4 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of olive oil concentration and peptone concentration on lipase activity

圖4顯示，當(dāng)裝液量在最優(yōu)水平(30mL)時(shí)，橄欖油質(zhì)量濃度和蛋白胨質(zhì)量濃度交互作用顯著，隨著橄欖油質(zhì)量濃度和蛋白胨質(zhì)量濃度的逐漸增加，C1菌株的產(chǎn)酶活性也逐步增加，二者似乎存在協(xié)同效應(yīng)，即在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，只有兩種物質(zhì)質(zhì)量濃度同時(shí)升高時(shí)，才能相對(duì)多地提高C1菌株的產(chǎn)酶活性。橄欖油可視為細(xì)菌的一種較好的碳源，在本實(shí)驗(yàn)中橄欖油既充當(dāng)了誘導(dǎo)物又充當(dāng)了部分碳源[10-12]。而當(dāng)橄欖油質(zhì)量濃度繼續(xù)升高時(shí)，會(huì)抑制C1菌株的產(chǎn)酶活性，可能是因?yàn)榫w繁殖過(guò)快，不利于產(chǎn)物的積累。

圖5 裝液量和蛋白胨質(zhì)量濃度對(duì)酶活力影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.5 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of volume of medium contained in shake flask and peptone concentration on lipase activity

圖5 顯示，當(dāng)橄欖油質(zhì)量濃度為最優(yōu)水平(1.5g/100mL)時(shí)，裝液量和橄欖油質(zhì)量濃度交互作用顯著。隨著裝液量的逐漸減少和蛋白胨質(zhì)量濃度的逐漸增大，C1菌株的產(chǎn)酶活性逐漸增大。裝液量減少，增加了發(fā)酵液中的含氧量，有利于菌體的繁殖和產(chǎn)酶，此時(shí)需較多的蛋白胨來(lái)提供營(yíng)養(yǎng)。但當(dāng)裝液量減小到一定程度時(shí)反而抑制產(chǎn)酶的活性，這可能是由于菌體濃度過(guò)大，有害代謝產(chǎn)物積累多造成的，也可能是由營(yíng)養(yǎng)成分的不足導(dǎo)致。

圖6顯示，當(dāng)?shù)鞍纂速|(zhì)量濃度為最優(yōu)水平(1g/100mL)時(shí)，裝液量和橄欖油質(zhì)量濃度的交互作用顯著。在一定范圍內(nèi)，當(dāng)裝液量增大時(shí)，需增大橄欖油的質(zhì)量濃度。

圖6 裝液量和橄欖油質(zhì)量濃度對(duì)酶活力影響的響應(yīng)曲面和等高線Fig.6 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of volume of medium contained in shake flask and olive oil concentration on lipase activity

對(duì)Y進(jìn)行嶺分析，Y的最大值估計(jì)在89.49U/mL，此時(shí)3個(gè)因子的最優(yōu)試驗(yàn)點(diǎn)(X1，X3，X7)分別為1.05g/100mL、1.63g/100mL、30mL。為驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，在此條件下做了4組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)測(cè)的酶活力均值為89.65U/mL。這與模型預(yù)測(cè)值較為接近，說(shuō)明該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵情況。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)從土壤中篩選得到了一株高產(chǎn)脂肪酶的菌株C1，經(jīng)鑒定為B. cepacia，并對(duì)C1菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先確定最優(yōu)碳、氮源分別為蛋白胨和麩皮，其次通過(guò)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)培養(yǎng)基的各種成分和培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、起始pH值及接種量等11個(gè)相關(guān)因素進(jìn)行篩選，得出橄欖油質(zhì)量濃度對(duì)產(chǎn)酶活性的影響為正效應(yīng)，蛋白胨質(zhì)量濃度和裝液量對(duì)產(chǎn)酶活性的影響為負(fù)效應(yīng)，其他相關(guān)因素沒(méi)有顯著效應(yīng)。然后通過(guò)Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)曲面分析法對(duì)C1菌株產(chǎn)酶活性有顯著影響的3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化組合，最終獲得最優(yōu)產(chǎn)酶條件為：麩皮質(zhì)量濃度1.50g/100mL、蛋白胨質(zhì)量濃度1.05g/100m L、橄欖油質(zhì)量濃度1.63g/100mL、K2HPO4質(zhì)量濃度0.2g/100mL、MgSO4質(zhì)量濃度0.05g/100mL、起始pH7.0，裝液量30mL/250mL，接種量0.5%，溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)時(shí)間為72h。在此條件下，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)獲得產(chǎn)酶活性為89.65U/mL，比未優(yōu)化前的28.50U/mL提高了2.15倍。

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Optimization of Lipase Production from Burkholderia cepacia C1

YU Yu-feng1，LU Zhao-xin2，WANG Jin1，CHEN Zhou-zhou1，LU Ya-ping1,2,*
(1. College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

A stain C1 with high ability to produce lipase was isolated from soil and identified as Burkholderia cepacia. In order to improve the production of lipase, some fermentation conditions were optimized. The optimal carbon source and nitrogen source were determined to be bran and peptone according to single-factor experiments, respectively. Three key factors such as bran, peptone and liquid volume were selected out of eleven factors affecting lipase production by Plaekett-Burman design, and were further optimized by Box-Behnken design and response surface methodology. A maximum lipase activity of 89.65 U/mL was obtained after 72 h fermentation of 30 mL of a fermentation medium composed of wheat bran 1.50 g/100 mL, peptone 1.05 g/100mL, olive oil 1.63 g/100 mL, K2HPO40.2 g/100 mL and MgSO40.05 g/100 mL at an initial pH of 7.0 with 180 r/ min shaking, which was 2.15 times higher than before optimization (28.50 U/mL).

lipase；Plackett-Burman design；response surface methodology；fermentation optimization

Q936

A

1002-6630(2010)17-0218-06

2009-12-21

江蘇省高技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(BE2008308)；國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2008AA10Z309)；

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(BK2007160)

于玉鳳(1987—)，女，本科生，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)及微生物發(fā)酵。E-mail：yuyufeng.good@163.com

*通信作者：盧亞萍(1978—)，女，博士，研究方向?yàn)樯锛夹g(shù)、食品酶學(xué)。E-mail：lyphwq@njau.edu.cn