李華為，趙素云，鐵 梅,*

(1.沈陽師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽 110036 )

富硒金針菇對羥自由基的清除作用

李華為1，趙素云2，鐵 梅2,*

(1.沈陽師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 沈陽 110034；2.遼寧大學(xué)環(huán)境學(xué)院，遼寧 沈陽 110036 )

采用現(xiàn)代分離技術(shù)從富硒金針菇中提取硒多糖和硒蛋白，采用苯酚-硫酸法、ICP-MS法和考馬斯亮藍(lán)染色法對硒多糖中多糖含量、硒含量及硒蛋白中蛋白和硒的含量進(jìn)行測定；在Fenton體系的最佳實驗條件下，研究硒多糖和硒蛋白對羥自由基的清除作用。結(jié)果表明：硒多糖和硒蛋白清除羥自由基的效果比與之相同濃度的無機硒和相同濃度的多糖及蛋白都要明顯；其中，硒多糖的最高清除率可達(dá)65.05%，而硒蛋白的最高清除率可達(dá)19.67%。

金針菇；硒多糖；硒蛋白；羥自由基

硒是人體必需的微量元素，具有多種重要的生物學(xué)功能，對人類健康有著重要意義。不同形態(tài)的硒對機體的生物活性及安全性不同[1]。有機硒比無機硒具有吸收率高、生物活性強、環(huán)境污染小等特點，因此硒的有機化研究是目前硒研究的一個熱點[2-3]。由于人們目前尚不能化學(xué)合成生物有機硒，因此只能通過生物富集進(jìn)行硒的有機化[4]。然而，由于生物體固有的復(fù)雜性，人們對動植物及微生物體中硒的存在形態(tài)以及各形態(tài)中硒的含量尚未完全明了，其中部分形態(tài)的生物活性和化學(xué)穩(wěn)定性還有待于進(jìn)一步研究[5]，致使食品硒源在提供豐富硒的同時，對其安全評價缺乏應(yīng)有的理論依據(jù)。

自由基是人體生命活動中多種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，羥自由基(·OH)是目前所知活性氧中對生物體毒性最強、危害最大的一種[6]。研究表明，自由基與衰老、腫瘤、心腦血管疾病、免疫系統(tǒng)功能減退等疾病相關(guān)[7]。因此，人們越來越認(rèn)識到清除體內(nèi)過剩自由基的重要性，羥自由基清除率也被作為一種物質(zhì)抗氧化作用強弱的重要指標(biāo)。

含硒生物大分子如硒多糖、硒蛋白是生物體將無機硒轉(zhuǎn)化成有機硒的有效形式之一[8]。本實驗以富硒金針菇為載體，采用現(xiàn)代生物分離提取技術(shù)獲得天然有機含硒生物大分子，并考察其對羥自由基的清除作用，比較研究其與無機硒的生物活性，為開發(fā)天然有機硒補劑食品、研究其藥理作用及生物安全性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

富硒金針菇(源于同實驗組同學(xué)自行培養(yǎng))。

硫酸亞鐵、過氧化氫、亞硒酸鈉、鄰二氮菲、無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

7500c型電感耦合等離子體質(zhì)譜ICP-MS 美國Agilent公司；紫外-可見分光光度計 美國Varian公司；CLJ2000型磁力攪拌器 常州國華電器有限公司。

1.2 含硒生物大分子的提取及其組分含量的測定

在最佳浸提條件下提取硒多糖和硒蛋白[8-9]。采用苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍(lán)染色法測得多糖和蛋白的含量[10]。用ICP-MS法測定硒多糖和硒蛋白中硒的含量[11]。

1.3 含硒生物大分子對羥自由基的清除作用

利用Fenton體系[12]測定含硒生物大分子對·OH的清除作用。Fe2+和H2O2反應(yīng)產(chǎn)生·OH，由于·OH可特異地使鐵-鄰二氮菲褪色，根據(jù)褪色程度用比色法于510nm波長處測定·OH含量。在Fenton體系中分別加入一定濃度不同體積的有機硒試液，用去離子水定容至10.0mL。于37℃恒溫水浴中反應(yīng)90min，以5mm比色皿測吸光度A510nm。受試樣表觀羥自由基清除率按下式計算：

2 結(jié)果與分析

2.1 多糖、蛋白及硒含量的確定

圖1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for the determination of polysaccharides

圖2 蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for the determination of proteins

苯酚-硫酸法測定多糖含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，考馬斯亮藍(lán)染色法測定蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得金針菇硒多糖中多糖的質(zhì)量濃度為529.649μg/mL，金針菇硒蛋白中蛋白的質(zhì)量濃度為95.83μg/mL。通過ICP-MS法測得金針菇硒多糖中硒的含量為 0.01956μg/mL，金針菇硒蛋白中硒的含量為483.81μg/g。

2.2 Fenton體系實驗條件的確定

2.2.1 FeSO4、鄰二氮菲及H2O2體積分?jǐn)?shù)對ΔA510nm的影響

圖3 FeSO4濃度對ΔA510nm的影響Fig.3 Effect of FeSO4concentration on ΔA510nm

由圖3可知，隨著FeSO4濃度的增加(固定H2O2體積分?jǐn)?shù)及鄰二氮菲濃度)，ΔA510nm也隨之變大，當(dāng)Fe2+濃度增至0.6mmol/L時，ΔA510nm達(dá)到最大。進(jìn)一步增加Fe2+濃度，ΔA510nm反而下降，故本實驗選取Fe2+濃度為0.6mmol/L。

圖4 鄰二氮菲濃度對ΔA510nmμ的影響Fig.4 Effect of 1,10-phenanthroline concentration onΔA510nmμ

圖5 過氧化氫體積分?jǐn)?shù)對ΔA510nm的影響Fig.5 Effect of H2O2concentration onΔA510nm

H2O2和鄰二氮菲對ΔA510nm的影響均呈正相關(guān)，如圖4、5所示。 因此選擇鄰二氮菲濃度和H2O2體積分?jǐn)?shù)分別為1mmol/L和0.01%。

2.2.2 保溫時間與ΔA510nm的關(guān)系

由于Fenton反應(yīng)具有明顯的動力學(xué)特征，因而在指定的反應(yīng)溫度下(37℃)，反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定時所需要的時間影響ΔA510nm。37℃水浴保溫120min時間內(nèi)，隨著保溫時間的延長ΔA510nm逐漸增大，90min后改變不明顯，所以設(shè)定加熱時間為90min(圖6)。

圖6 保溫時間對ΔA510nm的影響Fig.6 Effect of temperature holding time onΔA510nm

2.3 含硒生物大分子對羥自由基的清除作用

根據(jù)2.2節(jié)所得實驗結(jié)果，按照1.3節(jié)所述方法產(chǎn)生·OH的Fenton體系，分別加入已知硒含量和蛋白含量的硒蛋白、與硒蛋白中硒含量相同的亞硒酸鈉、與硒蛋白中蛋白含量相同的蛋白質(zhì)，使得蛋白質(zhì)的含量或硒的含量在同一水平；依次加入量為1、3、5mL(相應(yīng)硒含量分別為48.38、145.14、241.91μg/g)，測定體系中硒濃度由低到高的變化過程中ΔA510nm，以同樣的方法對硒多糖也進(jìn)行了實驗，結(jié)果如圖7所示。

圖7 含硒生物大分子對羥自由基的清除作用Fig.7 Scavenging effects of Se-binding biopolymers and their native counterparts on hydroxyl free radicals

由圖7可知：無論是A-T組還是B-T組，隨硒濃度的增加，A510nm都在增加；但硒蛋白(硒多糖)的增加比單純無機硒和普通金針菇蛋白(普通金針菇多糖)的增加對A510nm的影響大。對于同一加入量，兩組中無機硒和蛋白(多糖)溶液的A510nm無顯著差異，但硒蛋白(硒多糖)的A510nm卻存在顯著差異。對于從富硒金針菇中提取的兩種含硒生物大分子，隨著硒濃度的增加，硒多糖

A510nm增加的幅度明顯高于硒蛋白。

2.4 清除率的測定

圖8 硒多糖、普通多糖及亞硒酸鈉對·OH的清除率Fig.8 Scavenging effects of Se-binding polysaccharides, pure polysaccharides and Na2SeO3on hydroxyl free radicals

圖9 硒蛋白、普通蛋白及亞硒酸鈉對·OH的清除率Fig.9 Scavenging effects of Se-binding protein, pure protein and Na2SeO3on hydroxyl free radicals

無論是低質(zhì)量濃度組還是高質(zhì)量濃度組，富硒金針菇中的硒多糖或硒蛋白對·OH的清除率均顯著高于普通多糖(蛋白)以及亞硒酸鈉，如圖8、9所示，說明硒增強了多糖或蛋白消除·OH的活性，硒多糖或硒蛋白都比無機硒補劑具有更高的抗氧化作用；此外，在各質(zhì)量濃度組中，硒蛋白對·OH的清除率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于普通蛋白和亞硒酸鈉對·OH的清除率之和，當(dāng)硒多糖的加入量為5mL時，硒多糖對·OH的清除率要大于普通多糖和亞硒酸鈉的加和，說明硒與食用菌蛋白或多糖之間在清除·OH方面存在著協(xié)同作用，此作用可使硒多糖的最高清除率達(dá)65.05%，硒蛋白的最高清除率達(dá)19.67%；實驗還發(fā)現(xiàn)，對于亞硒酸鈉而言，當(dāng)它的質(zhì)量濃度達(dá)到一定值時，隨著質(zhì)量濃度的增加其清除效果會基本保持不變甚至有所降低，說明高質(zhì)量濃度的亞硒酸鈉抑制了硒對·OH的清除作用，以亞硒酸鈉形式存在的硒在相同的硒水平下表現(xiàn)出硒的中毒現(xiàn)象。

2.5 硒多糖與硒蛋白對羥自由基清除作用比較

由圖8、9可知，同一加入量的硒多糖清除·OH的效果明顯的好于硒蛋白，將不同含硒量的硒多糖和硒蛋白對·OH的清除效果比較如圖10所示，結(jié)果表明，欲達(dá)到同樣的清除效果，所需硒多糖中硒的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于硒蛋白中硒的含量，說明富硒金針菇中的硒多糖對·OH的清除效果、抗氧化性、生物活性要明顯好于硒蛋白。這也表明，在金針菇中與多糖結(jié)合的硒是主要存在形態(tài)，說明有機硒水平的高低直接影響著對·OH的清除效果。

圖10 硒多糖與硒蛋白對羥自由基清除作用的比較Fig.10 Comparison of hydroxyl free radical scavenging effects between Se-binding polysaccharides and Se-binding proteins

3 結(jié) 論

通過生物富集培育的富硒金針菇含有大量的有機硒，其主要化學(xué)形態(tài)為硒多糖和硒蛋白，實驗表明，有機硒多糖和硒蛋白相對無機硒具有更好的清除·OH、抗氧化活性作用，而且在富硒金針菇中硒多糖比硒蛋白的這種生物活性更強。這些含硒生物大分子化合物作為一種天然無毒高效的·OH清除劑，無論是對拮抗或抑制體內(nèi)過量自由基的產(chǎn)生，還是增強機體免疫活性方面，都是難得的有機硒源，以金針菇為富硒載體具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Scavenging Effect of Selenium-rich Flammulina velutipes on Hydroxyl Free Radicals

LI Hua-wei1，ZHAO Su-yun2，TIE Mei2,*
(1. College of Chemistry and Life Science, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China；2. School of Environmental Science, Liaoning University, Shenyang 110036, China )

The fruit bodies of selenium-rich Flammulina velutipes were extracted by modern separation techniques to obtain Se-binding polysaccharides and Se-binding proteins. Phenol-sulfuric acid method, ICP-MS and Coomassie brilliant blue G-250 dye method were used for the quantifications of polysaccharides, selenium and proteins, respectively. The scavenging effects of the Se-binding polysaccharide extract and the Se-binding protein extract on hydroxyl free radicals generated in a Fenton system were evaluated under optimal experimental conditions. It was found that the hydroxyl free radical scavenging effects of Sebinding polysaccharides and Se-binding proteins were more obvious than those of inorganic selenium, pure polysaccharides or pure proteins at the same concentrations. The maximum scavenging rates of Se-binding polysaccharides and Se-binding proteins on hydroxyl free radicals were 65.05 % and 19.67%, respectively.

Flammulina velutipes；Se-binding polysaccharides；Se-binding proteins；hydroxyl free radicals

TS255.1

A

1002-6630(2010)17-0018-04

2010-01-07

國家自然科學(xué)基金項目(20611130317/B01)；遼寧省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目(2008227)

李華為(1962—)，男，副教授，碩士，研究方向為分析化學(xué)。E-mail：lhw62515@126.com

*通信作者：鐵梅(1964—)，女，教授，博士，研究方向為天然有機食品生物化學(xué)。E-mail：tiemei07@yahoo.cn