郭莉芳 劉輝賢 邱錦芳 王天星 李 愷 郭紹舉 李 健

保膽治療膽囊結(jié)石的優(yōu)點(diǎn)是既去結(jié)石又保留膽囊,保留了膽道系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的完整性,但其最大的問題是如何防止膽囊結(jié)石的復(fù)發(fā)。為此,2009年 1～3月我們從動物實(shí)驗(yàn)入手,探討膽胃舒顆粒預(yù)防膽囊結(jié)石復(fù)發(fā)的機(jī)制,現(xiàn)將方法和結(jié)果報道如下。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 動物 實(shí)驗(yàn)用 Hartley豚鼠 90只,由廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。級別:普通級。體重:250～350 g。許可證號:scxx(粵)2003-0002。

1.1.2 主要試劑 (1)TRIZOL試劑,為美國 Technolo-gies公司產(chǎn)品。(2)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Access RT-PCRSystem為美國Promega公司生產(chǎn)。(3)豚鼠內(nèi)參 β-actin引物:上游(625-649,24 bp):5'-ctg act gac tac ctc atg aag atc-3';下游(872-852,21 bp):5'-gga agg aag gct gga aga gtg-3'。PCR產(chǎn)物長度:248 bp。(4)豚鼠 CCK-A受體引物:上游(367-386,20 bp):5'-tca tcc cca atc tgc tca ag-3'。下游(658-639,20 bp):5'-cac ata ttc gcg gtc tgg tt-3';PCR產(chǎn)物長度:292 bp。

1.1.3 藥品 膽胃舒顆粒為我院消化科經(jīng)驗(yàn)方,由我院制劑室提供。組成:柴胡 15g,白芍 20 g,金錢草 15g,白術(shù) 15g,郁金 15 g,內(nèi)金 15 g,黃芪 15 g,田七 5g,香附 15g,蒲公英 15g,海螵蛸 20 g,甘草 5g。

1.1.4 飼料 (1)標(biāo)準(zhǔn)豚鼠飼料。(2)膽固醇致石飼料。其中標(biāo)準(zhǔn)豚鼠飼料 95.45%,酪蛋白 1%,蔗糖 1.5%,豬油 1%,纖維素 1%,膽酸 0.02%,膽固醇 0.05%。酪蛋白由廣東環(huán)凱微生物科技公司提供,批號:200703316;膽固醇由廣州器化醫(yī)療設(shè)備有限公司提供,批號:080608;纖維素由廣州器化醫(yī)療設(shè)備有限公司提供,批號:080403;膽酸為瑞士分裝,批號:375217/227103。飼料均由廣東省動物中心提供。許可證號:scxx(粵)2008-0009。

1.1.5 所需主要儀器 凍存管、液態(tài)氮罐。

1.1.6 其他 實(shí)驗(yàn)用的刀、剪、鑷子及玻璃制品均 200℃高溫 2 h烘烤處理。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將 90只豚鼠隨機(jī)分為 3組,每組 30只?？瞻捉M:喂養(yǎng)普通飼料 40 g/只?d-1;模型組:喂養(yǎng)膽固醇結(jié)石致石飼料 40 g/只?d-1;治療組:喂養(yǎng)膽固醇致石飼料 40 g/只?d-1,并加用膽胃舒顆粒溶液 2ml灌胃。

1.2.2 處理 (1)實(shí)驗(yàn) 2個月后每組分為空腹組、餐后組兩亞組,空腹組禁食 24h,在豚鼠眼眶處注射空氣致死,剖開腹腔,用血管鉗阻斷膽囊管,取下膽囊,用注射器抽出膽汁以備檢測。餐后組禁食 12 h后,給液體脂餐 15ml/kg體重灌胃,30min后剖腹取材,以備檢測膽囊收縮功能。(2)膽囊平滑肌組織樣本的提取與保存:完整取下膽囊,縱形剪開,收集膽汁沉積物,濾紙吸凈;然后去掉黏膜及漿膜,保留平滑肌,最后將平滑肌組織裝入凍存管并置入液氮罐中保存。

1.2.3 檢測指標(biāo) (1)膽囊平滑肌中CCK-A受體數(shù)量測定按改良 UPP法及放射配基結(jié)合法(RBA)。將膽囊平滑肌置于 10ml預(yù)冷的勻漿緩沖液中(含蔗糖 250mmol/L,HEPES 10 mmol/L,大豆胰蛋白酶抑制劑 0.01%)充分剪碎,于電動中速勻漿器中勻漿(冰浴),每次 3min,共 3次。充分勻漿后,轉(zhuǎn)移至干凈離心管,2 500 r/min(4℃)離心 5min。收集上清液于干凈離心管,收集沉淀于勻漿緩沖液,重新勻漿、離心,收集上清液。然后,合并兩上清液,20 000 r/m in(4℃)離心 45 m in,收集沉淀,加入 HEPES緩沖液(含 HEPES 25 mmol/L,MgCl22.5mmol/L,NaCl 137mmol/L,NaH2PO40.7mmol/L,Glucose 10mmol/L,明膠 1%)搖勻,即為粗制膜受體。部分粗制膜受體以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn),用 Lowery法測定蛋白含量,其余用于配體結(jié)合反應(yīng)。含膜蛋白 50μg的 HEPES緩沖液 300μl分別和不同濃度的 125I-BH-CCK-OP硫酸酯(1×10-11～1×10-9)反應(yīng),非特異性結(jié)合管另加入 1 000倍過量的未標(biāo)記 CCK-OP硫酸酯。反應(yīng)溫度為 25℃,pH 6.5,時間 30m in,冰冷 HEPES緩沖液 900μl終止反應(yīng)。離心法(4℃,4 500g,20min),收集沉淀,測定放射性計數(shù),利用計算機(jī)獲得 CCK-A受體的最大結(jié)合容量(數(shù)量)。(2)膽囊成石狀況、膽囊收縮功能測定。膽囊成石情況判定:解剖膽囊,以肉眼觀察膽囊內(nèi)有無膽石或膽泥,若膽汁內(nèi)存在成型、粗大顆粒者定性為結(jié)石,其成份用紅外光譜分光光度計定性;膽囊收縮功能:剖腹后自然狀態(tài)下測量膽囊最長長徑(L),及相互垂直兩橫徑(W,H),膽囊體積(v)=0.52×L×W×H(cm3),膽囊收縮功能 =(餐前體積-餐后體積)/餐前體積 ×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

將所得數(shù)據(jù)用 SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料采用 t檢驗(yàn),計數(shù)資料采用 Fisher確切概率法。

2 結(jié) 果

本研究共有 7只動物死亡(占總樣本數(shù)的 5.6%),其中模型組中有 4只動物死亡,治療組中有 3只動物死亡。

2.1 各組動物膽結(jié)石發(fā)生情況

以肉眼所見棕黑色泥沙樣結(jié)石及絮狀沉淀物作紅外光譜鑒定為膽固醇結(jié)石作為成石標(biāo)準(zhǔn):模型組成石率為 92.30%,治療組成石率為 14.81%,顯著低于模型組(P＜0.05)。見表 1。

表1 各組動物成石率比較 例

2.2 各組豚鼠膽囊收縮功能比較(表 2)

表2 各組膽囊收縮功能比較±s,%)

表2 各組膽囊收縮功能比較±s,%)

注:與模型組比較,△P＜0.01,*P＜0.05

組別 例數(shù) 膽囊收縮率空白組 30 68.63±5.79△模型組 26 41.16±4.79治療組 27 65.25±6.24*

2.3 各組 CCK-A受體比較(表 3)

表3 各組膽囊組織 CCK-A受體的變化 (±s,fmol/mg pro)

表3 各組膽囊組織 CCK-A受體的變化 (±s,fmol/mg pro)

注:與模型組比較,△P＜0.01,*P＜0.05

組別 例數(shù) 最大結(jié)合容量空白組 30 62±15△模型組 26 30±11治療組 27 58±12*

3 討 論

膽囊結(jié)石是臨床常見病,據(jù)中華外科學(xué)會膽道學(xué)組 1995年底公布的調(diào)查報告,膽囊結(jié)石幾乎占膽石病的 80%[1]。中醫(yī)認(rèn)為肝失疏泄,膽汁排泄不暢,淤滯日久,聚而成石。故各種病理因素導(dǎo)致膽氣不舒是膽囊結(jié)石的基本病機(jī)。我們科室長期采用內(nèi)鏡微創(chuàng)保膽取石術(shù)(MC)方式,術(shù)后配合膽胃舒顆粒,預(yù)防結(jié)石復(fù)發(fā)[2]。

膽胃舒顆粒專為膽結(jié)石術(shù)后防止結(jié)石復(fù)發(fā)設(shè)計,方中金錢草、柴胡、郁金、香附等利膽、疏肝、止痛;黃芪、白術(shù)、海螵蛸等健脾、益氣、和胃;田七、雞內(nèi)金、郁金等活血、化瘀、散結(jié);蒲公英、金錢草等清熱、化濕;白芍、甘草緩急止痛。能促進(jìn)消化系統(tǒng)功能,增強(qiáng)體質(zhì),明顯促進(jìn)膽汁分泌、代謝及排泄,增強(qiáng)膽囊的收縮功能,排出膽囊內(nèi)淤積及有形微粒,從而有效防止膽囊結(jié)石的復(fù)發(fā)。

本研究顯示,模型組的膽囊收縮功能明顯低于治療組,而CCK-A受體較治療組降低,說明CCK-A受體與膽囊收縮功能呈正相關(guān),這在基因水平上支持 CCK受體在膽囊結(jié)石形成中的重要作用,同時也說明CCK受體數(shù)目減少有其分子病理基礎(chǔ),此結(jié)果與陳勝報道結(jié)果相一致[3];同時,膽囊結(jié)石患者膽囊收縮功能下降與CCK-A受體下降相關(guān),鄭培永等[4]研究表明:病人膽囊組織中 CCK-A受體有降低的趨勢。以上表明 CCK-A受體在膽囊運(yùn)動調(diào)節(jié)中起重要作用,同時提示CCK-A受體減弱是膽石病患者膽囊收縮功能減弱的重要原因:CCK-A受體下調(diào),蛋白質(zhì)合成減少,從而膽囊對CCK敏感性降低,膽囊收縮減弱。主要表現(xiàn)為膽汁淤積,膽固醇結(jié)晶析出,進(jìn)而形成結(jié)石。

本研究還發(fā)現(xiàn),治療組的結(jié)石率明顯低于模型組,而且膽囊收縮功能、CCK-A受體最大結(jié)合容量均優(yōu)于模型組,保證了膽囊收縮功能,防止膽囊結(jié)石的發(fā)生。至于利膽健脾法為主中藥調(diào)節(jié)膽囊平滑肌CCK-A受體的作用機(jī)制,可能有上調(diào)膽囊平滑肌CCK-A受體增加CCK與 CCK-A受體的親和力、降低膽汁中膽固醇的濃度、減輕其對膽囊平滑肌細(xì)胞膜的傷害、促進(jìn)膽汁的腸肝循環(huán)的作用,詳細(xì)機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

[1] 中華外科學(xué)會膽道外科學(xué)組.我國膽石病十年來的變遷[J].中華外科雜志,1995,33(11):652-658.

[2] 李 健,楊卓欣,黃明河,等.微創(chuàng)保膽內(nèi)鏡取石術(shù)加防石膠囊治療膽囊結(jié)石的初步觀察[J].中國中醫(yī)藥科技,2003,10(1):50-51.

[3] 陳 勝,韓天權(quán),蔣 渝,等.膽囊結(jié)石患者膽囊動力學(xué)紊亂機(jī)制的研究[J].中華外科雜志,1998,36(1):14.

[4] 鄭培永,章學(xué)林,朱培庭,等.膽囊結(jié)石病肝氣郁結(jié)證與 CCKAR和VIPR基因表達(dá)的相關(guān)性研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志,2004,10(5):346-348.