梁淑軒，馬二紅，許成燕，趙燕燕，孫漢文,*

枸杞多糖的硒化及其對人宮頸癌細(xì)胞的抑制作用

梁淑軒1，馬二紅1，許成燕1，趙燕燕2，孫漢文1,*

(1.河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北省分析科學(xué)重點實驗室，河北 保定 071002；2.河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗中心，河北 保定 071002)

在硝酸催化作用下，利用亞硒酸鈉對枸杞多糖進(jìn)行分子修飾，合成硒化枸杞多糖，反應(yīng)條件為硝酸體積分?jǐn)?shù)0.5%，70℃反應(yīng)10h，透析24h。采用體外抗腫瘤實驗測定硒化枸杞多糖對人宮頸癌細(xì)胞生長的抑制作用。結(jié)果顯示硒化枸杞多糖對人宮頸癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，與未硒化的枸杞多糖相比有顯著性差異，且呈一定的劑量依賴性。

枸杞多糖；硒化枸杞多糖；人宮頸癌細(xì)胞；抑制

枸杞子是一種藥食兩用的食物，枸杞中含有大量的VC、β-胡蘿卜素、鐵等有益成分，長期食用可以改善體質(zhì)。枸杞多糖作為枸杞子的主要活性成分，日益得到重視，它具有顯著的降血糖、降血脂、抗癌、減肥、抗氧化等[1-3]作用，其廣泛的藥理作用展示了其在新藥及功能性食品的研究上具有廣闊的前景。

硒是生命必需的微量元素[4]，具有清除自由基、保護(hù)細(xì)胞拮抗毒性、提高人體免疫功能，保護(hù)骨髓造血功能及潛在的抗癌、防衰老等多種作用[5]。而硒多糖作為一種有機(jī)硒化合物，能發(fā)揮微量元素硒和多糖的雙重功能，生物活性普遍高于硒和多糖，更易于為機(jī)體吸收和利用[6-7]。

目前硒多糖的研究在國內(nèi)外尚處于起步階段，但由于硒多糖獨特的生物活性，近幾年已成為研究熱點，其在抗氧化、抗衰老、抗腫瘤等方面發(fā)揮越來越多的作用[8-9]。硒多糖主要來源于天然硒多糖和合成硒多糖[10]，本實驗將李光友等[11]合成海洋硒多糖的方法應(yīng)用在枸杞多糖，并進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，以合成硒化枸杞多糖，該合成工藝簡單、安全、對環(huán)境污染較小、產(chǎn)物回收率較高；并采用MTT法測定硒化枸杞多糖對人宮頸癌細(xì)胞的抑制作用，探討硒化后提高枸杞多糖生物活性的可能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞多糖由本實驗室用寧夏枸杞子以超聲輔助水提取制備[12]。

亞硒酸鈉、鹽酸、硝酸、無水乙醇、氯仿、正丁醇、二甲基亞砜(DMSO)均為分析純；實驗用水均為二次去離子水；人宮頸癌Hela細(xì)胞 河北大學(xué)醫(yī)學(xué)部；DMEM培養(yǎng)基 上海坤肯生物化工有限公司；新生小牛血清 杭州四季青生物工程有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT) 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EQUINOX 55紅外光譜分析儀 德國Bruker光譜儀器公司；UV-265型紫外分光光度計 日本島津公司；Heidolph 4002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph公司；FD-1臺式冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；MCO-18AIC型CO2培養(yǎng)箱 日本三洋設(shè)備有限公司；CKX41型倒置顯微鏡 日本奧林巴斯有限公司；Fax2100酶聯(lián)免疫檢測儀 美國Awareness公司；MD 34-3500透析袋北京索萊寶科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞多糖的純化

按Sevag法脫蛋白[13]：稱取一定量的枸杞多糖，按枸杞多糖水溶液20%體積加入氯仿，隨之加入氯仿體積20%的正丁醇，混合物劇烈振蕩20min，離心，傾出上清液，除去中間變性蛋白和下層氯仿，重復(fù)操作到中間層無變性蛋白為止，收集上清液，濃縮，冷凍干燥得枸杞多糖(LBP)。

1.3.2 硒化枸杞多糖的制備

稱取2.0g LBP置于三口燒瓶中，加入硝酸體積分?jǐn)?shù)為0.5%的水溶液50mL加熱攪拌形成透明溶液，加入1.6g亞硒酸鈉，加熱到70℃攪拌反應(yīng)10h，反應(yīng)冷卻后，減壓蒸餾至10～20mL，加入3倍體積的無水乙醇，使其完全沉淀。離心分離，沉淀用無水乙醇洗滌3次，加少量的水溶解，用去離子水透析24h，未透液經(jīng)濃縮、冷凍干燥得硒化枸杞多糖(Se-LBP)。

1.3.3 硒含量的測定

1.3.3.1 樣品處理

準(zhǔn)確稱取0.1g Se-LBP樣品于錐形瓶中，加2mL濃硝酸浸泡，蓋上坩堝蓋，放置過夜，次日于電熱板上加熱近干，冷卻，加0.5mL H2O2，繼續(xù)消化至冒白煙，當(dāng)消化液呈淡黃色或無色時取下冷卻，用少量的去離子水沖洗杯壁，再蒸發(fā)至冒白煙將余酸趕盡，冷卻，用去離子水將消化液轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，定容。

1.3.3.2 測定方法

準(zhǔn)確移取上述消化液1.0mL于25mL比色管中，依次加入2mL 4mol/L鹽酸、3mL 1mol/L碘化鉀、3mL 2mol/L乙酸鈉、2mL 0.1g/L聚乙烯醇及2mL 0.002g/L孔雀綠溶液，用二次去離子水稀釋至刻度，搖勻。放置40min后，用1cm比色皿，以空白試劑為參比，在波長670nm處測定吸光度[14]，根據(jù)硒標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中硒的含量。

1.3.4 硒化枸杞多糖對Hela細(xì)胞增殖的抑制作用

1.3.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Hela細(xì)胞置于37℃溫箱，飽和濕度，含5%的CO2孵箱中培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)基含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素各100U/mL。根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)每4～5d傳代1次。取生長狀態(tài)穩(wěn)定呈對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.3.4.2 MTT法測定細(xì)胞抑制率[15]

取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后，用培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔90μL。待細(xì)胞完全貼壁后，將枸杞多糖、硒化枸杞多糖按實驗設(shè)計的所需濃度分別加入各孔，質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200μg/mL，每組設(shè)4個復(fù)孔，另外設(shè)陰性對照組和不加細(xì)胞的空白對照組，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，倒置顯微鏡下觀察，然后每孔加入10μL 0.5%的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h。取出96孔板，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100μL DMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。用酶聯(lián)免疫檢測儀在波長570nm處測量各孔的吸光度。每次實驗重復(fù)3次，計算細(xì)胞生長抑制率：

2 結(jié)果與分析

2.1 硒化枸杞多糖合成工藝條件研究

2.1.1 溫度的影響

改變反應(yīng)的溫度，按1.3.2節(jié)中其他反應(yīng)條件進(jìn)行硒化反應(yīng)，按1.3.3.2節(jié)的實驗方法測定產(chǎn)物硒含量，硒標(biāo)準(zhǔn)溶液線性回歸方程Y=0.1706+0.84X，相關(guān)系數(shù)R=0.99863。硒含量在0～0.5μg/mL服從比爾定律。產(chǎn)物中含硒量結(jié)果見表1。

表1 溫度對含硒量的影響Table 1 Effect of reaction temperature on the content of Se

2.1.2硝酸體積分?jǐn)?shù)的影響

改變硝酸的體積分?jǐn)?shù)，按1.3.2節(jié)中其他反應(yīng)條件進(jìn)行硒化反應(yīng)，測定產(chǎn)物中的硒含量，結(jié)果見表2。

表2 硝酸體積分?jǐn)?shù)對含硒量的影響Table 2 Effect of HNO3concentration on the content of Se

2.1.3 亞硒酸鈉用量的影響

改變亞硒酸鈉用量，按1.3.2節(jié)中其他反應(yīng)條件進(jìn)行硒化反應(yīng)，測定產(chǎn)物中的硒含量，結(jié)果見表3。

表3 亞硒酸鈉用量對含硒量的影響Table 3 Effect of Na2SeO3on the content of Se

從表1～3可以看出，不同反應(yīng)條件下硒多糖的硒含量相差較小，70℃時反應(yīng)得到的硒多糖中硒含量最高。酸性條件下硒化時多糖降解，酸度和反應(yīng)溫度增加，硒化時多糖水解程度加強(qiáng)，降解后的低聚寡糖被透析除去，硒含量和硒多糖收率較低，透析時間太短，小分子無機(jī)硒化物不能完全脫附，當(dāng)透析時間由1d到3d，按1.3.2節(jié)方法合成的硒多糖中含硒量下降，因此確定硒化反應(yīng)的條件是溫度70℃，硝酸體積分?jǐn)?shù)0.5%，透析24h，參考文獻(xiàn)[11]中多糖硒化的反應(yīng)條件，選擇反應(yīng)時間為10h。

2.2 硒化枸杞多糖結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 紫外光譜分析

LBP、Se-LBP樣品溶于水，在UV-265型紫外分光光度計掃描分析圖(1、2)。

圖2 硒化枸杞多糖的紫外光譜Fig.2 UV spectrum of selenitedLycium barbarumpolysaccharides

圖3 枸杞多糖的紅外光譜圖Fig.3 IR spectrum ofLycium barbarumpolysaccharides

圖1 枸杞多糖的紫外光譜Fig.1 UV spectrum ofLycium barbarumpolysaccharides

圖4 硒化枸杞多糖的紅外光譜圖Fig.4 IR spectrum of selenitedLycium barbarumpolysaccharides

LBP的紫外光譜顯示在280nm處有一個蛋白質(zhì)吸收峰，在260nm處有一個核酸吸收峰[16]，經(jīng)過除蛋白和硒化后，兩個峰消失，而在230nm處有亞硒酸酯的吸收峰，而LBP無此吸收峰位，說明Se-LBP分子中引入了亞硒酸根。

2.2.2 紅外光譜分析

分別取少量LBP、Se-LBP樣品，加入KBr壓片在EQUINOX 55紅外光譜分析儀掃描分析(圖3、4)。硒化并透析24h后的Se-LBP的紅外光譜在保持LBP的基本構(gòu)型，多糖的特征吸收峰不變的情況下，在760cm-1處附近有亞硒酸酯特征吸收峰，證明透析后的Se-LBP中無游離的亞硒酸根，而是相互結(jié)合形成化學(xué)鍵，其分子中存在亞硒酸基團(tuán)。Se-LBP的紫外光譜和紅外光譜分析得到了相一致的結(jié)果，表明了硒與枸杞多糖的結(jié)合。

2.3 枸杞多糖和硒化枸杞多糖對Hela細(xì)胞的增殖抑制作用

在25～200μg/mL作用48h枸杞多糖對Hela細(xì)胞沒有明顯的抑制作用。硒化枸杞多糖對Hela細(xì)胞的抑制作用隨著質(zhì)量濃度的增加和含硒量的增加逐漸加強(qiáng)，在200μg/mL有較明顯的抑制作用，其中以按1.3.2節(jié)制備的樣品的抑制率最高，為24.5%，其結(jié)果見表4。

表4 LBP和硒化LBP對Hela細(xì)胞增殖抑制作用(n=4)Table 4 Inhibition effects of LBP and selenited LBP on human cervical carcinoma cells (n=4)

3 結(jié) 論

近年來，人們通過人工方法在適宜培養(yǎng)條件下將無機(jī)硒添加到真菌、藻類等的培養(yǎng)基中，通過微生物的生長代謝，對硒進(jìn)行富集和生物轉(zhuǎn)化，從而獲得硒多糖[17-18]，或者通過化學(xué)合成的方法獲得硒多糖[19]。但目前國內(nèi)發(fā)現(xiàn)及人工合成的硒多糖種類有限，各種硒多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)及其在生物體內(nèi)的作用機(jī)制尚未完全清楚，因此對硒多糖進(jìn)行更深入的研究，具有十分重要的意義。

本實驗在溫和條件下，通過化學(xué)反應(yīng)使無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒，合成了硒化枸杞多糖，合成的硒多糖在安全劑量范圍內(nèi)對Hela細(xì)胞均有較好的抑制作用，明顯優(yōu)于枸杞多糖，而且抑制率隨質(zhì)量濃度增加而增大。為今后硒多糖在保健或藥物方面的開發(fā)提供一定的參考價值，硒化枸杞多糖對Hela細(xì)胞的作用機(jī)制及活性成分的篩選有待進(jìn)一步研究。

[1]羅瓊, 李瑾瑋, 張聲華. 枸杞及其多糖對家兔血脂的影響[J]. 食品科學(xué), 1997, 18(4)∶ 5-7.

[2]張民, 朱彩平, 施春雷, 等. 枸杞多糖-4的提取、分離及其對雌性下丘腦損傷性肥胖小鼠的減肥作用[J]. 食品科學(xué), 2003, 24(3)∶ 114-117.

[3]嚴(yán)成, 嚴(yán)夏. 枸杞多糖提取工藝比較及體外抗氧化性研究[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(7)∶ 183-187.

[4]BININGER M, PILAWA S, FLOHE L. Trends in selenim biochemistry [J]. Natural Products Reports, 2002, 19∶ 693-718.

[5]TAPIERO H, TOWNSEND D M, TEW K D. The antioxidant role of selenium and selenium and seleno-compounds[J]. Biomedicine and Pharmacotherapy, 2003, 57(3/4)∶ 134-144.

[6]許峰, 張瞳, 周波, 等. 食用覃菌硒多糖研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù), 2006, 16(l)∶ 86-88.

[7]STAAF M, YANG Z N, HUTTUNEN E, et al. Structural elucidation of the viscous exopolysaccharide produced by Lactobacillus helveticus Lb161[J]. Carbohydrade Research, 2000, 326(2)∶ 113-119.

[8]李曉坤, 閻吉昌, 崔曉瑩. 硒多糖的研究與應(yīng)用進(jìn)展[J]. 中草藥, 2006, 37(7)∶ 6-7.

[9]MIERSCH J, TSCHIMEDBALSHIR M, BARLOCHER F, et al. Heavy metals and thiol compounds in Mucor racemosus and Articulospora tetracladia[J]. Mycological Research, 2001, 105(7)∶ 883-889.

[10]蔣京, 廖寶涼. N-含硒殼聚糖衍生物的合成、表征及其生物活性[J].廣東微量元素科學(xué), 2000, 7(5)∶ 14-17.

[11]李光友, 繆錦來, 劉發(fā)義. 硒化多糖化合物及其制備方法∶ 中國, CN 1288899C[P]. 2001-03-28

[12]孫漢文, 劉占鋒. 枸杞多糖的超聲波輔助水提取與分級純化[J]. 食品工業(yè)科技, 2009, 30(3)∶ 230-233.

[13]田麗梅, 王旻. 枸杞多糖的提取分離和其組成研究[J]. 中國中藥雜志, 2006, 31(19)∶ 1602-1607.

[14]金松子, 蔡振華, 蔣慶峰. 分光光度法測定富硒蛋粉中的硒含量[J].現(xiàn)代食品與藥品雜志, 2007, 17(1)∶ 37-39.

[15]于榮, 柳慶玲, 趙冬梅. 欖香烯對人宮頸癌細(xì)胞Hela的體外抑瘤效應(yīng)[J]. 濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2006, 29(2)∶ 106-107.

[16]王玲, 李欣, 錢玉昆. 枸杞多糖的分離、純化、分析及免疫作用的研究[J]. 昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 1995(6)∶ 29-31.

[17]和朝軍, 李景原, 李宗義. 靈芝硒多糖的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006 (3)∶ 9-11.

[18]徐峰, 張瞳, 周波. 食用蕈菌硒多糖研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù), 2006, 16 (1)∶ 86-88.

[19]唐家駿. 硒化角叉菜膠的制備及其理化性質(zhì)和生化活性的研究[J]. 生物化學(xué)與生物物理學(xué)報, 1988, 20(3)∶ 259-264.

Selenitation of Lycium barbarum Polysaccharides and Inhibiting Effect on Human Cervical Carcinoma Cells Cervical Carcinoma Cell

LIANG Shu-xuan1，MA Er-hong1，XU Cheng-yan1，ZHAO Yan-yan2，SUN Han-wen1,*
(1. Key Laboratory of Analytical Science of Hebei Province, College of Chemistry and Environmental Science, Hebei University Baoding 071002, China；2. Medicine Experimental Center, Hebei University, Baoding 071002, China)

Lycium barbarum polysaccharides were modified by sodium selenite in the presence of nitric acid as catalyst. The optimal reaction condition was the reaction at 70 ℃ for 10 h with the following dialysis for 24 h. The anticancer activity of selenited Lycium barbarum polysaccharides was evaluated in vitro. Results indicated that selenited Lycium barbarum polysaccharides could inhibit human cervical carcinoma cells, and exhibited a significant difference from Lycium barbarum polysaccharides.

Lycium barbarum polysaccharides；selenited Lycium barbarum polysaccharides；human cervical carcinoma cell；inhibition

TS255.3

A

1002-6630(2010)09-0243-04

2009-08-27

河北省自然科學(xué)基金項目(2005000100)；國家自然科學(xué)基金項目(30772006)

梁淑軒(1967—)，女，教授，博士，研究方向為食品分析。E-mail：liangsx168@yahoo.com.cn

*通信作者：孫漢文(1945—)，男，教授，碩士，研究方向為食品安全。E-mail：hanwen@hbu.edu.cn