嚴(yán)玉婷，潘道東,2,*

(1.南京師范大學(xué) 國家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

發(fā)酵乳桿菌SM-7的篩選及對小鼠降膽固醇作用

嚴(yán)玉婷1，潘道東1,2,*

(1.南京師范大學(xué) 國家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，浙江 寧波 315211)

篩選1株具有高效降膽固醇活性的乳酸菌菌株并研究其降膽固醇的特性。采用分離自新疆酸馬奶的10株乳酸菌，通過益生活性的測定以及降膽固醇實驗篩選得到1株具有高效降膽固醇的益生菌株SM-7，經(jīng)過鑒定為發(fā)酵乳桿菌。該菌株在液體培養(yǎng)基中的膽固醇脫除率為66.82%，用該菌液飼喂小鼠4周，研究其對小鼠血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)以及體質(zhì)量和肝、腎質(zhì)量的影響。結(jié)果顯示，實驗組小鼠的血清TC、TG、LDL-C含量均顯著低于高脂模型組(P＜0.01)，而HDL-C含量沒有顯著差異(P＞0.05)。這表明發(fā)酵乳桿菌SM-7對實驗性高脂血癥小鼠血清有顯著的降膽固醇作用。

發(fā)酵乳桿菌；篩選；降膽固醇；作用機理

隨著人們生活水平不斷提高，心血管疾病患病率和死亡率也逐年上升，已成為引起人類死亡的主要殺手。血清中的膽固醇則被認為是誘發(fā)冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病的重要危險因素[1]。血清膽固醇含量每高于正常值1mmol/L，冠心病發(fā)生率增加35%左右，而其含量降低1%，冠心病發(fā)生率減少2%～3%[2]。因此，降低血清膽固醇水平直接關(guān)系到人類的健康。

自1974年Mann和Spoerry發(fā)現(xiàn)非洲馬賽人大量飲用由乳桿菌發(fā)酵的乳制品，其體內(nèi)血清膽固醇含量普遍較低后，國內(nèi)外的大量學(xué)者便致力于研究乳酸菌降膽固醇的作用上。研究表明，某些乳酸菌的攝入可降低血膽固醇的濃度，減少心腦血管疾病的發(fā)生率。本實驗采用從酸馬奶中篩選得到的1株具有益生活性的發(fā)酵乳桿菌，對模型小鼠的降膽固醇效果進行研究，以期為開發(fā)降血脂和預(yù)防心血管疾病的保健食品提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

10株乳酸菌，編號為SM-1～SM-10分離自新疆酸馬奶，由南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院乳品研究所保藏。

MRS液體培養(yǎng)基[3]；含膽固醇100mg/L和0.3g/100mL牛膽鹽的MRS液體培養(yǎng)基(MRS-CHOL培養(yǎng)基)；血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和高密度脂蛋白膽固醇(HDLC)測定試劑盒 浙江東甌生物工程有限公司。其他所用試劑均為分析純。

722型可見光分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；JY92-Ⅱ超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司；高速冷凍離心機 賽特湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 高效降膽固醇乳酸菌的篩選與鑒定

1.2.1.1 菌株耐受酸與膽鹽能力測定

將活化3代的乳酸菌按1%的接種量接入pH3.0的MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)12h后，觀察各個菌的生長情況并記錄。同時按1%的接種量接入不含牛膽鹽(即空白)以及含0.3g/100mL牛膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h后，于波長620nm處分別測定上述兩種培養(yǎng)基的光密度值(OD620nm)，計算各菌株在含膽鹽培養(yǎng)基中的存活率。實驗重復(fù)3次取平均值。

1.2.1.2 乳酸菌的篩選

將活化3代的乳酸菌株1%接種于MRS-CHOL培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h后用鄰苯二甲醛法[4]測定菌液上清液、洗滌液、菌體破碎液中膽固醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以未接種乳酸菌的培養(yǎng)基作為空白，并根據(jù)上清液中膽固醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計算培養(yǎng)基中膽固醇的脫除率，實驗重復(fù)3次取平均值。

上清液：菌株在MRS-CHOL培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后于4000r/min離心10min后的液相部分；洗滌液：在傾出上清液的菌體細胞中加入10mL濃度為0.1mol/L (pH7.0) PBS緩沖液，洗滌2次后4000r/min離心10min所得的液體；破碎液：傾出菌體洗滌液，再加入5.0mL PBS緩沖液，置冰浴中，超聲波細胞粉碎機功率為600W下破碎10min后，4000r/min離心10min所得液體。

1.2.1.3 乳酸菌的鑒定

運用API細菌鑒定系統(tǒng)鑒定所篩選菌株。

1.2.2 乳桿菌體內(nèi)降膽固醇實驗

1.2.2.1 灌胃菌體的制備

活化的選定的最佳菌株以10%接入1000mL MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h后，離心收集菌體。沉淀的菌體用50mL，10%的脫脂乳(質(zhì)量分?jǐn)?shù))懸浮，分裝于10mL的離心管中，在－70℃迅速冷凍待用。灌胃前把盛菌體的離心管置于25℃水浴融化，用滅菌生理鹽水適當(dāng)稀釋后平板菌落計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結(jié)果，每次灌胃前用10%脫脂乳將菌液稀釋至所需濃度。

1.2.2.2 高脂飼料的制備

高脂飼料含基礎(chǔ)飼料83.8%、豬油10%、蛋黃5%、膽固醇1%、牛膽鹽0.2%、混合均勻后手工制成顆粒并置于通風(fēng)干燥處待用。

1.2.2.3 動物分組及實驗方案

ICR小鼠(雄性)50只，體質(zhì)量(18±2)g，購于南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為5組，每組10只，連續(xù)飼喂不同的飼料和菌液4周(具體的分組及飼喂方式見表1)，每周稱1次體質(zhì)量，并依次調(diào)整灌胃量。在實驗的第0、2、4周分別剪尾采血(采血前禁食12h，不禁水)，離心分離血清，檢測血清TC、TG和HDL-C水平。

小鼠每天定量飼喂(上午喂食，食量為每只每天5g)，自由飲水，按照表1中方案，每天上午對小鼠灌胃，并保持飼養(yǎng)房的通風(fēng)、透光和清潔衛(wèi)生。

表1 實驗動物分組及飼養(yǎng)方式Table 1 Animal grouping and feeding styles

1.2.2.4 檢測指標(biāo)及方法

按照試劑盒說明書要求測定血清TC、TG和HDL-C的含量，并由公式計算低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量、動脈粥樣硬化指數(shù)(A I)及抗動脈粥樣硬化指數(shù)(AAI)[5]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理后用x±s表示，組間差異采用t檢驗，P＞0.05表示無顯著性差異，

P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示差異非常顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌pH3.0耐酸性和耐膽鹽實驗的篩選

表2 乳酸菌對0.3g/100mL膽鹽環(huán)境和pH3.0酸性環(huán)境的耐受能力Table 2 The tolerance capability of LAB to bile salt and acids

由表2可知，10株乳酸菌中，SM-9和SM-10不耐受pH3.0的酸性環(huán)境，幾乎不能生長，菌株SM-3生長緩慢，其余7株乳酸菌對pH3.0的酸性環(huán)境有較強的耐受力，不影響生長。添加0.3g/100mL耐膽鹽實驗顯示，各株菌均具有一定的膽鹽耐受力，其中SM-7最強，存活率為87.97%。綜上，根據(jù)10株菌對酸和高膽鹽環(huán)境的耐受力的高低，選擇SM-7、SM-1、SM-8、SM-4和SM-2株菌進行下一步實驗。

2.2 高效降膽固醇乳酸菌的體外篩選及鑒定

圖1 5株乳酸菌的體外降膽固醇效果Fig.1 Cholesterol-reducing effect of LABin vitro

由圖1可知，經(jīng)2.2節(jié)實驗篩選的5株菌均有降膽固醇的作用，但各菌株間的膽固醇脫除率有較大差異。菌株SM-7對培養(yǎng)基中膽固醇的脫除率最高，為66.82%，其他依次為SM-4、SM-1、SM-8、SM-2，它們的膽固醇脫除率分別為41.89%、34.79%、31.60%、15.12%。同時，本實驗結(jié)果表明，菌體細胞破碎后所得膽固醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與上清液膽固醇減少量和沉淀中膽固醇增加量間的差值相差無幾，這表明乳酸菌可以同化膽固醇到自身細胞內(nèi)，菌株SM-7破碎液中膽固醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，表明其同化膽固醇能力最強。

綜合考慮耐酸耐膽鹽和降膽固醇實驗的結(jié)果，最后篩選得菌株SM-7進行體內(nèi)實驗。經(jīng)過API細菌鑒定系統(tǒng)的鑒定，菌株SM-7屬于發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)。

2.3 發(fā)酵乳桿菌SM-7體內(nèi)降膽固醇實驗

2.3.1 小鼠高脂血癥模型的建立

表3 飼喂普通飼料小鼠與高脂飼料小鼠血脂變化(x±s，n=10)Table 3 Change in serum lipid level of mice fed with basic and high-cholesterol food (x±s，n=10)

表4 SM-7對小鼠血脂的影響(x±s，n=10)Table 4 Effect of strain SM-7 on serum TC,TG,HDL-C and LDL-C of mice with hyperlipemia (x±s，n=10)

由表3可見，整個實驗期間，普通組小鼠血清TC、TG、HDL-C和LDL-C的濃度都保持穩(wěn)定(P＞0.05)。高脂組在飼喂高脂飼料14d后，血清TC濃度與普通組相比明顯升高，兩者差異極其顯著(P＜0.01)，TG濃度也

有所升高，且與普通組差異顯著(P＜0.05)。而高脂奶粉組中各指標(biāo)變化與高脂組基本相同，兩組間無顯著差異(P＞0.05)，說明奶粉本身沒有降血脂的功能。在飼喂高脂飼料28d后，高脂組、高脂奶粉組的小鼠血清TC、TG濃度均與普通組相比差異極顯著(P＜0.01)，表明造模成功。

2.3.2 發(fā)酵乳桿菌SM-7對高脂血癥小鼠血脂的影響

由表4可知，經(jīng)過28d的灌胃實驗后，與高脂組相比，發(fā)酵乳桿菌SM-7高濃度組的血清TC和TG含量均得到抑制，且效果明顯(P＜0.01)，較高脂組分別下降了24.05%和36.73%；而SM-7低濃度組的血清TC和TG含量亦有所下降，分別為13.07%和19.05%。SM-7對血清LDL-C起到了極顯著性降低作用(P＜0.01)，但對血清HDL-C的作用不明顯，雖然相比高脂組略有升高，但差異不顯著(P＞0.05)。通過計算得到的動脈粥樣硬化指數(shù)AI和抗動脈粥樣硬化指數(shù)AAI可以看出，菌株SM-7的高、低濃度組均可顯著降低AI值和顯著升高AAI值，其中高濃度組效果極顯著，這說明SM-7具有一定的調(diào)節(jié)血脂的功效，對預(yù)防心血管疾病具有顯著的效果。

2.3.3 發(fā)酵乳桿菌SM-7對高脂血癥小鼠體質(zhì)量的影響

實驗期間，各組小鼠毛色光潔，食欲正常，未出現(xiàn)異常體征，未發(fā)生自然死亡。小鼠體質(zhì)量及肝、腎與體質(zhì)量的百分比如表5所示。

表5 SM-7對小鼠體質(zhì)量及臟器質(zhì)量與體質(zhì)量比的影響(x±s，n=10)Table 5 Effect of strain SM-7 on body weight and viscera weight of mice with hyperlipemia (x±s，n=10)

由表5可見，實驗前，各組間小鼠體質(zhì)量無顯著性差異(P＞0.05)。而在實驗結(jié)束時，雖然飼喂高脂飼料的4組小鼠的體質(zhì)量均高于普通組，但與普通組相比沒有顯著性差異(P＞0.05)，同時各組間腎質(zhì)量/體質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)也未有顯著性差異(P＞0.05)，這表明實驗期間小鼠灌胃發(fā)酵乳桿菌SM-7未見明顯的毒副作用[6]。飼喂高脂飼料的4組小鼠的肝質(zhì)量/體質(zhì)量的值均明顯高于普通組，高脂組與高脂奶粉組間差異不顯著(P＞0.05)，而灌胃SM-7菌體的SM-7高、低濃度組的值均低于高脂組和高脂奶粉組，其中SM-7高濃度組分別與高脂組和高脂奶粉組相比差異顯著(P＜0.05)，而SM-7低濃度組分別與高脂組和高脂奶粉組差異不顯著(P＞0.05)，這表明高濃度的SM-7能夠減少脂肪在小鼠肝臟中的囤積。

3 討 論

近年來，國內(nèi)外大量研究發(fā)現(xiàn)，食用活性乳酸菌食品具有減少人體血清膽固醇的能力，這一結(jié)論也被大量體內(nèi)體外實驗所證實。而菌體進入機體后，要能抵達胃腸道的特定部位并定植才能發(fā)揮有益作用。而胃腸道的低pH值和高膽汁酸鹽(人體消化道正常pH值范圍為2～8，正常膽汁酸鹽濃度為0.3%～0.5%)[7]是影響乳酸菌定植的主要障礙。本實驗從新疆酸馬奶中分離鑒定得到的一株發(fā)酵乳桿菌SM-7，不僅具有高效降膽固醇的活性，其膽固醇脫除率可達66.82%，而且具有較好的耐酸、耐膽鹽的能力，能夠較好的耐受胃腸道的環(huán)境，更好的發(fā)揮其在體內(nèi)降膽固醇的作用。

在體外實驗中，在乳酸菌培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基上清液、沉淀洗滌液和細胞破碎液中均測得膽固醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，這說明實驗所用乳酸菌株對膽固醇去除都是共沉淀與吸收作用的共同結(jié)果，但它們在去除膽固醇的機理方面存在一定的菌株特異性。通過計算發(fā)現(xiàn)，將細胞內(nèi)與洗滌沉淀所得的兩部分膽固醇相加，發(fā)現(xiàn)與培養(yǎng)基中膽固醇的減少量幾乎相等，證明菌株吸收的膽固醇沒有被降解為小分子，這與Tahri等[8]研究雙歧桿菌、Kimoto等[9]研究Lactococcus lactis時所得結(jié)論相似。

用發(fā)酵乳桿菌SM-7灌胃ICR小鼠實驗結(jié)果表明，SM-7能顯著降低血清TC、TG和LDL-C的濃度，而各組間血清HDL-C的含量差異不顯著，說明HDL-C值不易受外界因素的影響而發(fā)生變化。動脈粥樣硬化指數(shù)AI和抗動脈粥樣硬化指數(shù)AAI也發(fā)生顯著變化，這說明SM-7具有降低體內(nèi)膽固醇的作用。從本實驗結(jié)果看，實驗組血清TC的減少不僅與LDL-C的減少有關(guān)，還可能與膽固醇的合成減少或代謝加速有關(guān)，因為實驗組小鼠的肝質(zhì)量/體質(zhì)量比高脂組顯著降低，說明肝臟對膽固醇的排出量增多[10]。大量實驗證明某些乳酸菌在代謝過程中分泌的膽鹽水解酶具有沉淀去除膽固醇的能力[11]，然而也有實驗證實，某些不具膽鹽水解酶活性的乳酸菌也能很好的去除膽固醇，而有酶活性的菌株卻未能很好地去除膽固醇[12-13]。目前有關(guān)乳酸菌降膽固醇的作用機制尚不完全清楚，有待進一步的實驗研究。

綜上所述，發(fā)酵乳桿菌SM-7具有良好的降膽固醇功效，作為一種預(yù)防心血管疾病的功能性菌株，在開發(fā)降血清膽固醇功能性乳制品方面具有廣闊的市場前景。

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Screening and Hypocholesterolemic Effect of Lactobacillus fermentum

YAN Yu-ting1，PAN Dao-dong1,2,*
(1. Branch Center of National Dairy Products Processing Technology Development, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. Faculty of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

The strain SM-7 with hpocholesterolemic activity was screened from 10 lactic acid bacteria (LAB) strains isolated from koumiss in Xinjiang and its hpocholesterolemic effect in mice was investigated. The SM-7 was identified as Lactobacillus fermentum and could reduce 66.82% of cholesterol in the medium. The effect of strain SM-7 on serum TC, TG, HDL-C, LDLC, body weight, liver and kidney were investigated in ICR mice with hyperlipemia. Results showed serum TC, TG and LDL-C concentrations were exhibited a significant decrease (P ＜ 0.01) while no obv ious change was observed in serum HDL-C concentration (P ＞ 0.05). These investigations suggested that Lactobacillus fermentum SM-7 strain had a significant effect on cholesterol-reducing function in mice with hyperlipemia.

Lactobacillus fermentum；screening；cholesterol-reducing；mechanism

Q939.117

A

1002-6630(2010)09-0224-05

2009-09-05

國家“863”計劃項目(2007AA10Z357)；國家自然科學(xué)基金項目(30972130)；國家農(nóng)轉(zhuǎn)基金項目(2009GB2C220412)；江蘇省科技支撐計劃項目(BE2009366)

嚴(yán)玉婷(1985—)，女，碩士研究生，主要從事乳品科學(xué)研究。E-mail：nevsay88@qq.com

*通信作者：潘道東(1964—)，男，教授，博士，主要從事乳品科學(xué)研究。E-mail：daodongpan@163.com