韓玲玲,潘道東,2,*
(1.南京師范大學 國家乳品加工技術研發(fā)分中心,江蘇 南京 210097;2.寧波大學生命科學與生物工程學院,江蘇 寧波 315211)
根霉產(chǎn)凝乳酶的固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化
韓玲玲1,潘道東1,2,*
(1.南京師范大學 國家乳品加工技術研發(fā)分中心,江蘇 南京 210097;2.寧波大學生命科學與生物工程學院,江蘇 寧波 315211)
對根霉產(chǎn)凝乳酶固體發(fā)酵條件進行研究。通過單因素分析和響應面試驗設計,確定根霉產(chǎn)凝乳酶的發(fā)酵條件及發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成為:24℃發(fā)酵7d;麩皮與江米質量比為0.96∶1、培養(yǎng)基固液比(m/V)為0.99∶1、奶粉添加質量分數(shù)為0.81%,所產(chǎn)的凝乳酶活力達到72.92SU/mL。
根霉;凝乳酶;響應面法
凝乳酶是干酪生產(chǎn)過程中一種重要的酶。傳統(tǒng)的凝乳酶來源于小牛的皺胃,但隨著干酪市場需求的日益增加,通過宰殺小牛來獲得凝乳酶不能完全滿足干酪的生產(chǎn)需要,因此很多研究者不斷地尋找其替代品[1-2]。微生物凝乳酶從1965年起開始取代小牛皺胃酶,成功的彌補了小牛皺胃酶短缺的問題并在奶酪制造業(yè)與干酪產(chǎn)業(yè)中得到廣泛的應用[3]。目前發(fā)現(xiàn)四十多種微生物可產(chǎn)凝乳酶,這些微生物主要是細菌、放線菌和真菌。常用的凝乳酶菌種有3種:米黑毛霉、微小毛霉和寄生內座殼菌(栗疫菌)。目前已有多種應用這3種菌生產(chǎn)的商品凝乳酶上市?,F(xiàn)在應用最多的微生物凝乳酶是由微小毛霉生產(chǎn)的[4-5]。劉振民等發(fā)現(xiàn)酒藥中主要菌系——根霉,具有一定的產(chǎn)凝乳酶的活力,可作為凝乳酶的潛在生產(chǎn)菌株[6]。
微生物發(fā)酵產(chǎn)酶一方面和菌種的性質有關,另一方面還同外界培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方式有直接的關系。固態(tài)發(fā)酵技術以其發(fā)酵設備的簡易性、相對便宜的成本構成,特別對于絲狀真菌,固態(tài)發(fā)酵能夠更好地模擬菌種的自然生長條件,對于特定的發(fā)酵產(chǎn)物更為有力[7]。
本實驗采用根霉作為菌種利用固態(tài)發(fā)酵方式產(chǎn)凝乳酶,研究對產(chǎn)凝乳酶有影響的因素和發(fā)酵培養(yǎng)基的組成,以期找出其產(chǎn)酶的最佳固態(tài)發(fā)酵條件。
1.1 材料與試劑
根霉由南京師范大學生命科學學院南京微生物工程中心保存;脫脂奶粉 上海光明乳業(yè)股份有限公司;所用試劑均為分析純。
1.2 培養(yǎng)基
斜面種子培養(yǎng)基[8-9]:稱取200g去皮馬鈴薯,切碎后,水煮沸30min,紗布過濾,加入15~20g瓊脂和20g葡萄糖,定容至1000mL,倒斜面,121℃滅菌
20min,制備孢子數(shù)為106個/mL的霉孢子懸浮液,備用;發(fā)酵基礎培養(yǎng)基:10g麩皮加10g江米和20mL蒸餾水,pH值自然,121℃殺菌20min。
1.3 方法
1.3.1 酶液的制備提取
取40g基礎培養(yǎng)基于250mL錐形瓶中,121℃殺菌20min。接種已調整孢子數(shù)為106個/mL的霉孢子懸浮液,28℃培養(yǎng)4d,然后加入80mL蒸餾水,置于8℃浸提15h,離心或者過濾(每組做3個平行實驗取平均值),取上清液測酶活力。
1.3.2 凝乳酶活力測定[10]
取5mL的100g/L脫脂乳液于35℃保溫5min,加入0.5mL酶液(也置于35℃保溫),立即搖勻,準確記錄從加入酶液到凝固的時間/s。40min凝固1mL 100g/L脫脂乳的酶量定義為一個索氏單位(Soxheh unit,SU)。
式中:t為凝乳時間/s;n為稀釋倍數(shù)。
1.3.3 響應面分析法設計
根據(jù)文獻報道和單因素試驗,在基礎培養(yǎng)基的基礎上,選擇其中對凝乳酶酵影響較大的因素(麩皮∶江米、培養(yǎng)基固液比、奶粉添加量),利用Design Expert 7.1.3軟件進行試驗設計和數(shù)據(jù)處理,研究影響較大的因素的主效應和交互效應對產(chǎn)凝乳酶量的影響,以獲得最佳配比。每一自變量的低、中、高試驗水平分別以-1、0、1進行編碼,各試驗組的編碼與取值見表1。
表1 發(fā)酵培養(yǎng)基響應面試驗設計因素水平編碼Table 1 Factors and levels of experimental design for fermentation media
2.1 根霉產(chǎn)凝乳酶固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化
2.1.1 基礎培養(yǎng)基的確定
培養(yǎng)基總干物料為20g,分別調整麩皮和江米的比例,加入20mL蒸餾水,接種2mL種子液,24℃培養(yǎng)4 d,測定酶活力。
由圖1可知,當麩皮和江米的質量比1∶1時,根霉產(chǎn)酶量最大,可能在該比例時,培養(yǎng)基中的各種營養(yǎng)素能基本滿足根霉產(chǎn)酶的需求;當麩皮含量過大時,會造成菌絲大量迅速生長,易老化,從而產(chǎn)酶量減少,而江米含量過大時,可能由于合成凝乳酶的某種營養(yǎng)素含量較少而產(chǎn)酶不多。
圖1 基礎培養(yǎng)基的確定Fig.1 Basic compositions of media
2.1.2 培養(yǎng)時間和溫度對根霉產(chǎn)酶的影響
在基礎培養(yǎng)基上接種2mL種子液,分別于20、24、28、32℃培養(yǎng)7d,每天定時測酶活力。
圖2 培養(yǎng)時間和溫度對根霉產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects of fermentation time and temperature on chymosin productivity
由圖2可知,根霉在24℃發(fā)酵7d,酶活最大。從各溫度、時間下根霉產(chǎn)酶的曲線可以看出,根霉在24℃條件下培養(yǎng)產(chǎn)酶最好。溫度過高,根霉生長加快,易老化,產(chǎn)酶減少。溫度過低則根霉生長過慢,產(chǎn)酶少。所以最佳的培養(yǎng)溫度和時間是24℃培養(yǎng)7d。
2.1.3 培養(yǎng)基固液比對根霉產(chǎn)酶的影響
在20g固體基料(10g麩皮,10g江米)的基礎上,分別調整固體基料和水分的比例,接種2mL種子液,24℃培養(yǎng)7 d,每天定時測酶活力。
圖3 培養(yǎng)基固液比對根霉產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on chymosin productivity
由圖3可知,培養(yǎng)基中固體基料與水分的最適比例為 1∶1,此時凝乳酶的酶活達到最高。固體培養(yǎng)基的含水量對霉菌的生長和凝乳酶的產(chǎn)生有著重要的影響,加水量太少,無法滿足根霉生長產(chǎn)酶所需水分;而加水量過多又不利于固體培養(yǎng)基的通氣和散熱。
2.1.4 接種量對根霉發(fā)酵產(chǎn)酶的影響
在基礎培養(yǎng)基上分別接入不同體積的種子液,24℃培養(yǎng)7 d,每天定時測酶活力。
圖4 接種量對根霉產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of inoculum amount on chymosin productivity
由圖4可知,當接種體積為2mL時,根霉產(chǎn)酶最多??赡苁且驗榻臃N量過少,生長較慢,發(fā)酵周期長;而接種量過大時,又會導致菌絲生長過旺盛,進而造成固體培養(yǎng)基局部迅速升溫以及加速菌體老化,影響產(chǎn)酶量。
2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化
2.2.1 不同外加碳源對根霉產(chǎn)酶的影響
在基礎培養(yǎng)基上分別加入質量分數(shù)為3%的淀粉、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖,接種2 m L種子液,24℃培養(yǎng)7d,每天定時測酶活力。
圖5 不同外加碳源對根霉產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of carbon source on chymosin productivity
由圖5可知,麥芽糖和淀粉促進了根霉產(chǎn)凝乳酶,且麥芽糖是最佳的外加碳源,而葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖對酶的形成有抑制作用。
2.2.2 麥芽糖添加量對產(chǎn)酶的影響
在基礎培養(yǎng)基上分別加入不同質量分數(shù)的麥芽糖,接種2mL種子液,24℃培養(yǎng)7d,每天定時測酶活力。
圖6 麥芽糖添加量對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of maltose addition amount on chymosin productivity
如圖6所示,在一定范圍內,隨著麥芽糖的添加質量分數(shù)增大,產(chǎn)酶量增多。當麥芽糖質量分數(shù)為5%時,凝乳酶活力最高。繼續(xù)增加時反而減少。
2.2.3 不同外加氮源對根霉產(chǎn)酶的影響
在基礎培養(yǎng)基上分別添加質量分數(shù)為1%的檸檬酸三銨、硫酸銨、磷酸二氫銨、胰蛋白胨、干酪素和奶粉,接種2mL種子液,24℃培養(yǎng)7d,每天定時測酶活力。
圖7 不同氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of nitrogen source on chymosin productivity
如圖7所示,不同的氮源對根霉產(chǎn)酶影響不同。檸檬酸三銨、硫酸銨、磷酸二氫銨和胰蛋白胨抑制了根霉產(chǎn)凝乳酶的能力,而干酪素和奶粉對其起了促進作用,奶粉促進作用更強。
2.2.4 奶粉添加量對根霉產(chǎn)酶的影響
在基礎培養(yǎng)上分別添加不同質量分數(shù)的奶粉,接種2mL種子液,24℃培養(yǎng)7d,每天定時測酶活力。
圖8 奶粉添加量對根霉產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of milk powder amount on chymosin productivity
如圖8所示,當奶粉質量分數(shù)為1%時,產(chǎn)酶量最大。這可能是因為此時的氮源即能滿足菌絲的生長,又能提供蛋白質合成時所需的氮源。而當其質量分數(shù)增高時,C/N減小,菌體生長過于旺盛,營養(yǎng)物質過多的用于菌體的生長,導致產(chǎn)酶量的下降。
2.3 響應面優(yōu)化發(fā)酵條件
表2 響應面試驗結果Table 2 Data of response surface experiments
表3 響應面試驗結果回歸方差分析Table 3 Variance analysis of regression
響應面分析試驗根據(jù)Box-Behnken設計進行了17組試驗,其中5組中心點重復試驗,結果見表2。利用Design Expert 7.1.3軟件對表2試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合,得到回歸方程如下:
表3方差分析表明,本實驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性(P<0.0001)。其決定系數(shù)為0.9765,校正決定系數(shù)為0.9463,且失擬性檢驗不顯著(P=0.577>0.05),說明所擬合的回歸方程合適,對試驗擬合情況較好。
圖9 培養(yǎng)基固液比與麩皮和江米質量比的響應面及等高線圖Fig.9 Response surface chart and contour line ofY=f(X1,X2)
圖10 奶粉質量分數(shù)與麩皮和江米質量比的響應面及等高線圖Fig.10 Response surface chart and contour line ofY=f(X1,X3)
圖11 培養(yǎng)基固液比與奶粉質量分數(shù)的響應面及等高線Fig.11 The response surface chart and contour line ofY=f(X2, X3)
從表3和圖9~11可以看出,各個因素在所選擇的范圍內對凝乳酶的產(chǎn)生都有顯著的影響(P<0.05)。從響應面分析的立體圖和等高線圖可看出,各因素之間存在一定的交互作用。根據(jù)Box-Behnken試驗所得的結果和二次多項回歸方程,利用Design Expert7.1.3軟件獲得了m麩皮∶m江米(X1)、培養(yǎng)基固液比(X2)、奶粉添加質量分數(shù)(X3)的最佳組合分別為:0.96∶1、0.99∶1、0.81%,其對應的響應值(Y)為76.71SU/mL。為進一步確定計算結果,按最佳條件做驗證實驗,凝乳酶活力為72.92SU/mL。進一步證實了分析的可靠性。
通過對根霉產(chǎn)凝乳酶固態(tài)發(fā)酵條件的研究,確定最佳培養(yǎng)溫度和時間為24℃發(fā)酵7d;最佳接種量為2mL孢子數(shù)為106個/mL的霉孢子懸浮液;通過單因素分析和響應面試驗設計確定最佳培養(yǎng)基組成為:m麩皮∶m江米為0.96∶1、固液比為0.99∶1、奶粉添加質量分數(shù)為0.81%,所產(chǎn)的凝乳酶活力為72.92SU/mL。
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Optimization of Solid-state Fermentation Condition for Chymosin Production by Rhizopus
HAN Ling-ling1, PAN Dao-dong1,2,*
(1. Branch Center of National Dairy Products Processing Technology Development, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China;2. College of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)
In this study, the solid-state fermentation conditions for producing chymosin with Rhizopus were optimized through single factor experiments and response surface methodology. The optimal fermentation conditions were media with solid-liquid ratio of 0.99∶1 (m/V), bran-rice ratio of 0.96∶1 (m/m), milk powder addition amount of 0.81% (m/m) and fermentation at 24 ℃for 7 days. The activity of chymosin produced at this optimal condition reached up to 72.92 SU/mL.
Rhizopus;chymosin;response surface methodology
TQ925
A
1002-6630(2010)09-0156-05
2009-07-12
國家自然科學基金項目(30972130);“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD04A12);國家“863”計劃項目(2007AA10Z357)
韓玲玲(1983—),女,碩士研究生,研究方向為乳品科學。E-mail:linghan2007@126.com
*通信作者:潘道東(1964—),男,教授,博士,研究方向為乳品科學。E-mail:daodongpan@163.com