韓玲玲，潘道東,2,*

(1.南京師范大學(xué) 國家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 寧波 315211)

根霉產(chǎn)凝乳酶的固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

韓玲玲1，潘道東1,2,*

(1.南京師范大學(xué) 國家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心，江蘇 南京 210097；2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 寧波 315211)

對根霉產(chǎn)凝乳酶固體發(fā)酵條件進(jìn)行研究。通過單因素分析和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定根霉產(chǎn)凝乳酶的發(fā)酵條件及發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成為：24℃發(fā)酵7d；麩皮與江米質(zhì)量比為0.96∶1、培養(yǎng)基固液比(m/V)為0.99∶1、奶粉添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.81%，所產(chǎn)的凝乳酶活力達(dá)到72.92SU/mL。

根霉；凝乳酶；響應(yīng)面法

凝乳酶是干酪生產(chǎn)過程中一種重要的酶。傳統(tǒng)的凝乳酶來源于小牛的皺胃，但隨著干酪市場需求的日益增加，通過宰殺小牛來獲得凝乳酶不能完全滿足干酪的生產(chǎn)需要，因此很多研究者不斷地尋找其替代品[1-2]。微生物凝乳酶從1965年起開始取代小牛皺胃酶，成功的彌補(bǔ)了小牛皺胃酶短缺的問題并在奶酪制造業(yè)與干酪產(chǎn)業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用[3]。目前發(fā)現(xiàn)四十多種微生物可產(chǎn)凝乳酶，這些微生物主要是細(xì)菌、放線菌和真菌。常用的凝乳酶菌種有3種：米黑毛霉、微小毛霉和寄生內(nèi)座殼菌(栗疫菌)。目前已有多種應(yīng)用這3種菌生產(chǎn)的商品凝乳酶上市?，F(xiàn)在應(yīng)用最多的微生物凝乳酶是由微小毛霉生產(chǎn)的[4-5]。劉振民等發(fā)現(xiàn)酒藥中主要菌系——根霉，具有一定的產(chǎn)凝乳酶的活力，可作為凝乳酶的潛在生產(chǎn)菌株[6]。

微生物發(fā)酵產(chǎn)酶一方面和菌種的性質(zhì)有關(guān)，另一方面還同外界培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方式有直接的關(guān)系。固態(tài)發(fā)酵技術(shù)以其發(fā)酵設(shè)備的簡易性、相對便宜的成本構(gòu)成，特別對于絲狀真菌，固態(tài)發(fā)酵能夠更好地模擬菌種的自然生長條件，對于特定的發(fā)酵產(chǎn)物更為有力[7]。

本實(shí)驗(yàn)采用根霉作為菌種利用固態(tài)發(fā)酵方式產(chǎn)凝乳酶，研究對產(chǎn)凝乳酶有影響的因素和發(fā)酵培養(yǎng)基的組成，以期找出其產(chǎn)酶的最佳固態(tài)發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根霉由南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院南京微生物工程中心保存；脫脂奶粉 上海光明乳業(yè)股份有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基[8-9]：稱取200g去皮馬鈴薯，切碎后，水煮沸30min，紗布過濾，加入15～20g瓊脂和20g葡萄糖，定容至1000mL，倒斜面，121℃滅菌

20min，制備孢子數(shù)為106個/mL的霉孢子懸浮液，備用；發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：10g麩皮加10g江米和20mL蒸餾水，pH值自然，121℃殺菌20min。

1.3 方法

1.3.1 酶液的制備提取

取40g基礎(chǔ)培養(yǎng)基于250mL錐形瓶中，121℃殺菌20min。接種已調(diào)整孢子數(shù)為106個/mL的霉孢子懸浮液，28℃培養(yǎng)4d，然后加入80mL蒸餾水，置于8℃浸提15h，離心或者過濾(每組做3個平行實(shí)驗(yàn)取平均值)，取上清液測酶活力。

1.3.2 凝乳酶活力測定[10]

取5mL的100g/L脫脂乳液于35℃保溫5min，加入0.5mL酶液(也置于35℃保溫)，立即搖勻，準(zhǔn)確記錄從加入酶液到凝固的時(shí)間/s。40min凝固1mL 100g/L脫脂乳的酶量定義為一個索氏單位(Soxheh unit，SU)。

式中：t為凝乳時(shí)間/s；n為稀釋倍數(shù)。

1.3.3 響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和單因素試驗(yàn)，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，選擇其中對凝乳酶酵影響較大的因素(麩皮∶江米、培養(yǎng)基固液比、奶粉添加量)，利用Design Expert 7.1.3軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理，研究影響較大的因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)對產(chǎn)凝乳酶量的影響，以獲得最佳配比。每一自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以－1、0、1進(jìn)行編碼，各試驗(yàn)組的編碼與取值見表1。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼Table 1 Factors and levels of experimental design for fermentation media

2 結(jié)果與分析

2.1 根霉產(chǎn)凝乳酶固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.1.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的確定

培養(yǎng)基總干物料為20g，分別調(diào)整麩皮和江米的比例，加入20mL蒸餾水，接種2mL種子液，24℃培養(yǎng)4 d，測定酶活力。

由圖1可知，當(dāng)麩皮和江米的質(zhì)量比1∶1時(shí)，根霉產(chǎn)酶量最大，可能在該比例時(shí)，培養(yǎng)基中的各種營養(yǎng)素能基本滿足根霉產(chǎn)酶的需求；當(dāng)麩皮含量過大時(shí)，會造成菌絲大量迅速生長，易老化，從而產(chǎn)酶量減少，而江米含量過大時(shí)，可能由于合成凝乳酶的某種營養(yǎng)素含量較少而產(chǎn)酶不多。

圖1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的確定Fig.1 Basic compositions of media

2.1.2 培養(yǎng)時(shí)間和溫度對根霉產(chǎn)酶的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上接種2mL種子液，分別于20、24、28、32℃培養(yǎng)7d，每天定時(shí)測酶活力。

圖2 培養(yǎng)時(shí)間和溫度對根霉產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects of fermentation time and temperature on chymosin productivity

由圖2可知，根霉在24℃發(fā)酵7d，酶活最大。從各溫度、時(shí)間下根霉產(chǎn)酶的曲線可以看出，根霉在24℃條件下培養(yǎng)產(chǎn)酶最好。溫度過高，根霉生長加快，易老化，產(chǎn)酶減少。溫度過低則根霉生長過慢，產(chǎn)酶少。所以最佳的培養(yǎng)溫度和時(shí)間是24℃培養(yǎng)7d。

2.1.3 培養(yǎng)基固液比對根霉產(chǎn)酶的影響

在20g固體基料(10g麩皮，10g江米)的基礎(chǔ)上，分別調(diào)整固體基料和水分的比例，接種2mL種子液，24℃培養(yǎng)7 d，每天定時(shí)測酶活力。

圖3 培養(yǎng)基固液比對根霉產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on chymosin productivity

由圖3可知，培養(yǎng)基中固體基料與水分的最適比例為 1∶1，此時(shí)凝乳酶的酶活達(dá)到最高。固體培養(yǎng)基的含水量對霉菌的生長和凝乳酶的產(chǎn)生有著重要的影響，加水量太少，無法滿足根霉生長產(chǎn)酶所需水分；而加水量過多又不利于固體培養(yǎng)基的通氣和散熱。

2.1.4 接種量對根霉發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別接入不同體積的種子液，24℃培養(yǎng)7 d，每天定時(shí)測酶活力。

圖4 接種量對根霉產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of inoculum amount on chymosin productivity

由圖4可知，當(dāng)接種體積為2mL時(shí)，根霉產(chǎn)酶最多。可能是因?yàn)榻臃N量過少，生長較慢，發(fā)酵周期長；而接種量過大時(shí)，又會導(dǎo)致菌絲生長過旺盛，進(jìn)而造成固體培養(yǎng)基局部迅速升溫以及加速菌體老化，影響產(chǎn)酶量。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 不同外加碳源對根霉產(chǎn)酶的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的淀粉、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖，接種2 m L種子液，24℃培養(yǎng)7d，每天定時(shí)測酶活力。

圖5 不同外加碳源對根霉產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of carbon source on chymosin productivity

由圖5可知，麥芽糖和淀粉促進(jìn)了根霉產(chǎn)凝乳酶，且麥芽糖是最佳的外加碳源，而葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖對酶的形成有抑制作用。

2.2.2 麥芽糖添加量對產(chǎn)酶的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的麥芽糖，接種2mL種子液，24℃培養(yǎng)7d，每天定時(shí)測酶活力。

圖6 麥芽糖添加量對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of maltose addition amount on chymosin productivity

如圖6所示，在一定范圍內(nèi)，隨著麥芽糖的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，產(chǎn)酶量增多。當(dāng)麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，凝乳酶活力最高。繼續(xù)增加時(shí)反而減少。

2.2.3 不同外加氮源對根霉產(chǎn)酶的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三銨、硫酸銨、磷酸二氫銨、胰蛋白胨、干酪素和奶粉，接種2mL種子液，24℃培養(yǎng)7d，每天定時(shí)測酶活力。

圖7 不同氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of nitrogen source on chymosin productivity

如圖7所示，不同的氮源對根霉產(chǎn)酶影響不同。檸檬酸三銨、硫酸銨、磷酸二氫銨和胰蛋白胨抑制了根霉產(chǎn)凝乳酶的能力，而干酪素和奶粉對其起了促進(jìn)作用，奶粉促進(jìn)作用更強(qiáng)。

2.2.4 奶粉添加量對根霉產(chǎn)酶的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)上分別添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的奶粉，接種2mL種子液，24℃培養(yǎng)7d，每天定時(shí)測酶活力。

圖8 奶粉添加量對根霉產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of milk powder amount on chymosin productivity

如圖8所示，當(dāng)奶粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)，產(chǎn)酶量最大。這可能是因?yàn)榇藭r(shí)的氮源即能滿足菌絲的生長，又能提供蛋白質(zhì)合成時(shí)所需的氮源。而當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)增高時(shí)，C/N減小，菌體生長過于旺盛，營養(yǎng)物質(zhì)過多的用于菌體的生長，導(dǎo)致產(chǎn)酶量的下降。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Data of response surface experiments

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果回歸方差分析Table 3 Variance analysis of regression

響應(yīng)面分析試驗(yàn)根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行了17組試驗(yàn)，其中5組中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果見表2。利用Design Expert 7.1.3軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到回歸方程如下：

表3方差分析表明，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性(P＜0.0001)。其決定系數(shù)為0.9765，校正決定系數(shù)為0.9463，且失擬性檢驗(yàn)不顯著(P=0.577＞0.05)，說明所擬合的回歸方程合適，對試驗(yàn)擬合情況較好。

圖9 培養(yǎng)基固液比與麩皮和江米質(zhì)量比的響應(yīng)面及等高線圖Fig.9 Response surface chart and contour line ofY=f(X1,X2)

圖10 奶粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與麩皮和江米質(zhì)量比的響應(yīng)面及等高線圖Fig.10 Response surface chart and contour line ofY=f(X1,X3)

圖11 培養(yǎng)基固液比與奶粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的響應(yīng)面及等高線Fig.11 The response surface chart and contour line ofY=f(X2, X3)

從表3和圖9～11可以看出，各個因素在所選擇的范圍內(nèi)對凝乳酶的產(chǎn)生都有顯著的影響(P＜0.05)。從響應(yīng)面分析的立體圖和等高線圖可看出，各因素之間存在一定的交互作用。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程，利用Design Expert7.1.3軟件獲得了m麩皮∶m江米(X1)、培養(yǎng)基固液比(X2)、奶粉添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X3)的最佳組合分別為：0.96∶1、0.99∶1、0.81%，其對應(yīng)的響應(yīng)值(Y)為76.71SU/mL。為進(jìn)一步確定計(jì)算結(jié)果，按最佳條件做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，凝乳酶活力為72.92SU/mL。進(jìn)一步證實(shí)了分析的可靠性。

3 結(jié) 論

通過對根霉產(chǎn)凝乳酶固態(tài)發(fā)酵條件的研究，確定最佳培養(yǎng)溫度和時(shí)間為24℃發(fā)酵7d；最佳接種量為2mL孢子數(shù)為106個/mL的霉孢子懸浮液；通過單因素分析和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最佳培養(yǎng)基組成為：m麩皮∶m江米為0.96∶1、固液比為0.99∶1、奶粉添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.81%，所產(chǎn)的凝乳酶活力為72.92SU/mL。

[1]HASHEM A M. Optimization of milk-clotting enzyme productivity by Penicillium oxalicum[J]. Bioresource Technology, 1999, 70(2)∶ 203-207.

[2]曾劍超. 國內(nèi)凝乳酶及其代替品的研發(fā)進(jìn)展[J]. 中國牛業(yè)科學(xué), 2008, 34(2)∶ 48-50.

[3]張紅梅, 劉鐘濱. 凝乳酶的研究進(jìn)展[J]. 同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)∶ 醫(yī)學(xué)版, 2004, 25(3)∶ 254-257.

[4]姜成林. 放線菌產(chǎn)生各種有用物質(zhì)的初步探索[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 1988, 15(1)∶ 16-19.

[5]郭光遠(yuǎn), 姜成林, 馬俊. 微生物凝乳酶的研究Ⅰ∶ 菌株的篩選、發(fā)酵、制備及毒性[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 1988,15(5)∶ 207-210.

[6]劉振民. 酒藥中凝乳酶菌株篩選及產(chǎn)酶條件研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2002, 27(5)∶ 8-11.

[7]滕國新. 酒曲中根酶凝乳酶性質(zhì)及對扣碗酪凝乳質(zhì)地影響的研究[D].北京∶ 中國農(nóng)業(yè)大學(xué), 2005.

[8]沈萍, 范秀容, 李廣武. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 3版. 北京∶ 高等教育出版社, 1989∶ 267-304.

[9]李順鵬. 微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M]. 北京∶ 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2003∶ 74-76.

[10]駱承庠. 酒藥中凝乳酶特性及產(chǎn)酶條件的研究[J]. 食品科學(xué), 2000, 21(2)∶ 3-6.

Optimization of Solid-state Fermentation Condition for Chymosin Production by Rhizopus

HAN Ling-ling1， PAN Dao-dong1,2,*
(1. Branch Center of National Dairy Products Processing Technology Development, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. College of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In this study, the solid-state fermentation conditions for producing chymosin with Rhizopus were optimized through single factor experiments and response surface methodology. The optimal fermentation conditions were media with solid-liquid ratio of 0.99∶1 (m/V), bran-rice ratio of 0.96∶1 (m/m), milk powder addition amount of 0.81% (m/m) and fermentation at 24 ℃for 7 days. The activity of chymosin produced at this optimal condition reached up to 72.92 SU/mL.

Rhizopus；chymosin；response surface methodology

TQ925

A

1002-6630(2010)09-0156-05

2009-07-12

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30972130)；“十一五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD04A12)；國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z357)

韓玲玲(1983—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：linghan2007@126.com

*通信作者：潘道東(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail：daodongpan@163.com