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        根霉產(chǎn)凝乳酶的固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

        2010-03-22 03:50:35韓玲玲潘道東
        食品科學(xué) 2010年9期
        關(guān)鍵詞:江米凝乳酶產(chǎn)酶

        韓玲玲,潘道東,2,*

        (1.南京師范大學(xué) 國(guó)家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心,江蘇 南京 210097;2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院,江蘇 寧波 315211)

        根霉產(chǎn)凝乳酶的固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

        韓玲玲1,潘道東1,2,*

        (1.南京師范大學(xué) 國(guó)家乳品加工技術(shù)研發(fā)分中心,江蘇 南京 210097;2.寧波大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院,江蘇 寧波 315211)

        對(duì)根霉產(chǎn)凝乳酶固體發(fā)酵條件進(jìn)行研究。通過(guò)單因素分析和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),確定根霉產(chǎn)凝乳酶的發(fā)酵條件及發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成為:24℃發(fā)酵7d;麩皮與江米質(zhì)量比為0.96∶1、培養(yǎng)基固液比(m/V)為0.99∶1、奶粉添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.81%,所產(chǎn)的凝乳酶活力達(dá)到72.92SU/mL。

        根霉;凝乳酶;響應(yīng)面法

        凝乳酶是干酪生產(chǎn)過(guò)程中一種重要的酶。傳統(tǒng)的凝乳酶來(lái)源于小牛的皺胃,但隨著干酪市場(chǎng)需求的日益增加,通過(guò)宰殺小牛來(lái)獲得凝乳酶不能完全滿足干酪的生產(chǎn)需要,因此很多研究者不斷地尋找其替代品[1-2]。微生物凝乳酶從1965年起開始取代小牛皺胃酶,成功的彌補(bǔ)了小牛皺胃酶短缺的問(wèn)題并在奶酪制造業(yè)與干酪產(chǎn)業(yè)中得到廣泛的應(yīng)用[3]。目前發(fā)現(xiàn)四十多種微生物可產(chǎn)凝乳酶,這些微生物主要是細(xì)菌、放線菌和真菌。常用的凝乳酶菌種有3種:米黑毛霉、微小毛霉和寄生內(nèi)座殼菌(栗疫菌)。目前已有多種應(yīng)用這3種菌生產(chǎn)的商品凝乳酶上市?,F(xiàn)在應(yīng)用最多的微生物凝乳酶是由微小毛霉生產(chǎn)的[4-5]。劉振民等發(fā)現(xiàn)酒藥中主要菌系——根霉,具有一定的產(chǎn)凝乳酶的活力,可作為凝乳酶的潛在生產(chǎn)菌株[6]。

        微生物發(fā)酵產(chǎn)酶一方面和菌種的性質(zhì)有關(guān),另一方面還同外界培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方式有直接的關(guān)系。固態(tài)發(fā)酵技術(shù)以其發(fā)酵設(shè)備的簡(jiǎn)易性、相對(duì)便宜的成本構(gòu)成,特別對(duì)于絲狀真菌,固態(tài)發(fā)酵能夠更好地模擬菌種的自然生長(zhǎng)條件,對(duì)于特定的發(fā)酵產(chǎn)物更為有力[7]。

        本實(shí)驗(yàn)采用根霉作為菌種利用固態(tài)發(fā)酵方式產(chǎn)凝乳酶,研究對(duì)產(chǎn)凝乳酶有影響的因素和發(fā)酵培養(yǎng)基的組成,以期找出其產(chǎn)酶的最佳固態(tài)發(fā)酵條件。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        根霉由南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院南京微生物工程中心保存;脫脂奶粉 上海光明乳業(yè)股份有限公司;所用試劑均為分析純。

        1.2 培養(yǎng)基

        斜面種子培養(yǎng)基[8-9]:稱取200g去皮馬鈴薯,切碎后,水煮沸30min,紗布過(guò)濾,加入15~20g瓊脂和20g葡萄糖,定容至1000mL,倒斜面,121℃滅菌

        20min,制備孢子數(shù)為106個(gè)/mL的霉孢子懸浮液,備用;發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:10g麩皮加10g江米和20mL蒸餾水,pH值自然,121℃殺菌20min。

        1.3 方法

        1.3.1 酶液的制備提取

        取40g基礎(chǔ)培養(yǎng)基于250mL錐形瓶中,121℃殺菌20min。接種已調(diào)整孢子數(shù)為106個(gè)/mL的霉孢子懸浮液,28℃培養(yǎng)4d,然后加入80mL蒸餾水,置于8℃浸提15h,離心或者過(guò)濾(每組做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)取平均值),取上清液測(cè)酶活力。

        1.3.2 凝乳酶活力測(cè)定[10]

        取5mL的100g/L脫脂乳液于35℃保溫5min,加入0.5mL酶液(也置于35℃保溫),立即搖勻,準(zhǔn)確記錄從加入酶液到凝固的時(shí)間/s。40min凝固1mL 100g/L脫脂乳的酶量定義為一個(gè)索氏單位(Soxheh unit,SU)。

        式中:t為凝乳時(shí)間/s;n為稀釋倍數(shù)。

        1.3.3 響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)

        根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和單因素試驗(yàn),在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,選擇其中對(duì)凝乳酶酵影響較大的因素(麩皮∶江米、培養(yǎng)基固液比、奶粉添加量),利用Design Expert 7.1.3軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)處理,研究影響較大的因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)對(duì)產(chǎn)凝乳酶量的影響,以獲得最佳配比。每一自變量的低、中、高試驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼,各試驗(yàn)組的編碼與取值見(jiàn)表1。

        表1 發(fā)酵培養(yǎng)基響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平編碼Table 1 Factors and levels of experimental design for fermentation media

        2 結(jié)果與分析

        2.1 根霉產(chǎn)凝乳酶固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

        2.1.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的確定

        培養(yǎng)基總干物料為20g,分別調(diào)整麩皮和江米的比例,加入20mL蒸餾水,接種2mL種子液,24℃培養(yǎng)4 d,測(cè)定酶活力。

        由圖1可知,當(dāng)麩皮和江米的質(zhì)量比1∶1時(shí),根霉產(chǎn)酶量最大,可能在該比例時(shí),培養(yǎng)基中的各種營(yíng)養(yǎng)素能基本滿足根霉產(chǎn)酶的需求;當(dāng)麩皮含量過(guò)大時(shí),會(huì)造成菌絲大量迅速生長(zhǎng),易老化,從而產(chǎn)酶量減少,而江米含量過(guò)大時(shí),可能由于合成凝乳酶的某種營(yíng)養(yǎng)素含量較少而產(chǎn)酶不多。

        圖1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的確定Fig.1 Basic compositions of media

        2.1.2 培養(yǎng)時(shí)間和溫度對(duì)根霉產(chǎn)酶的影響

        在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上接種2mL種子液,分別于20、24、28、32℃培養(yǎng)7d,每天定時(shí)測(cè)酶活力。

        圖2 培養(yǎng)時(shí)間和溫度對(duì)根霉產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects of fermentation time and temperature on chymosin productivity

        由圖2可知,根霉在24℃發(fā)酵7d,酶活最大。從各溫度、時(shí)間下根霉產(chǎn)酶的曲線可以看出,根霉在24℃條件下培養(yǎng)產(chǎn)酶最好。溫度過(guò)高,根霉生長(zhǎng)加快,易老化,產(chǎn)酶減少。溫度過(guò)低則根霉生長(zhǎng)過(guò)慢,產(chǎn)酶少。所以最佳的培養(yǎng)溫度和時(shí)間是24℃培養(yǎng)7d。

        2.1.3 培養(yǎng)基固液比對(duì)根霉產(chǎn)酶的影響

        在20g固體基料(10g麩皮,10g江米)的基礎(chǔ)上,分別調(diào)整固體基料和水分的比例,接種2mL種子液,24℃培養(yǎng)7 d,每天定時(shí)測(cè)酶活力。

        圖3 培養(yǎng)基固液比對(duì)根霉產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on chymosin productivity

        由圖3可知,培養(yǎng)基中固體基料與水分的最適比例為 1∶1,此時(shí)凝乳酶的酶活達(dá)到最高。固體培養(yǎng)基的含水量對(duì)霉菌的生長(zhǎng)和凝乳酶的產(chǎn)生有著重要的影響,加水量太少,無(wú)法滿足根霉生長(zhǎng)產(chǎn)酶所需水分;而加水量過(guò)多又不利于固體培養(yǎng)基的通氣和散熱。

        2.1.4 接種量對(duì)根霉發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

        在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別接入不同體積的種子液,24℃培養(yǎng)7 d,每天定時(shí)測(cè)酶活力。

        圖4 接種量對(duì)根霉產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of inoculum amount on chymosin productivity

        由圖4可知,當(dāng)接種體積為2mL時(shí),根霉產(chǎn)酶最多。可能是因?yàn)榻臃N量過(guò)少,生長(zhǎng)較慢,發(fā)酵周期長(zhǎng);而接種量過(guò)大時(shí),又會(huì)導(dǎo)致菌絲生長(zhǎng)過(guò)旺盛,進(jìn)而造成固體培養(yǎng)基局部迅速升溫以及加速菌體老化,影響產(chǎn)酶量。

        2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

        2.2.1 不同外加碳源對(duì)根霉產(chǎn)酶的影響

        在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的淀粉、葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖和蔗糖,接種2 m L種子液,24℃培養(yǎng)7d,每天定時(shí)測(cè)酶活力。

        圖5 不同外加碳源對(duì)根霉產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of carbon source on chymosin productivity

        由圖5可知,麥芽糖和淀粉促進(jìn)了根霉產(chǎn)凝乳酶,且麥芽糖是最佳的外加碳源,而葡萄糖、果糖、乳糖和蔗糖對(duì)酶的形成有抑制作用。

        2.2.2 麥芽糖添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響

        在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的麥芽糖,接種2mL種子液,24℃培養(yǎng)7d,每天定時(shí)測(cè)酶活力。

        圖6 麥芽糖添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of maltose addition amount on chymosin productivity

        如圖6所示,在一定范圍內(nèi),隨著麥芽糖的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大,產(chǎn)酶量增多。當(dāng)麥芽糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí),凝乳酶活力最高。繼續(xù)增加時(shí)反而減少。

        2.2.3 不同外加氮源對(duì)根霉產(chǎn)酶的影響

        在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三銨、硫酸銨、磷酸二氫銨、胰蛋白胨、干酪素和奶粉,接種2mL種子液,24℃培養(yǎng)7d,每天定時(shí)測(cè)酶活力。

        圖7 不同氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of nitrogen source on chymosin productivity

        如圖7所示,不同的氮源對(duì)根霉產(chǎn)酶影響不同。檸檬酸三銨、硫酸銨、磷酸二氫銨和胰蛋白胨抑制了根霉產(chǎn)凝乳酶的能力,而干酪素和奶粉對(duì)其起了促進(jìn)作用,奶粉促進(jìn)作用更強(qiáng)。

        2.2.4 奶粉添加量對(duì)根霉產(chǎn)酶的影響

        在基礎(chǔ)培養(yǎng)上分別添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的奶粉,接種2mL種子液,24℃培養(yǎng)7d,每天定時(shí)測(cè)酶活力。

        圖8 奶粉添加量對(duì)根霉產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of milk powder amount on chymosin productivity

        如圖8所示,當(dāng)奶粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí),產(chǎn)酶量最大。這可能是因?yàn)榇藭r(shí)的氮源即能滿足菌絲的生長(zhǎng),又能提供蛋白質(zhì)合成時(shí)所需的氮源。而當(dāng)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)增高時(shí),C/N減小,菌體生長(zhǎng)過(guò)于旺盛,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)多的用于菌體的生長(zhǎng),導(dǎo)致產(chǎn)酶量的下降。

        2.3 響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件

        表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Data of response surface experiments

        表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果回歸方差分析Table 3 Variance analysis of regression

        響應(yīng)面分析試驗(yàn)根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)進(jìn)行了17組試驗(yàn),其中5組中心點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)表2。利用Design Expert 7.1.3軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到回歸方程如下:

        表3方差分析表明,本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性(P<0.0001)。其決定系數(shù)為0.9765,校正決定系數(shù)為0.9463,且失擬性檢驗(yàn)不顯著(P=0.577>0.05),說(shuō)明所擬合的回歸方程合適,對(duì)試驗(yàn)擬合情況較好。

        圖9 培養(yǎng)基固液比與麩皮和江米質(zhì)量比的響應(yīng)面及等高線圖Fig.9 Response surface chart and contour line ofY=f(X1,X2)

        圖10 奶粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與麩皮和江米質(zhì)量比的響應(yīng)面及等高線圖Fig.10 Response surface chart and contour line ofY=f(X1,X3)

        圖11 培養(yǎng)基固液比與奶粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的響應(yīng)面及等高線Fig.11 The response surface chart and contour line ofY=f(X2, X3)

        從表3和圖9~11可以看出,各個(gè)因素在所選擇的范圍內(nèi)對(duì)凝乳酶的產(chǎn)生都有顯著的影響(P<0.05)。從響應(yīng)面分析的立體圖和等高線圖可看出,各因素之間存在一定的交互作用。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)所得的結(jié)果和二次多項(xiàng)回歸方程,利用Design Expert7.1.3軟件獲得了m麩皮∶m江米(X1)、培養(yǎng)基固液比(X2)、奶粉添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)(X3)的最佳組合分別為:0.96∶1、0.99∶1、0.81%,其對(duì)應(yīng)的響應(yīng)值(Y)為76.71SU/mL。為進(jìn)一步確定計(jì)算結(jié)果,按最佳條件做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),凝乳酶活力為72.92SU/mL。進(jìn)一步證實(shí)了分析的可靠性。

        3 結(jié) 論

        通過(guò)對(duì)根霉產(chǎn)凝乳酶固態(tài)發(fā)酵條件的研究,確定最佳培養(yǎng)溫度和時(shí)間為24℃發(fā)酵7d;最佳接種量為2mL孢子數(shù)為106個(gè)/mL的霉孢子懸浮液;通過(guò)單因素分析和響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最佳培養(yǎng)基組成為:m麩皮∶m江米為0.96∶1、固液比為0.99∶1、奶粉添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.81%,所產(chǎn)的凝乳酶活力為72.92SU/mL。

        [1]HASHEM A M. Optimization of milk-clotting enzyme productivity by Penicillium oxalicum[J]. Bioresource Technology, 1999, 70(2)∶ 203-207.

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        Optimization of Solid-state Fermentation Condition for Chymosin Production by Rhizopus

        HAN Ling-ling1, PAN Dao-dong1,2,*
        (1. Branch Center of National Dairy Products Processing Technology Development, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China;2. College of Life Science and Biotechnology, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

        In this study, the solid-state fermentation conditions for producing chymosin with Rhizopus were optimized through single factor experiments and response surface methodology. The optimal fermentation conditions were media with solid-liquid ratio of 0.99∶1 (m/V), bran-rice ratio of 0.96∶1 (m/m), milk powder addition amount of 0.81% (m/m) and fermentation at 24 ℃for 7 days. The activity of chymosin produced at this optimal condition reached up to 72.92 SU/mL.

        Rhizopus;chymosin;response surface methodology

        TQ925

        A

        1002-6630(2010)09-0156-05

        2009-07-12

        國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30972130);“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2006BAD04A12);國(guó)家“863”計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA10Z357)

        韓玲玲(1983—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail:linghan2007@126.com

        *通信作者:潘道東(1964—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槿槠房茖W(xué)。E-mail:daodongpan@163.com

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