樊曉博，楊金易，高秀杰，吳英松，孫遠明，雷紅濤,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642)

Eu3+標抗原鹽酸克倫特羅的時間分辨熒光免疫檢測

樊曉博1,2，楊金易2，高秀杰2，吳英松2，孫遠明2，雷紅濤2,*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642)

采用時間分辨熒光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)建立簡便、快速、靈敏的鹽酸克倫特羅(clenbuterol hydrochloride，CBL)檢測方法。以自制鹽酸克倫特羅單克隆抗體包被96孔微孔板作為固相抗體，Eu3+標記抗原與樣品中的CBL競爭結(jié)合抗體，建立直接競爭熒光免疫分析體系。豬尿、組織樣品添加回收率實驗表明：方法靈敏度為0.02μg/L，樣品回收率為91%～101%，與沙丁胺醇、萊克多巴胺等結(jié)構(gòu)類似物的交叉反應(yīng)率均小于1%。建立鹽酸克倫特羅銪標抗原直接競爭時間分辨免疫檢測方法，方法靈敏度高、特異性強，且操作簡單，完全可以滿足現(xiàn)有實際檢測需求。

鹽酸克倫特羅；時間分辨；標記抗原；檢測

鹽酸克倫特羅(clenbuterol hydrochloride，CBL)，俗稱“瘦肉精”，是β-興奮劑的一種[1]，過量使用可提高畜類瘦肉率，而在可食用組織中CBL的殘留對人體有相當大的毒性[2]，尤其是殘留于肝臟，并通過食物鏈危害人類健康[3]，我國政府明令禁止其作為飼料添加劑使用[4]，但受經(jīng)濟利益驅(qū)使，仍有一些不法商販非法使用克倫特羅，致使克倫特羅中毒事件時有發(fā)生。因此，建立一種高效、簡便、快速、靈敏的克倫特羅殘留檢測方法十分必要。

目前，針對動物組織和尿液中鹽酸克倫特羅的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[5-6]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[7-9]、高效液相色譜法(HPLC)[10]及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11]等。儀器法檢測雖然檢測精度高，但其檢測過程繁瑣、檢測時間長、儀器昂貴等特點導(dǎo)致其不能進行高通量的篩查檢測，通常用于陽性樣品的確證。而免疫檢測法靈敏度高、價格低、操作簡單、樣品通量高的特點使得其非常適合大規(guī)模的篩查檢測[12]。時間分辨免疫技術(shù)(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)是基于抗原抗體的特異性反應(yīng)，以稀土元素為信號放大標記物，結(jié)合抗原抗體反應(yīng)的特異性和Eu3+標記信號的高靈敏度，可以實現(xiàn)違禁藥物的痕量檢測，應(yīng)用前景十分廣闊。與傳統(tǒng)的酶免疫法(EIA)、發(fā)射免疫分析法(RIA)相比，它具有很多優(yōu)點：靈敏度10-19mol/L，穩(wěn)定性好，克服了酶和放射性熒光物質(zhì)的不穩(wěn)定性、動態(tài)范圍寬、試劑貨架期長、無放射性危害等缺點，時間分辨熒光分析目前被公認為是靈敏度最高的分析方法之一。

通過Eu3+標記抗體，其靈敏度為0.03μg/L[13]，而本研究以稀土元素銪直接標記抗原，通過固相包被抗體，研究目的是建立Eu3+標抗原直接競爭TRFIA。通過Eu3+標記抗原，一方面減少銪標記抗體對抗體識別性能的下降，另一方面降低抗原與抗體的親和力，從而進一步提高檢測靈敏度。采用一步法競爭反應(yīng)模式，建立具有快速、靈敏、特異、準確的鹽酸克倫特羅違禁藥物殘留檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、特布他林、卡布特羅、塞曼特羅和馬不特羅(純度大于99%)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)院；CBL-OVA(Ovalbumin)、抗CBL單克隆抗體 本實驗室自制； 96孔微量反應(yīng)板 雷博公司；Eu3+標記試劑盒(1244-302) 美國PE-Wallac 公司；CBL-ELISA試劑盒 德國拜發(fā)公司；陰性豬尿樣廣州市獸藥監(jiān)督所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；1-13型快速離心機 Sigma公司；1575型洗板機 Bio-RAD公司；P200微量可調(diào)移液槍 吉爾森公司；KJ-201C型微量振蕩器 江蘇康健醫(yī)療用品有限公司；1235型TRFIA全自動分析儀 Wallac公司。

1.3 方法

1.3.1 CBL標準液的配制

CBL以標準品稀釋液配制成質(zhì)量濃度20mg/L的溶液，稀釋到500μg/L作為標準貯備液。使用前配成質(zhì)量濃度梯度0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1μg/L的CBL標準工作液。

1.3.2 Eu3+-CBL-OVA標記物的制備[14]

將0.5mg CBL-OVA加入到純化離心柱中，8000r/min離心5～6min，加入200μL標記緩沖液，8000r/min離心，棄濾液，再加入200μL標記緩沖液，按上述方法離心重復(fù)5次。將離心管取出，棄濾液，把離心柱反轉(zhuǎn)，2000～3000r/min離心1min，收集濾液，即為待標記物。標記物完成濃縮去雜質(zhì)后，按10:1質(zhì)量比將標記物和銪標記試劑充分混勻進行標記。按標記試劑盒說明，置4℃冰箱過夜，次日經(jīng)過凝膠層析柱SephadexTMG25純化，每管收集產(chǎn)物1mL，各管取50μL于96孔反應(yīng)板中，加入熒光增強液200μL，室溫振蕩5min后測熒光值，以熒光值為縱坐標，管號為橫坐標，繪制曲線。

1.3.3 固相包被抗體制備[15]

將CBL單克隆抗體用PBS緩沖液(pH7.2)稀釋至1mg/L，96孔微孔板中各孔加入200μL，37℃放置過夜，棄去包被液，加入封閉液，每孔220μL，封閉3h。棄去封閉液，烘干，備用。

1.3.4 反應(yīng)條件優(yōu)化

以CBL單克隆抗體1:500、1:1000、1:2000、1:4000這4種稀釋度包被，加入100μL標準品和100μL稀釋度為1:2000的Eu3+-CBL-OVA標記物，確定最佳包被稀釋度。用最佳的包被稀釋度包板，加入100μL標準品和質(zhì)量濃度分別為0.2、0.5、1.0、2.0mg/L的Eu3+-CBLOVA標記物，確定最佳銪標抗原的質(zhì)量濃度。

1.3.5 一步法直接競爭TRFIA操作步驟

取包被好的板條，加入100μL CBL的標準品(或處理好的樣品) 到相應(yīng)的微孔中，加分析緩沖液稀釋的Eu3+-CBL-OVA標記物100μL，室溫振蕩1h，用洗滌液洗6次，加200μL 增強液振蕩5min 后測定熒光值。標準曲線計算樣品中CBL的含量。

1.3.6 樣品處理

將組織樣品絞碎，取絞碎樣品1g于離心管，加入5mL水，振蕩5min，于沸水浴中加熱至組織樣品變色，5000r/min離心10min，取上清檢測。尿樣直接檢測即可。

1.3.7 考察指標

靈敏度：計算標準曲線零質(zhì)量濃度點8次重復(fù)的熒光值，CBL標準溶液質(zhì)量濃度(0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1μg/L)的對數(shù)值為橫坐標以抑制率為縱坐標繪制標準曲線，測定靈敏度。

式中：F為各質(zhì)量濃度的熒光值；F0為零濃度的熒光值。

特異性：將CBL的結(jié)構(gòu)類似物沙丁胺醇、萊克多巴胺、特步他林和卡布特羅配成不同質(zhì)量濃度的溶液作為待測樣品，采用直接競爭TRFIA檢測，計算交叉反應(yīng)率。

回收率：向陰性樣品中分別加入添加不同質(zhì)量濃度的CBL標準品，處理后用直接競爭TRFIA 進行濃度測定，每個質(zhì)量濃度做3個平行測定。

1.3.8 與德國拜發(fā)ELISA試劑盒進行比較

分別用兩種方法測定5份尿樣樣品，對結(jié)果進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 Eu3+-CBL-OVA標記物的收集

Eu3+-CBL-OVA標記物經(jīng)過凝膠層析柱SephadexTMG25純化，收集純化的標記物，由于Eu3+標記的抗原為大分子物質(zhì)，先出峰，且比較集中，所以第一個熒光峰即為成功進行標記的抗體產(chǎn)物；后出峰的為游離Eu3+及其螯合物質(zhì)。故收集第一洗脫峰(圖1)。

圖1 SephadexTMG25洗脫圖Fig.1 Elution profile of europium labeled CBL-ovalbumin on SephadexTMG25 column

2.2 反應(yīng)條件優(yōu)化

抗原和抗體的質(zhì)量濃度對免疫學(xué)檢測方法的靈敏度和特異性有重要影響，因此有必要對合適的抗原和抗體質(zhì)量濃度進行探索。

2.2.1 最佳抗體包被稀釋度確定

圖2 包被抗體稀釋度曲線Fig.2 Dilution curve of the coating antibody obtained by direct competitive TRFIA

以最高熒光值(Fmax)、IC50和IC50/Fmax為綜合參考指標，由圖2可知，最高熒光值與抗體質(zhì)量濃度成正比，抗體質(zhì)量濃度過高時，抗體結(jié)合的銪標抗原過多，影響方法的靈敏度。包被抗體稀釋度為1:2000時，IC50/ Fmax達到最低，這時檢測方法靈敏度最高。當抗體稀釋度為1:4000時，盡管IC50差別不大，但其Fmax太低，使表示靈敏度的IC50/Fmax也升高，因此選擇稀釋度1:2000為最佳包被抗體質(zhì)量濃度。

2.2.2 最佳銪標抗原質(zhì)量濃度確定

選擇包被抗體稀釋度為1:2000，選擇不同質(zhì)量濃度的銪標抗原做直接競爭TRFIA實驗，結(jié)果如圖3所示，隨著銪標抗原質(zhì)量濃度的降低，熒光值逐漸減小，IC50也相應(yīng)降低，當銪標記物質(zhì)量濃度為1mg/L時，IC50和IC50/Fmax均為最低，F(xiàn)max與其他銪標抗原濃度相比也處在最適宜的范圍內(nèi)，說明此質(zhì)量濃度下反應(yīng)體系的靈敏度最高，故選擇1mg/L為最佳銪標抗原質(zhì)量濃度。

圖3 CBL-TRFIA銪標抗原質(zhì)量濃度曲線Fig.3 Concentration curve of Eu3+labeled CBL-OVA obtained by direct competitive TRFIA

2.3 TRFIA方法的考核

2.3.1 方法靈敏度

圖4 CBL-TRFIA標準曲線Fig.4 Standard curve for the TRFIA determination of CBL

在優(yōu)化的反應(yīng)條件下繪制標準曲線，如圖4所示。以零劑量熒光值(F0)均值減2s后的計數(shù)率在標準曲線上得到的相應(yīng)質(zhì)量濃度為檢測的靈敏度，靈敏度為0.02μg/L，IC50為0.29μg/L ，曲線的相關(guān)系數(shù)為0.995，說明方法線性關(guān)系良好。

2.3.2 方法的特異性

將CBL的結(jié)構(gòu)類似物配成不同質(zhì)量濃度的溶液作為被測樣品，采用TRFIA方法進行測定，沙丁胺醇、萊克多巴胺、特步他林、卡布特羅、塞曼特羅、馬不特羅的交叉反應(yīng)率分別為0.12%、0.62%、0.34%、0.50%、0.29%、0.43%，抗體與幾種藥物交叉反應(yīng)率很小，說明抗體特異性較高。

2.3.3 方法回收率

直接CBL-TRFIA的批內(nèi)和批間變異系數(shù)(CV)分別為4.4%和8.1%，都符合批內(nèi)CV＜5%，批間CV＜10%的要求。加標回收實驗是評價ELISA、TRFIA等檢測方法準確度的一個重要指標。由表1可見，添加量0.1、1.0、3.0、5.0μg/L的回收率都達到90%以上，變異系數(shù)在合適的范圍內(nèi)，說明該方法重復(fù)性好，用于樣品分析較為準確。

表1 回收率實驗結(jié)果Table1 Spike recoveries of the developed TRFIA method for CBL in different matrix samples

2.4 方法的準確度

采用克倫特羅ELISA檢測試劑盒，通過運用兩種方法分別對5份已知質(zhì)量濃度的尿樣進行測定，結(jié)果見表2。由表2可知，兩種方法對同一種樣品的測定值接近，與樣品實際濃度符合程度較高，說明實驗建立的直接競爭TRFIA方法準確度較高，可以滿足實際樣品的檢測需求。

表2 TRFIA與ELISA試劑盒測定樣品結(jié)果比較(x±s，n=5)Table2 Results of TRFIA and ELISA determinations of known porcine urine samples (x±s，n=5)

3 結(jié) 論

成功建立銪標記抗原、包被抗體的直接競爭鹽酸克倫特羅時間分辨熒光免疫分析法。該方法操作簡單，穩(wěn)定性高，靈敏性好，標準曲線顯示該方法檢測限為靈敏度為0.02μg/L，IC50為0.29μg/L，回收率在91%～101%，同時對實際樣品檢測結(jié)果與進口試劑盒所檢測結(jié)果接近，與已有時間分辨方法相比，本方法檢測速度快、靈敏度高、特異性強，且操作簡單，完全可以滿足現(xiàn)有實際檢測需求，具有良好的應(yīng)用前景。

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Time-resolved Fluoroimmunoassay of Clenbuterol Hydrochloride using Europium Labeled Antigen

FAN Xiao-bo1,2，YANG Jin-yi2，GAO Xiu-jie2，WU Ying-song2，SUN Yuan-ming2，LEI Hong-tao2,*
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China；2. Key Laboratory of Food Quality and Safety of Guangdong Province, College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China)

A convenient, rapid and sensitive method has been presented for the determination of clenbuterol hydrochloride (CBL) using the direct competitive time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA). In the direct competitive assay, the anti-CBL monoclonal antibody was bound on the surface of a 96-cell microplate, and samples containing CBL or the standards competed for the antibody binding sites with Eu3+labeled antigen in the wells of microplate. The determinations of CBL in porcine urine and tissue samples showed that the limit of detection was 0.02μg/L, with spike recoveries ranging from 91% to 101%. The cross-reaction rates with other six drugs were less than 1%. The proposed TRFIA method is sensitive and specific, and can be used for the determination of CBL residue in food samples.

cenbuterol hydrochloride (CBL)；time-resolved fluoroimmunoassay (TRFIA)；antigen；detection

X792

A

1002-6630(2010)20-0307-04

2009-12-24

樊曉博(1984—)，女，碩士研究生，研究方向為食品質(zhì)量與安全。E-mail：fxb307@yahoo.com.cn

*通信作者：雷紅濤(1973—)，男，副教授，博士，研究方向為食品質(zhì)量與安全。E-mail：hongtao@scau.edu.cn