楊靖亞，張 建，趙 勇，陶 妍，陸小凡，晁若瑜

(上海海洋大學食品學院，上海 201306)

Western斑點印跡法檢測致病性副溶血弧菌

楊靖亞，張 建，趙 勇，陶 妍，陸小凡，晁若瑜

(上海海洋大學食品學院，上海 201306)

目的：對副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)的直接耐熱溶血毒素(thermostable direct hemolysin，TDH)進行分離純化，建立Western斑點印跡法技術檢測致病性副溶血弧菌的方法。方法：用直接耐熱溶血毒素免疫小鼠得到特異性抗血清，利用棋盤方法確定免疫血清最佳工作濃度，并對致病性與非致病性副溶血弧菌分別進行特異性測定。結果：最佳免疫血清最佳工作濃度為1:3200；檢測致病性副溶血弧菌為陽性，非致病性副溶血弧菌屬呈陰性。結論：Western斑點印跡法技術可以特異性檢測致病性副溶血弧菌，靈敏度高、操作簡單，可用肉眼判定結果。

耐熱直接溶血毒素；Western斑點印跡；致病性副溶血弧菌；檢測

副溶血弧菌是一種嗜鹽性細菌，屬弧菌科、弧菌屬。存在于近海岸的海水和魚類、貝類中，具有致病性的菌株可引起食物中毒或腹瀉，是我國沿海地區(qū)重要的食源性致病菌。它的致病性作用在于可以產生多種溶血毒素，它們是耐熱溶血毒素(thermostable direc themolysin，TDH)、耐熱溶血毒素相關溶血毒素(TDH-related hemolysin，TRH)、不耐熱溶血毒素(thermolabile hemolysin，TLH)[1]。而流行病學研究表明，臨床上分離出的致病性副溶血弧菌中95%都含有TDH，即神奈川(kangawa phenomenon，KP)陽性，而環(huán)境株則絕大多數為KP陰性[2]。目前，副溶血弧菌的檢測手段主要有分離培養(yǎng)技術、聚合酶鏈式反應技術(polymerase chain reaction，PCR)、免疫學方法等[3]。常規(guī)的分離培養(yǎng)操作繁瑣、周期較長、檢出率較低；PCR方法雖然具有特異、敏感等特點，但其程序復雜，需要精密儀器與設備，不利于推廣應用[4-7]；其中免疫學方法應用最多的是ELISA技術[8]。本研究擬利用副溶血弧菌的主要致病因子TDH作為抗原，制作特異性免疫血清作為抗體，并在此基礎上利用Western 斑點印跡法技術檢測致病性副溶血弧菌。因此在檢測過程中只會對分泌TDH的致病性副溶血弧菌敏感，而對環(huán)境中非致病性副溶血弧菌不敏感、特異性更強、操作簡單，試為致病性副溶血弧菌的檢測提供一種簡單有效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

日本大耳兔 上海斯萊克動物實驗中心；Balb/c小鼠 上海西普爾-必凱動物實驗中心。致病性副溶血弧菌ATCC 33846(標準菌株) 中國科學院生物研究所；非致病性副溶血弧菌F188(從南美白對蝦分離出，只含TLH不含TDH，通過生理生化試驗和PCR分析，確定為非致病性副溶血弧菌)由上海海洋大學食品安全實驗室贈送。

福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、OPD、HRP標記的兔抗鼠IgG 上海Sigma貿易有限公司；硝酸纖維素(NC)膜 Wolkman公司；牛血清蛋白(BSA) 上海日初生物公司。

恒溫培養(yǎng)箱 上?；厶﹥x器制造有限公司；真空泵上海滬西儀器分析廠有限公司；孔板振蕩儀 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；680型酶標儀 BioRad公司。

1.2 抗原TDH的制備

1.2.1 TDH的提取與純化

37℃條件下對致病性副溶血弧菌ATCC 33846進行搖床擴大培養(yǎng)16h，8000r/min離心去掉菌體，硫酸銨鹽析提取粗蛋白，然后依次經過DEAE-纖維素、DEAESephadex A-50、葡聚糖G-75層析純化TDH[9-10]，冷凍干燥純化后的TDH，準確稱量，溶解于少量pH7.4 0.01mol/L的PBS中。

1.2.2 TDH溶血活性及耐熱性的測定

靜脈取新鮮兔血0.43mL與20.0mL的PBS(+)混合制作紅細胞懸液。在V形96孔板上每空加入100μL紅細胞懸液，20μL純化后的TDH，放入恒溫培養(yǎng)箱在37℃條件下培養(yǎng)24h，觀察溶血現(xiàn)象，底部沒有紅細胞即產生了溶血。同時，將少量TDH水浴100℃加熱10min，然后用同樣方法測定加熱后的TDH是否還具有溶血活性，判斷純化后的TDH的耐熱性。

1.2.3 TDH變性溫度與純度的測定

利用差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry，DSC)來測量TDH的變性溫度與純度；加樣量為4.5000mg，溫度設定范圍為25～125℃，時間為10min[11]。

1.3 特異性抗TDH免疫血清的制備

1.3.1 免疫動物

同時免疫4只8周齡雄性Balb/c小鼠，取純化后的TDH 10μg與福氏完全佐劑充分混合乳化首次免疫，分別3周后取5μg TDH與福氏不完全佐劑混合乳化2次、3次免疫小鼠。

1.3.2 抗血清的效價測定與抗血清的制作

最后一次免疫3d之后間接ELISA方法測其效價，選擇效價在1:10000以上的小鼠斷尾取血，與室溫條件下放置1h，之后放于4℃冰箱中靜止4h，3000r/min離心10min用移液器將血清吸出，分裝于無色聚丙烯冷凍管中，放于－80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 使用Western斑點印跡法檢測致病性副溶血弧菌操作程序

1.4.1 硝酸纖維素膜的預處理

剪取適當大小的硝酸纖維素膜，在蒸餾水中浸泡15min，取出后甩干，于37℃條件下干燥15min。再以轉移緩沖液(40mmol/L Tris-HCl、0. 037%十二烷基磺酸鈉(SDS)、20%甲醇、39mmol/L甘油) 浸泡30min以上，濾紙同步處理，用直徑4～6mm的打孔器于膜的麻面間隔壓印[12]。

1.4.2 點樣

將濾紙和膜放于點樣器上, 膜在濾紙上面，依次加入待測樣品，每孔10μL負壓抽干。

1.4.3 封閉

將已點樣的膜浸入含5% BSA的封閉液中, 于37℃條件下孵育60min，期間搖動3～4次。取出后用PBST (0.01mol/L，pH7.4，含體積分數0.05%的Tween-20)漂洗3次，每次3min，每次洗滌中間搖動數次。

1.4.4 與血清抗體

將膜浸入工作濃度的特異性抗血清血清，于37℃條件下孵育60min，期間搖動3～4次。取出后用PBST漂洗3次，每次3min。

1.4.5 酶標抗體作用

將膜浸入兔抗鼠IgG酶標抗體溶液(1:3000稀釋)中于37℃條件下孵育60min，期間搖動3～4次。取出后用PBST漂洗3次，每次3min。

1.4.6 顯色

迅速將新配制好的OPD底物液滴加在膜上，盡量封閉于壓印環(huán)內，每環(huán)約10μL，輕輕振搖，于室溫條件下避光顯色20min，每膜滴加5μL 2mol/L H2SO4終止反應。

1.4.7 記錄結果

用冷的蒸餾水洗滌顯色后的NC膜，快速照相，最后用錫箔紙密封保存實驗結果。

1.5 抗體最佳工作濃度的確定

用封閉液將免疫血清從1:400(V/V，下同)遞倍稀釋到1:12800，進行棋盤實驗，吸附在NC膜上的抗原均為純化后的TDH，其他條件保持不變。

1.6 TDH免疫血清對致病性副溶血弧菌的特異性實驗

分別對副溶血弧菌ATCC 33846與副溶血弧菌F188進行進行液體搖床擴大培養(yǎng)15h，離心去掉菌體取上清作為待測樣品。同時設立陽性對照、陰性血清對照及空白對照(細菌培養(yǎng)基)，前兩者的吸附抗原為純化后的TDH，陽性對照、空白對照及兩種待測樣品的抗血清均為小鼠特異性抗TDH免疫血清。

2 結果與分析

2.1 抗原TDH的制作

2.1.1 TDH溶血活性及耐熱性的測定

純化后的T D H對兔紅細胞懸液具有敏感的溶血活性，水浴100℃加熱10min后仍保持溶血活性(圖1)。

圖1 溶血活性及耐熱性的測定Fig. 1 Determination of hemolysin activity and heat resistance

2.1.2 TDH的純度與變性溫度

本次實驗首次引用DSC方法來檢測TDH的純度與變性溫度，整條曲線只有一個波峰，結果表明，經過3次層析后的TDH的純度較高，并且測得TDH的變性溫度為94.17℃(圖2)。

圖2 TDH的DSC曲線Fig.2 Differential scanning calorimetry curve of TDH

2.2 特異性抗TDH的免疫血清制作

2.2.1 動物免疫

本實驗中的TDH具有溶血活性和致死性，因此，免疫小鼠的抗原劑量要嚴格控制，否則會致死小鼠，同時免疫間隔周期為3周，周期過短也會導致小鼠死亡。

2.2.2 效價測定

由于TDH的分子質量為46kD的蛋白質[13]，因此具有較強的免疫原性，4只小鼠都產生了較好的血清抗體效價(表1)。

表1 間接ELISA測定4只小鼠的抗體效價結果Table1 Antibody titer determined by indirect ELISA

2.3 最佳工作濃度的確定

根據棋盤原理，從試驗結果中選出斑點顯色清晰、深淺適宜的抗體稀釋度作為最佳工作濃度。經測定，特異性抗血清的最佳工作濃度為1:3200(圖3)。

圖3 抗體最佳工作濃度的確定Fig.3 Determination of optimal working concentration for antibodies

2.4 對致病性副溶血弧菌與非致病性副溶血弧菌的敏感性

圖4 Western斑點印跡檢測致病性副溶血弧菌Fig.4 Detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticu by Western blotting

圖5 Western斑點印跡檢測非致病性副溶血弧菌Fig.5 Detection of non-pathogenic Vibrio parahaemolyticu by Western blotting

由于本實驗中制備的小鼠血清是特異性抗TDH免疫血清，只對致病性副溶血弧菌敏感，而對非致病性副溶血弧菌不敏感。從圖4看到，當檢測致病性副溶血弧菌的培養(yǎng)菌液時，由于在NC膜上吸附著TDH，因此在NC膜上顯色最后呈現(xiàn)明顯的橘紅色的斑點；而非致病性副溶血弧菌的菌液、空白對照及陰性血清在膜上無明顯斑點，顯示陰性(圖5)。

3 討 論

目前應用在檢測副溶血弧菌免疫學的方法主要是用菌體本身做抗原免疫動物，得到多克隆抗體，而且在免疫動物之前需要對副溶血弧菌進行滅活制作免疫苗[14]。而本實驗利用多種層析提取純化副溶血弧菌的主要致病毒素TDH，將純化后的具有活性的TDH作為抗原免疫動物從而得到特異性抗血清，操作簡單；同時，由于TDH為大分子蛋白，具有較強的免疫原性，整個免疫周期只需3次免疫效價就能達到1:10000，因此在抗血清的制作方面效率更高。

根據Wester斑點印跡原理，將TDH作為檢測對象，敏感性更強，特異性更高。本實驗制作的TDH特異性抗血清可以特異性與吸附在硝酸纖維素膜上的TDH結合(假如待測樣品中含有TDH)，能有效地檢測致病性副溶血弧菌，而對非致病性副溶血弧菌不敏感。而現(xiàn)在的副溶血弧菌的免疫學檢測方法大多都是針對所有副溶血弧菌，包括環(huán)境中非致病性的副溶血弧菌，很少可以特異性檢測致病因子為TDH的致病性副溶血弧菌，因此此方法在檢測有TDH的致病性副溶血弧菌方面是其他方法無法比擬的。

實驗得到的最佳工作濃度為1:3200，一只小鼠斷尾取血所得的抗血清至少可以檢測300個樣品，大大超過了目前應用于檢測致病菌一般Dot-ELISA方法的工作濃度(1:200左右)[15]，效率更高，更加有效地檢測出致病性副溶血弧菌。

采用Western斑點印跡法技術檢測致病性副溶血弧菌只需7～9h，而且整個實驗過程簡便易行、特異性高、無需特殊儀器設備，用肉眼即可判斷實驗結果，適合在基層單位推廣，可為致病性副溶血弧菌的檢測提供一種簡單、快速、有效的方法。

[1]董雪, 李繼耀, 王冰, 等. 沈陽地區(qū)193份腹瀉患者副溶血弧菌感染情況分析[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2009, 19(4): 893-895.

[2]MYERS M L, PANIEKER G, BEJ A K. PCR detection of a newly emerged pandemic Vibrio parahaemolyticus 03: 06 pathogen in pure cultures and seeded waters from the gulf ofmexico[J]. Appl Environ Mierobiol, 2003, 69(4): 2194-2200.

[3]DOUET J P, CASTROVIEJO M, DODINT A, et al. Study of the haemolytic process and receptors of thermostable direct haemolysin from Vibrio parahaemolyticus[J]. Res Microbiol, 1996, 147: 678-696.

[4]楊芳, 李秀娟, 徐保紅. 副溶血弧菌的快速鑒定檢測方法研究進展[J]. 河北醫(yī)藥, 2010, 32(7): 862-865.

[5]葛菲菲, 徐鋒, 沈莉萍, 等. 副溶血性弧菌PCR檢測方法的建立[J].中國防獸醫(yī)學報, 2008, 30: 229-232.

[6]KIM Y B, OKUDA J, MATSUMOTO C, et al. Identification of Vibrio parahaemolyticus strains at the species level by PCR targeted to the toxR gene[J]. Journal of Clinical Microbiology, 1999, 37: 1173-1177.

[7]譚翰清, 萬成松. 副溶血性弧菌快速檢測研究進展[J]. 華南預防醫(yī)學, 2004, 30(1): 21-22.

[8]蔣燕群, 倪語星. 用斑點ELISA檢測副溶血弧菌的耐熱溶血毒(TDH)和TDH類似毒(TRH)[J]. 上海醫(yī)學檢驗雜志, 1997, 12(3): 143-144.

[9]HONDA T, TAGA S, TAKEDA T, et al. Identification of lethal toxin with the thermostable direct hemolysin produced by Vibrio parahaemolyticus, and some physicochemical properties of the purified toxin[J]. Infection and Immunity, 1976, 13(1): 133-139.

[10]趙永芳. 生物化學技術原理及應用[M]. 北京: 科學出版社, 2002.

[11]黃曉毅, 韓劍眾, 王彥波, 等. 差示掃描量熱技術DSC在肉類研究中的應用進展[J]. 食品工業(yè)科技, 2009, 30(6): 353-356.

[12]何驍生, 潘秋萍, 鄔堂春, 等. Western斑點印跡法檢測主要熱應激蛋白[J]. 監(jiān)測與檢驗技術, 1996, 14(6): 376-377.

[13]HONDA T, NI Yuxin, MIWATANI T. Purification and characterization of a hemolysin produced by a clinical isolate of kanagawa phenomenonnegative Vibrio parahaemolyticus and related to the thermostable direct hemolysin[J]. Infection and Immunity, 1988, 56(4): 961-965.

[14]竇勇, 寧喜斌. 副溶血弧菌多克隆抗體的制備及其特性分析[J]. 食品與生物技術學報, 2007, 26(3): 85-89.

[15]臧紅梅, 樊景鳳, 王斌. 應用斑點ELISA技術檢測副溶血弧菌[J]. 大連水產學報, 2006, 21(1): 79-82.

Detection of Pathogenic Vibrio parahaemolyticus by Western Blotting

YANG Jing-ya，ZHANG Jian，ZHAO Yong，TAO Yan，LU Xiao-fan，CHAO Ruo-yu
(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

Objective: To purify thermostable direct hemolysin (TDH) from the culture of Vibrio Parahaemolyticus and to establish western blotting method for determining pathogenic Vibrio parahaemolyticus. Methods: The specific anti-serum was obtained from immune mice using TDH. The working concentration of serum samples was determined by chessboard assay. The specificities of pathogenic Vibrio parahaemolyticus and non-pathogenic Vibrio parahaemolyticus were also determined. Results: The working concentration of serum samples was 1:3200. The samples with clear dots were judged as the positive reaction. V. parahaemolyticus was positive in pathogenic Vibrio parahaemolyticus, while non-pathogenic Vibrio parahaemolyticus was negative. Conclusion: Western blotting can be used to detect pathogenic Vibrio parahaemolyticus with the characteristics of high sensitivity, simple operation and eye-observable results.

TDH；Western blotting；pathogenic Vibrio parahaemolyticu；detection

R446.61

A

1002-6630(2010)20-0413-04

2010-06-29

上海市教育委員會科研創(chuàng)新項目(09YZ265)；上海市教育委員會重點學科建設項目(J50704)

楊靖亞(1976—)，女，副教授，博士，研究方向為海洋生物資源綜合利用與海洋藥物的開發(fā)、腫瘤藥理學。E-mail：jyyong@shou.edu.cn