廉慧鋒，趙笑天，王蓉珍，宋 歡，林勤保,*

(1.山西出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，山西 太原 030024；2.山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，山西 太原 030006；3.山西省分析測(cè)試中心，山西 太原 030006)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定玉米、花生、麥仁中的9種真菌毒素

廉慧鋒1，趙笑天2，王蓉珍3，宋 歡1，林勤保2,*

(1.山西出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，山西 太原 030024；2.山西大學(xué)應(yīng)用化學(xué)研究所，山西 太原 030006；3.山西省分析測(cè)試中心，山西 太原 030006)

建立玉米、花生、麥仁中9種真菌毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜確證方法。樣品用甲醇-水溶液和磷酸緩沖液(PBS)雙重提取后直接過(guò)真菌毒素免疫親和柱凈化；氮?dú)獯蹈珊笥玫囊译?水溶液(50:50，V/V)定容，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS-MS)測(cè)定，電噴霧正、負(fù)離子(ESI+、ESI－)多反應(yīng)模式監(jiān)測(cè)。結(jié)果表明，樣品中真菌毒素在0.1～400μg/kg范圍內(nèi)時(shí)與其峰面積呈良好線性關(guān)系，定量限為0.1～20μg/kg，3個(gè)加標(biāo)水平下平均回收率為59.5%～118.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～12.8%，符合痕量分析的要求。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；真菌毒素；玉米；花生；麥仁

真菌毒素(mycotoxin)是一類(lèi)由真菌產(chǎn)生的具有毒性的二次代謝產(chǎn)物。它廣泛污染農(nóng)作物、食品及飼料等植物源性產(chǎn)品[1]。目前已知的有300多種，其中有相當(dāng)多的一部分真菌毒素具有較強(qiáng)的致癌和致畸性。在糧食、食品和飼料中比較常見(jiàn)的真菌毒素有：黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)、赭曲霉毒素(ochratoxin，OT)、伏馬菌素(f u m o n i s i n，F(xiàn) B)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，又稱(chēng)嘔吐毒素，DON)、T-2毒素、HT-2毒素、展青霉素(patulin)等，研究證實(shí)，真菌毒素可以引起人類(lèi)和動(dòng)物的急性或慢性中毒，可損害機(jī)體的肝臟、腎臟、神經(jīng)組織、造血組織及皮膚組織等，事實(shí)上，許多真菌毒素的毒性作用是多器官性的，即可同時(shí)損害兩個(gè)以上的器官和組織[2]。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織估計(jì)，全球每年約有25%的農(nóng)作物遭受真菌及其毒素污染，約有2%的農(nóng)作物因污染嚴(yán)重而失去營(yíng)養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。據(jù)估算，全球每年因真菌毒素污染而造成的直接及間接損失將達(dá)到數(shù)百億美元[3]。目前真菌毒素已經(jīng)構(gòu)成重要的食品安全問(wèn)題，市場(chǎng)上銷(xiāo)售的糧食(玉米、小麥)類(lèi)、花生及其制品類(lèi)以及一些調(diào)味品[4]等受真菌毒素污染的情況已經(jīng)不容忽視。

目前真菌毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法(TLC)[5]、免疫化學(xué)分析方法(包括酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)[6]、免疫親和層析法[7]和放射免疫法[8])、氣相色譜法(GC)[9]、高效液相色譜法(HPLC)[10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11]等。薄層色譜法是我國(guó)及其他許多國(guó)家的標(biāo)準(zhǔn)方法，但有操作比較繁瑣、需要的有機(jī)溶劑較多、熟練的技巧不好掌握、準(zhǔn)確度低、費(fèi)時(shí)、誤差大等缺點(diǎn)。免疫化學(xué)分析方法具有特異性高、敏感性強(qiáng)、快速方便、不需要昂貴儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，但檢測(cè)結(jié)果易出現(xiàn)假陽(yáng)性，氣相色譜法和高效液相色譜法通常都需要進(jìn)行衍生后再用熒光檢測(cè)器檢測(cè)，操作繁雜，不適合多種真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合了色譜、質(zhì)譜兩者的優(yōu)點(diǎn)，具有高速、高效、高分辨、微量檢測(cè)及分析自動(dòng)化的性能和技術(shù)優(yōu)勢(shì)，可同時(shí)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，且檢出限低、靈敏度高，對(duì)于同時(shí)測(cè)定多種真菌毒素是一種較好的確證方法。本實(shí)驗(yàn)建立擬以甲醇/水溶液和磷酸緩沖液(PBS)雙重提取，Myco6in1TM免疫親和柱凈化，同時(shí)測(cè)定玉米、花生、小麥中9種真菌毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)確證方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米、花生、麥仁 市售。

甲醇(色譜純) 美國(guó)Burdick & Jackson公司；乙腈(色譜純) 美國(guó)Fisher公司；甲苯、乙酸、氯化鉀、磷酸二氫鉀(以上為分析純)、鹽酸(優(yōu)級(jí)純) 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酸銨(分析純) 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；甲酸(色譜純) 德國(guó)Fluka公司；磷酸氫二鈉(分析純) 天津市科盟化工工貿(mào)有限公司；氯化鈉(分析純) 北京化工廠；氫氧化鈉(分析純) 天津市天力化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品(純度為98%)(4種黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、伏馬菌素B1、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、T-2毒素、HT-2毒素) 中國(guó)北京中檢維康技術(shù)有限公司。真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品信息Table1 Information of mycotoxin standards

1.2 儀器與設(shè)備

AcquityTMUPLC超高效液相色譜儀、AcquityTMTQD串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)器 美國(guó)Waters公司；S900H Elmasonic超聲波清洗器 德國(guó)Elma公司；HA-180M電子天平 日本A&D公司；Barnstead Vortex Maxi MixⅡ振蕩器 美國(guó)Iowa公司；Reacti-ThermTMHeating Module氮吹儀 美國(guó)Pierce公司；超純水制備儀 美國(guó)Millipore公司；5810 R離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；SCINO CT410粉碎機(jī) 中國(guó)福斯公司；玻璃微纖維濾紙、Myco6in1TM真菌毒素免疫親和凈化柱 美國(guó)Vicam公司。

1.3 溶液的配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取適量黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標(biāo)準(zhǔn)品，以甲苯-乙腈(99:1，V/V)溶解并配成質(zhì)量濃度為100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于2～8℃條件下保存。

赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取適量赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品，以甲苯-乙酸(99:1，V/V)溶解并配成質(zhì)量濃度為100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于2～8℃條件下保存。

伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取適量伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，以乙腈-水(1:1，V/V)溶解并配成質(zhì)量濃度為100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于2～8℃條件下保存。

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱(chēng)取適量嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品，以乙腈溶解并配成質(zhì)量濃度為100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于2～8℃條件下保存。

T-2毒素：稱(chēng)取適量T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品，以乙腈溶解并配成質(zhì)量濃度為100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于2～8℃條件下保存。

HT-2毒素：稱(chēng)取適量HT-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品，以乙腈溶解并配成質(zhì)量濃度為100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于2～8℃條件下保存。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

各取適量配制好的上述各毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液烘干后再用甲醇重新溶解配成質(zhì)量濃度分別為黃曲霉毒素B150μg/L、黃曲霉毒素B2500μg/L、黃曲霉毒素G1500μg/L、黃曲霉毒素G2500μg/L、赭曲霉毒A 250μg/L、伏馬毒素B12500μg/L、嘔吐毒素10000μg/L、T-2毒素500μg/L和HT-2毒素500μg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，用于添加回收實(shí)驗(yàn)和制備標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，4℃條件下避光保存。

1.3.3 磷酸緩沖液PBS(pH7.4)的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.20g KCl、0.20g KH2PO4、2.92g Na2HPO4·12H2O和8.00g NaCl，用900mL超純水溶解，然后用0.1mol/L HCl或1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值到7.4。

1.3.410 mmol/L乙酸銨溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.385g乙酸銨，用水溶解并轉(zhuǎn)移至500mL容量瓶中，加2.5mL甲酸，用水定容至刻度。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取5g試樣置于具塞塑料離心管中，加入PBS溶液25mL，超聲振蕩15min后4000r/min離心10min。從上層溶液中取出17.5mL PBS溶液收集于干凈的容器，通過(guò)微纖維濾紙過(guò)濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液A)。向下層固體樣品中加入17.5mL甲醇，超聲振蕩15min后4000r/min離心10min，取上層溶液10mL用90mL PBS溶液稀釋?zhuān)ㄟ^(guò)微纖維濾紙過(guò)濾，將濾液收集于干凈的容器(提取液B)。

1.4.2 Myco6in1TM免疫親和柱凈化

將免疫親和柱連接于10mL塑料針筒下，準(zhǔn)確移取50mL提取液B過(guò)免疫親和柱，以1～2滴/s的流速全部通過(guò)親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱；將20mL PBS溶液以1～2滴/s的流速通過(guò)親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱；準(zhǔn)確移取5mL提取液A以1～2滴/s的流速全部通過(guò)親和柱，直至空氣流經(jīng)親和柱；將20mL超純水以1～2滴/s的流速淋洗柱子，直至空氣流經(jīng)親和柱，棄去全部流出液。將1.5mL甲醇以1滴/s的流速淋洗親和柱，將淋洗液收集于玻璃試管中，當(dāng)甲醇大部分過(guò)柱后，不要完全過(guò)柱，停止加壓，靜置5min，再將1.5mL甲醇以1滴/s的流速淋洗親和柱，將全部淋洗液收集于同一玻璃試管中。

1.4.3 定容

將上述收集于玻璃試管中的淋洗液在50℃氮?dú)庀麓蹈?，加?00μL乙腈-水溶液(50:50，V/V)(相當(dāng)于1g樣品)，充分渦旋混合后過(guò)0.22μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.5 色譜-質(zhì)譜條件

1.5.1 超高效液相色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(100mm× 2.1mm，1.7μm)；流動(dòng)相：乙腈和含有0.5%甲酸的10mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫(表2)；流速：0.4mL/ m i n；進(jìn)樣量：5μL；柱溫：3 5℃。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table2 Gradient elution procedure

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧電離正離子模式(ESI+)和負(fù)離子模式(ESI－)；質(zhì)譜掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；毛細(xì)管電壓：3.5kV(ESI+)、2.7KV(ESI－)；去溶劑氣溫度：350℃；錐孔反吹氣流速：50L/h；去溶劑氣流速：500L/h；離子源溫度：110℃；碰撞氣壓力：3.2×103mbar。各真菌毒素的質(zhì)譜條件列于表3。

表3 9種真菌毒素的質(zhì)譜條件Table3 MS/MS conditions for mycotoxins

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 方法的定量限

通過(guò)實(shí)際進(jìn)樣真菌毒素的混標(biāo)，根據(jù)RSN≥10計(jì)算得出本方法定量限為黃曲霉毒素B1為0.1μg/kg，B2、G1、G2為1μg/kg，赭曲霉毒素A為0.5μg/kg，伏馬毒素B1為5μg/kg，嘔吐毒素為20μg/kg，T-2毒素為1μg/kg，HT-2毒素為1μg/kg。9種真菌毒素在測(cè)定方法定量限時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 9種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of mycotoxin standard solutions

2.1.2 方法的線性范圍

表4 各種真菌毒素的線性關(guān)系Table4 Mycotoxin standard curves and their figures of merit

在本方法所確定的實(shí)驗(yàn)條件下，用乙腈-水溶液(50:50，V/V)將配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成1、2、5、10、20倍的測(cè)定方法定量限濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行測(cè)定，以峰面積(y)對(duì)相應(yīng)真菌毒素的濃度(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(表4)，結(jié)果表明0.1～400μg/kg范圍內(nèi)時(shí)與其峰面積呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.99以上。

2.1.3 方法的回收率和精密度

表5 方法的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table5 Results of recovery and precision tests (n=6)

本方法采用不含以上9種真菌毒素的玉米、麥仁、花生為空白樣品基質(zhì)，進(jìn)行3個(gè)水平的添加回收實(shí)驗(yàn)，3個(gè)添加量分別為1倍、2倍和10倍的各真菌毒素的測(cè)定方法定量限，每個(gè)濃度水平進(jìn)行6次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，分析并測(cè)定其精密度及回收率(表5)，3個(gè)加標(biāo)水平下平均回收率為59.5%～118.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～12.8%，符合痕量分析的要求。

2.2 提取方法的優(yōu)化

在優(yōu)化提取實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，采用回收率實(shí)驗(yàn)比較單個(gè)提取(用PBS溶液或70%甲醇溶液)和雙重提取(先用PBS溶液提取，再用70%甲醇溶液提取，合并兩份提取液)的效果，表明雙重提取更為充分徹底，能得到較高的回收率，尤其是個(gè)別幾種真菌毒素，需要雙重提取來(lái)完善提取過(guò)程(表6)。

表6 用PBS溶液或70%甲醇溶液分別提取和雙重提取回收率比較Table6 Comparison on recovery rates for mycotoxins from a spiked sample extracted with PBS solution, 70% methanol and both of them

2.3 液相分離條件的優(yōu)化

由于電噴霧質(zhì)譜的電離是在溶液狀態(tài)電離，因此流動(dòng)相的組成不但影響目標(biāo)化合物的保留時(shí)間和峰形，還會(huì)影響到目標(biāo)化合物的離子化效率，從而影響靈敏度。選擇體積分?jǐn)?shù)0.1%乙酸、乙酸銨濃度10mmol/L混和溶液和乙腈、體積分?jǐn)?shù)0.5%甲酸、乙酸銨濃度10mmol/L混和溶液和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，以體積分?jǐn)?shù)0.5%甲酸、乙酸銨濃度10mmol/L和乙腈為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)化合物的峰形最好，響應(yīng)最高。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用自動(dòng)進(jìn)樣，分別對(duì)9種真菌毒素的質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行了全掃描，選擇每種真菌毒素合適的離子模式、錐孔電壓及適當(dāng)?shù)姆肿与x子峰，此外，對(duì)不同目標(biāo)化合物的碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化。

2.5 定容溶液的選擇

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用一般采用流動(dòng)相定容上機(jī)，所以本實(shí)驗(yàn)分別采用10mmol/L的乙酸銨溶液和乙腈-水(50: 50，V/V)定容上機(jī)，結(jié)果顯示：乙腈-水(50:50，V/V)定容效果明顯高于10mmol/L的乙酸銨水溶液定容，用乙腈-水(50:50，V/V)定容使得目標(biāo)離子的峰面積較高，可能是因?yàn)?0mmol/L的乙酸銨溶液中水的比例較大導(dǎo)致目標(biāo)物不溶。而如果僅使用乙腈定容，可能導(dǎo)致部分目標(biāo)物在水相比例較大時(shí)在色譜柱內(nèi)析出，影響色譜柱及質(zhì)譜壽命?；诖?，本實(shí)驗(yàn)最終選擇采用乙腈-水(50: 50，V/V)溶液定容上機(jī)檢測(cè)。

3 結(jié) 論

本方法建立同時(shí)檢測(cè)確證玉米、花生、麥仁中9種真菌毒素含量的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。樣品經(jīng)甲醇-水溶液和磷酸緩沖液(PBS)雙重提取，免疫親和柱凈化有效去除樣品中的干擾后，以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)確證。結(jié)果表明：該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，適用于玉米、花生、麥仁中9種真菌毒素含量的同時(shí)檢測(cè)，也可為其他基質(zhì)中多種真菌毒素含量的同時(shí)檢測(cè)提供參考。

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Simultaneous Determination of 9 Kinds of Mycotoxins in Maize, Peanut and Wheat by Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LIAN Hui-feng1，ZHAO Xiao-tian2，WANG Rong-zhen3，SONG Huan1，LIN Qin-bao2,*
(1. Shanxi Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Taiyuan 030024, China；2. Institute of Applied Chemistry, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；3. Shanxi Analyse and Test Center, Taiyuan 030006, China)

A simultaneous determination method for nine kinds of mycotoxins in maize, peanut and wheat was developed using ultra-high performance liquid chromatography-tendem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). Samples were sequentially extracted with PBS solution followed by 70% methanol, and then the extracts were pooled and cleaned up with immunoaffinity column, followed by blowing to dryness under nitrogen gas stream, reconstitution with acetonitrile/water mixture before the analysis on UPLC-MS/MS. The MS conditions used were negative (ESI+) and positive (ESI－) electrospray ionization and MRM models. The results indicated as follows: 1) all the nine kinds of mycotoxins had good linear relationship with peak area over the range from 0.1 to 400μg/kg, and the detection limits for them ranged from 0.1 to 20μg/kg; and 2) The average recovery rates in the above three matrices spike at three levels were between 59.5% and 118.8%, with a relative standard deviation (RSD) varying from 2.4% to 12.8%. This analytical method meets the requirements for trace assays. In addition, it is simple, rapid, accurate and suitable for the simultaneous determination of nine kinds of mycotoxins in maize, peanut and wheat.

UPLC-MS/MS；mycotoxin；maize；peanut；wheat

TS201.6

A

1002-6630(2010)20-0360-07

2010-06-22

山西省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(20100311067)

廉慧鋒(1971—)，男，高級(jí)獸醫(yī)師，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物及其產(chǎn)品的檢疫、食品安全。E-mail：lianhuifeng0309@163.com

*通信作者：林勤保(1968—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)。E-mail：qblin@sxu.edu.cn